劉香來 劉繼微 李海川 李明利

（1.河北省廊坊市中醫(yī)醫(yī)院，河北 廊坊 065000 2.河北省廊坊愛德堡醫(yī)院，河北 廊坊 065000；3.河北省邯鄲市第一醫(yī)院，河北 邯鄲 056000）

有研究表明，細胞凋亡一旦發(fā)生紊亂就會引發(fā)人類多種疾病，肺癌也不例外，肺癌細胞的異常凋亡一直被認為是肺癌持續(xù)發(fā)展的必要因素［1-3］。近年來研究發(fā)現，肺癌患者通常免疫功能低下，且這類患者極易發(fā)生癌細胞轉移，故可推測肺癌的發(fā)生及轉移與患者機體免疫功能低下存在一定關系，因此如何提高免疫功能已經成為目前醫(yī)學領域關注的焦點之一［4］。腫瘤標志物是反映腫瘤存在的化學類物質，其存在或量變可以提示腫瘤的性質，繼而了解腫瘤的組織發(fā)生、細胞分化、細胞功能，故對腫瘤標志物進行檢測是腫瘤的診斷、分類、預后判斷以及治療指導的重要指標［5］。目前在治療肺癌方面現代醫(yī)學占據主導地位，如手術治療、分子靶向、放化療、免疫治療等，其中放射治療是中晚期肺癌首選和最主要的治療方法［6］。近年來，中藥以其獨特的優(yōu)勢已成為開發(fā)治療癌癥藥物的重要途徑之一，其中“化痰散結法”是中醫(yī)藥治療惡性腫瘤的重要方法，由此制成的化痰散結方具有健脾益氣、扶正祛邪、化痰散結之功效，可多方位、多靶點、多步驟地抑制腫瘤生長，并阻止腫瘤的侵襲和轉移，最終達到抗腫瘤的目的［7］。因此，本文就消痰散結方聯合放療對肺癌大鼠癌細胞凋亡、免疫功能及腫瘤標志物影響進行研究探討，為臨床治療提供新的思路及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SPF級SD雄性大鼠，由廣州弗爾博生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（粵）2020-0058，體質量200～250g。大鼠單籠喂養(yǎng)，室溫生長，模仿12 h晝夜交替，在常溫下進行無菌自由進食、飲水2周，按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。

1.2 試藥及儀器

消痰散結方（制半夏20 g，蒼術、神曲、白術、香附、夏枯草、太子參、僵蠶、白芥子、白附子各10 g，浙貝母、魚腥草、瓜蔞各20 g，陳皮、炙甘草各6 g），制備為生藥含量約為5.35 g/mL的煎劑備用。碘化油（貨號：H37022398，煙臺魯銀藥業(yè)有限公司）；3-甲基膽蒽（貨號：30050029，深圳海思安有限公司）；二乙基亞硝胺（貨號：YJ-P222710，上海一基有限公司）；蘇木素染液（貨號：H9627，美國Sigma公司）；伊紅染液（貨號：AG1100-100 mL，上海吉至有限公司）。光學顯微鏡（型號：CX-60，日本OLYMPUS公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KFS197-EGF，北京百奧萊博有限公司）；DAPI染色液（貨號：FT21949yy，上海梵態(tài)有限公司）；CD3+細胞檢測試劑盒（貨號：J20180312，南京百奧有限公司）；CD4+細胞檢測試劑盒（貨號：J20171103，南京百奧有限公司）；CD8+細胞檢測試劑盒（貨號：J20180506，南京百奧有限公司）；NKT細胞檢測試劑盒（貨號：J11030071，北京同立海源有限公司）；流式細胞儀（型號：BD FACSCantoⅡ，上海遠耀有限公司）；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：446502，美國 R＆D公司）。

1.3 模型制備

隨機選取50只大鼠，禁食12 h后，肌肉注射5萬U青霉素鈉及50 mg鏈霉素以預防肺部感染。腹腔注射40 mg/kg 3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定好后將注射器插入肺葉支氣管并緩慢注入0.1 mL致癌碘化油（含3-甲基膽蒽5 mg及二乙基亞硝胺0.01 mL），用高分辨率數字小動物X線機進行胸部影像學檢查，當觀察到肺部腫物形成時，則視為建模成功，造模過程中大鼠死亡6只，其余均建模成功。

