張 銘 董愛愛 冀雨芳 崔依依 李盼麗 郭繼龍△

（1.山西中醫(yī)藥大學分子中醫(yī)藥學國家級國際聯(lián)合研究中心，山西 太原 030024；2.山西中醫(yī)藥大學中醫(yī)腦病學山西省重點實驗室，山西 太原 030024；3.河北省保定市第一中醫(yī)院，河北 保定 071000）

近年來隨著生產(chǎn)生活水平的逐步提高、人口老齡化速度的逐漸加快，人們生存壓力不斷增大，飲食、作息時間不規(guī)律，且大量攝入高脂、高鹽、高糖飲食又缺少鍛煉，導致我國被診斷為原發(fā)性高血壓的患者逐年增加。長期血壓的增高使人的情緒易激動，行為習慣、日?；顒影l(fā)生改變。隨著高血壓的發(fā)生、發(fā)展，會產(chǎn)生一系列嚴重并發(fā)癥，如心腦血管疾病、腎臟病變等［1］，不僅給人們的日常生活造成嚴重的影響，而且長期服藥會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔。臨床報道中醫(yī)針刺有良好的降壓作用［2］。韓玉慧等［3］通過計量分析發(fā)現(xiàn)針刺治療自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）效果顯著，為針刺治療原發(fā)性高血壓方面提供了參考?；谡n題組對全國名老中醫(yī)冀來喜的腧穴“降壓方”的針刺研究［4］，筆者采用SHR模型，探討針刺腧穴“降壓方”是否通過影響血管緊張素轉化酶（ACE）-血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）-血管緊張素Ⅱ受體1（AT1R）軸及前纖維蛋白-1（Profilin-1）來實現(xiàn)降壓?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取30只體質(zhì)量250～290 g的12周齡清潔級雄性SHR，選取15只同周齡、同性別、相似體質(zhì)量的清潔級WKR，實驗中所用大鼠全部購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學動物實驗室。在適宜的環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周，溫度22～25℃，相對濕度45%～65%，通風、光照良好，室內(nèi)清潔安靜。所有大鼠均自由攝食、飲水，飲水瓶每日均予以消毒更換。大鼠墊料每3日更換1次。飼養(yǎng)和操作符合山西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（泰盟有限公司，BP-600A），一次性無菌針灸針（北京太和醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.22 mm×25 mm）；超級恒溫水浴箱（成都泰盟軟件公司，型號：HW-500），高速臺式離心機（安徽中科中佳科學儀器公司，型號：HC-3018），病理切片機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用公司，型號：YGQ-3），石蠟包埋機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用公司，型號：YB-6LF），生物顯微鏡（重慶市澳浦光電公司，型號：UB102i）；不同濃度酒精（貨號：G1114）、復合消化液（貨號：G1006）、PBS緩沖液（貨號：G1006）、二甲苯（貨號：G1114）、二抗羊抗兔IgG-HRP（貨號：814）均購自Servicebio；AngⅡ ELISA試劑盒（貨號：EK0585）、ACE ELISA試劑盒（貨號：EK0585）；SABC免疫組化染色試劑盒（貨號：EK0585）；DAB底物顯色試劑盒（貨號：EK0585）均購自BOSTER。

1.3 分組與干預

將30只SHR按隨機數(shù)字表法分為模型組15只、針刺組15只，另外15只WKR作為正常對照組，并編號標記。針刺組針刺腧穴“降壓方”：人迎穴、曲池穴、足三里穴（雙側）。取穴：人迎穴［兩側下頜骨髁突連線下（8.00±0.30）mm，前正中線旁開（5.50±0.40）mm］［5］，直刺（5.00±0.20）mm；曲池穴［橈骨近端的關節(jié)外側前方凹陷中］［6］，直刺（4.00±0.50）mm；足三里穴［位于后腿外側，略低于膝蓋，脛骨嵴的外側中間，約在脛骨和腓骨腹側肌肉的中間部位，在腓骨小頭下約5 mm處］［6］，直刺（7.00±0.50）mm。模型組隨意在大鼠軀干部位針刺，針刺手法和針刺組相同。對照組無針刺干預，其他操作和另外兩組相同。實驗中留針30 min，每間隔10 min行針1次，輕微提插捻轉，每次1 min。周一至周六每天干預1次，周日休息進行測血壓、記錄行為變化，持續(xù)4周。

1.4 觀察指標

1.4.1 血壓 采用尾壓測量法：在適宜的環(huán)境中使大鼠尾動脈充分擴張，于大鼠安靜狀態(tài)下應用BP-600A泰盟全自動無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測量。如果測量過程中出現(xiàn)大鼠活動使血壓波形紊亂，需要重新測量，最終血壓值是在大鼠穩(wěn)定狀態(tài)下連續(xù)測量3次求取的平均值。血壓測量均在周日12∶00～16∶00進行。

1.4.2 行為變化 由3位課題組成員分別對實驗中的所有大鼠進行打分和記錄，最后對3組的記分結果進行統(tǒng)計分析。一般行為觀察：毛色光澤、攝食量、飲水量、二便形態(tài)等，每日觀察并做記錄。易激惹程度［7］：1分為捉拿頸部時尖叫、驚跳；2分為捉持頸部時憤怒、欲咬人；3分為提拿尾部時即出現(xiàn)尖叫、驚跳，甚至欲傷人或同籠大鼠頻繁撕咬，或啃咬鼠籠。上述情況不明顯者為0分，每周測量血壓時記錄。

1.4.3 AngⅡ、ACE含量 針刺結束后禁食給水，麻醉下行腹主動脈取血5 mL，將血清放置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，用塑料離心管分裝，按照ELISA試劑說明書方法測定大鼠血清中AngⅡ、ACE的含量。