1.4 分組與給藥［8］

選取建模成功的大鼠40只，隨機分為模型組、中藥組、放療組、消痰散結方聯合放療組，每組10只。剩余10只健康大鼠作為正常組。根據人與大鼠換算比計算，中藥組每只大鼠灌胃4 mL消痰散結方煎劑，每天1次，共28 d。同時，放療組采用高能直線加速器，在200 cGy/min的固定劑量下進行6 MV-X射線放射治療，2 d 1次，共28 d。聯合組給予消痰散結方聯合放療治療，方法與中藥組和放療組相同，給藥后24 h進行放射治療。正常組、模型組每日給予同體積生理鹽水灌胃。

1.5 標本采集與檢測

給藥結束24 h后，稱重后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，采集肺部動脈血，然后取雙肺及腫瘤組織。肺血離心后取上清液于冰箱中密封保存。雙肺用4%的多聚甲醛固定96 h，生理鹽水漂洗干凈，放入冰箱中密封保存。腫瘤組織稱重，稱重后對其長徑及短徑進行測量，按照公式［（長徑×短徑2）÷2］計算瘤體體積。

1.5.1 肺病理組織HE染色 取各組右肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、復水后進行HE染色，染色完成后除去多余染液，進行脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片處理，在光學顯微鏡下隨機選取3個視野進行組織病理學觀察。

1.5.2 末端脫氧核苷酸標記法（TUNEL）檢測癌細胞凋亡 取各組左肺組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟后，將切片置于3%過氧化氫中浸泡10 min，PBS洗滌3次，加入蛋白酶K后進行室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，然后緩沖液標記2 h，封閉液封閉30 min，甩掉封閉液后，加入稀釋的生物素化抗地高辛抗體（1∶100），在37℃溫育箱中反應30 min，加入稀釋的SABC-FITC抗體（1∶100），在37℃溫育箱中反應30 min，PBS洗滌4次后，用DAPI染色液進行染色，染色完成后用抗熒光衰減封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察，黃綠色熒光顆粒在細胞核中的為凋亡細胞，隨機選擇5個視野下的細胞計算凋亡率，凋亡率=凋亡細胞數÷總細胞數×100%。

1.5.3 流式細胞儀檢測血清免疫功能相關指標 取大鼠血清，加入10 μL CD3+、10 μL CD4+、10 μL CD8+、10 μL NKT抗體和50 μL EDTA抗凝血，震蕩混合均勻后溫室避光孵育20 min，加入2 mL溶血素孵育20 min，在1 400 r/min的條件下離心7 min，棄掉上清液，加入2 mL的PBS再次離心7 min，棄掉上清液，加2 mL PBS重懸混勻，上流式細胞儀機帶軟件分析CD3+、CD4+、CD8+和NKT，用自帶軟件區(qū)分不同細胞，顯示細胞含量，并計算各細胞的百分比。

1.5.4 ELISA法檢測血清腫瘤標志物水平 取各組大鼠血清，檢測癌胚抗原（CEA）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）、糖類抗原125（CA125）等腫瘤標志物水平，實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。實驗完成后，立即用酶標儀在波長450 nm處測定每孔吸光度，計算血清中CEA、NSE、CA125含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism8.0對各組大鼠癌細胞凋亡、免疫功能及腫瘤標志物相關指標進行統(tǒng)計分析，組間進行t檢驗、多組間比較采用單因素方差分析，描述以（）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、腫瘤質量、腫瘤體積比較

見表1。與正常組相比，模型組體質量顯著降低（P＜0.05），腫瘤質量、腫瘤體積顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，中藥組體質量明顯升高（P＜0.05），腫瘤質量、腫瘤體積顯著降低（P＜0.05）；與中藥組相比，放療組體質量、腫瘤質量、腫瘤體積無明顯差異（P＞0.05）；與放療組和中藥組相比，聯合組體質量明顯升高（P＜0.05），腫瘤質量、腫瘤體積顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量、腫瘤質量、腫瘤體積比較（±s）

表1 各組大鼠體質量、腫瘤質量、腫瘤體積比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05；與聯合組比較，△P＜0.05。下同。

組別正常組模型組中藥組放療組聯合組n 10 10 10 10 10體質量（g）239.66±10.99 164.33±9.74*195.25±10.08*#△195.67±10.01*#△229.59±10.31*#腫瘤質量（mg）0 105.88±5.12*90.44±5.01*#△90.60±5.03*#△74.32±4.86*#腫瘤體積（cm3）0 1.25±0.02*0.74±0.02*#△0.75±0.03*#△0.33±0.02*#

2.2 各組HE染色結果

正常組肺組織結構、肺泡正常完整，排列整齊，間質均勻且無充血。模型組可見肺泡囊明顯擴張，肺間質明顯增厚，纖毛上皮細胞出現明顯破損，可見大量炎性細胞及癌細胞浸潤，核仁明顯，排列紊亂并伴有腺樣或乳頭狀結構。與模型組比較，中藥組、放療組、聯合組病理結構明顯改善，炎性細胞及癌細胞明減少。

2.3 各組大鼠癌細胞凋亡情況比較

正常組未見癌細胞，其余組均出現癌細胞，模型組、中藥組、放療組、聯合組的細胞凋亡率分別為（5.33±1.02）%、（20.67±2.69）%、（20.69±2.71）%、（33.47±3.50）%（P＜0.01）。與模型組相比，中藥組癌細胞凋亡明顯升高（P＜0.05）；與中藥組相比，放療組癌細胞凋亡無明顯差異（P＞0.05）；與放療組和中藥組相比，聯合組癌細胞凋亡明顯升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織癌細胞凋亡熒光圖（200倍）

2.4 各組大鼠血清免疫功能指標比較

見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清CD3+、CD4+細胞含量顯著降低（P＜0.05），CD8+、NKT細胞含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、放療組、聯合組大鼠血清CD3+、CD4+細胞含量顯著升高（P＜0.05），CD8+、NKT細胞含量顯著降低（P＜0.05），且放療組與中藥組相比基本無差異（P＞0.05），聯合組比放療組、中藥組變化顯著（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清CD3+、CD4+、CD8+、NKT細胞含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清CD3+、CD4+、CD8+、NKT細胞含量比較（±s）

組別正常組模型組中藥組放療組聯合組n 10 10 10 10 10 CD3+69.55±3.01 40.26±2.59*52.25±2.78*#△52.33±2.81*#△63.39±2.86*#CD4+45.78±2.21 30.88±1.58*35.66±1.74*#△35.64±1.75*#△42.18±2.01*#CD8+23.74±1.14 35.25±2.02*30.47±1.79*#△30.49±1.81*#△25.33±1.55*#NKT 2.47±0.27 4.25±0.52*3.66±0.41*#△3.64±0.42*#△2.69±0.31*#

2.5 各組大鼠血清腫瘤標志物表達水平比較

見表3。與正常組比較，模型組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、放療組、聯合組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平顯著降低（P＜0.05），且放療組與中藥組相比基本無差異（P＞0.05），聯合組比放療組、中藥組降低顯著（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清CEA、NSE、CA125水平比較（±s）

組別正常組模型組中藥組放療組聯合組n 10 10 10 10 10 CEA（ng/mL）30.66±2.89 240.26±8.59*149.51±6.77*#△149.55±6.78*#△80.39±4.54*#NSE（ng/mL）55.85±4.26 530.94±12.58*195.66±8.74*#△195.68±8.76*#△96.44±6.01*#CA125（μg/mL）45.69±3.88 335.25±12.02*140.47±8.79*#△140.45±8.81*#△71.28±5.06*#

3 討 論

近年來，肺癌的發(fā)病率及死亡率正在以世界性趨勢增長，已經被列為重點防治癌癥之一，因此探尋一種有效的治療手段對提高患者生存率將具有深遠意義［9］。本文就消痰散結方聯合放療對肺癌大鼠癌細胞凋亡、免疫功能及腫瘤標志物影響進行研究探討，為中西醫(yī)結合防治惡性腫瘤提供新的思路和方法。

本研究發(fā)現，消痰散結方聯合放療可顯著提高大鼠體質量，抑制腫瘤生長，并改善大鼠肺組織病理形態(tài)，促進癌細胞凋亡。對許多癌癥患者而言，放射治療是必須的治療方法，但其副作用明顯。研究表明放療與中藥聯合使用可以降低放療副作用的影響［10］。消痰散結方是我院根據多年臨床經驗改進而成的中藥抗癌新藥，本方合于病機，章法分明，各種藥物配伍合理，具有扶正固本、邪去正安、燥濕化痰、消痞散結、通絡止痛之功效，且其在抗腫瘤方面已得到證實［11］。肺癌在中醫(yī)中屬于“肺積”“痰飲”等范疇，主要由邪毒侵肺、正七虛損、痰瘀內積所致，故治療應以健脾益氣、扶正祛邪以及化痰散結為主［12］。對于肺癌大鼠，放療可直接殺傷癌細胞從而到達治療的目的，消痰散結方則主要通過扶正祛邪、化痰散結等功效來中和放療的毒副作用，促進血液循環(huán)，從而抑制腫瘤血管的生成、抑制黏附分子表達等，進而促進凋亡相關通路的激活，最終達到抑制腫瘤生長、促進癌細胞凋亡的目的。王朔等［13］研究表明，對于肺癌細胞，冬凌草乙素聯合放療具有協同作用，與單純放療相比，更能促進癌細胞凋亡，這與本文結果類似。

免疫功能是指機體對疾病的抵抗力，其可抵抗和清除病原微生物或其他異物，并清除損傷或衰老的細胞以維持機體的生理平衡，同時其還可以識別和清除體內出現的突變細胞，防止腫瘤的發(fā)生，故如何提高機體免疫功能一直是肺癌專家關注的焦點及熱點［14］。本研究表明，消痰散結方聯合放療可顯著大鼠免疫功能。CD3+、CD4+、CD8+、NKT細胞是機體重要的免疫細胞，研究表明，其在人體內對腫瘤起著非常重要的免疫作用，故檢測其數量的變化可有效反映機體免疫功能水平［15］。而對于肺癌大鼠，消痰散結方聯合放療可能是通過促進腫瘤細胞的凋亡，來增強單核吞噬細胞對碳粒的吞噬功能以及體液免疫功能，從而加強血液和淋巴循環(huán)以及離子的運轉、減弱腫瘤細胞免疫抑制效應，進而有效改善機體免疫狀態(tài)，最終改善大鼠免疫功能。陳稀煩等［16］研究發(fā)現，肺癌大鼠CD3+、CD4+細胞含量顯著降低，CD8+、NKT細胞含量顯著升高，治療后其含量明顯改善，說明大鼠免疫功能顯著改善，這與本文結果類似。

本文研究發(fā)現，消痰散結方聯合放療可顯著降低腫瘤標志物水平。眾所周知，血清腫瘤標志物檢測是腫瘤早期篩查、臨床診斷和判斷預后的重要指標，其簡便、有效、易行，故近年來越來越受到各方面的關注［17］。而CEA、NSE、CA125是肺癌最常檢測的腫瘤標志物，其給肺癌臨床早期診斷、病理分期、組織學分型、療效監(jiān)測和預后評估方面帶來了很大價值［18-19］。而對于肺癌大鼠，消痰散結方聯合放療可能是通過內治和外治相結合來調控相關信號通路的表達，從而減少或抑制腫瘤周圍炎性分泌物的產生、抑制腫瘤細胞增殖和運動活性、抑制內皮活性因子的分泌等，進而達到抑制腫瘤生長、阻斷腫瘤復發(fā)和轉移的目的，最終促使血清腫瘤標志物降低。李明利等［20］研究發(fā)現，對于肺癌患者，化痰逐瘀散結湯/消痰散結方聯合放化療具有顯著療效，可顯著提高肺癌緩解率，并降低患者血清腫瘤標志物水平，這與本文結果類似。

綜上所述，消痰散結方聯合放療可顯著促進肺癌大鼠癌細胞凋亡，提高其免疫功能，并降低腫瘤標志物的水平。