1.4.4 AT1R、Profilin-1表達 剪取約0.5cm胸主動脈放入包埋框中，清水沖洗后乙醇脫水，二甲苯透明后浸蠟、包埋、切片。二甲苯脫蠟后，H2O2滅活內(nèi)源性酶、消化液抗原修復，5%BSA封閉孵育盒，滴加稀釋的一抗（AT1R配置比例為1∶100 PBS液；Profilin-1配置比例為1∶500 PBS液）。在4℃環(huán)境中過夜后滴加生物素標記羊抗兔IgG，常溫放置30 min后擦去多余液體，滴加SABC，DAB顯色。在顯微鏡400倍鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表現(xiàn)，運用Image-ProPlus6.0系統(tǒng)圖像對圖片進行統(tǒng)計處理，隨機選取5個視野測定每張切片的平均光密度值（IOD）。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件處理。正態(tài)分布的計量資料以（）表示，采用單因素方差分析；等級資料采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠不同時間血壓變化的比較

見表1。針刺前與對照組相比，模型組、針刺組收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組和針刺組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺1周后，與針刺相比，模型組血壓有所升高，針刺組血壓有所下降，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；針刺組與模型組相比，SBP及DBP均稍有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。針刺2周后，與針刺前及針刺1周后相比，模型組SBP及DBP逐漸上升，針刺組SBP及DBP逐漸下降，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；針刺組與模型組相比，SBP及DBP均呈現(xiàn)顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針刺3周及4周后，針刺組與模型組相比，SBP及DBP均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點SBP、DBP水平比較（kPa，±s）

表1 各組大鼠不同時間點SBP、DBP水平比較（kPa，±s）

注：與對照組同時期比較，*P＜0.05；與模型組同時期比較，△P＜0.05。下同。

組別對照組（n=15）模型組（n=15）針刺組（n=15）時間針刺前第1周第2周第3周第4周針刺前第1周第2周第3周第4周針刺前第1周第2周第3周第4周SBP 16.89±2.52 16.62±2.32 16.91±2.66 16.60±2.92 16.226±2.56 24.91±1.77*25.12±1.98*25.34±1.93*25.65±1.99*25.84±1.82*25.17±1.81*23.78±2.70*23.07±2.58*△21.12±2.80*△19.28±3.01*△DBP 13.04±1.98 12.76±2.05 12.91±1.99 12.61±1.88 12.23±2.43 19.72±2.21*19.79±2.63*19.98±2.05*20.19±1.87*20.39±1.81*19.85±2.48*19.39±2.90*18.51±2.44*△17.67±2.27*△16.53±2.08*△

2.2 各組大鼠行為變化的比較

見表2。對照組大鼠狀態(tài)較好，表現(xiàn)為毛色有光澤鮮亮，攝食、飲水量充足，淡黃色小便，顆粒狀大便軟硬適中。模型組大鼠毛色暗淡無光澤，攝食、飲水量減少，掉毛較多，小便顏色較深且量少，大便稀薄或不能成形，量少。針刺組大鼠毛色欠光澤，但掉毛較模型組少，且攝食、飲水量較模型組增加，二便基本同對照組。實驗前，模型組和針刺組大鼠警惕、應激狀態(tài)明顯，同籠間經(jīng)常有打斗、撕咬現(xiàn)象，評分高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；針刺組和模型組易激惹程度相當，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在實驗過程中，模型組大鼠持續(xù)表現(xiàn)為應激、狂躁、易激惹狀態(tài)，啃咬鼠籠、雙后肢站立和同籠大鼠間打斗等現(xiàn)象，并可見外抓傷。針刺組大鼠在針刺前和針刺1周時，與模型組表現(xiàn)相似，針刺時掙脫現(xiàn)象明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；針刺2周后，順從性好轉，激惹程度下降，與其他兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；從第3至4周結束時，激惹程度持續(xù)下降，與同期模型組評分相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠易激惹程度評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠易激惹程度評分比較（分，±s）

組別對照組模型組針刺組n 15 15 15針刺前0.79±0.25 1.60±0.36*1.66±0.27*第1周0.82±0.27 1.73±0.38*1.71±0.35*第2周0.85±0.27 1.78±0.42*1.57±0.37*第3周1.02±0.39 1.82±0.36*1.21±0.28△第4周0.93±0.32 1.79±0.43*1.02±0.33△

2.3 各組大鼠血清中AngⅡ、ACE含量比較

見表3。針刺4周后，模型組與對照組相比，ACE、AngⅡ含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；針刺組較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠針刺4周后血清AngⅡ、ACE含量比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠針刺4周后血清AngⅡ、ACE含量比較（pg/mL，±s）

組別對照組模型組針刺組n 15 15 15 ACE 15.98±6.45 55.21±7.58*30.90±6.04△AngⅡ96.21±18.78 221.28±31.84*177.38±26.64△

2.4 各組大鼠主動脈組織中AT1R、Profiin-1表達比較

見表4、圖1。針刺4周后，模型組與對照組相比，AT1R、Profiin-1陽性表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；針刺組陽性表達較模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠主動脈AT1R、Profilin-1免疫組化（400倍）

表4 各組大鼠主動脈組織AT1R及Profilin-1的表達比較（±s）

表4 各組大鼠主動脈組織AT1R及Profilin-1的表達比較（±s）

組別對照組模型組針刺組n 15 15 15 AT1R 0.35±0.03 0.87±0.08*0.68±0.05△Profilin-1 0.27±0.03 0.72±0.08*0.53±0.04△

3 討論

原發(fā)性高血壓的病名在中醫(yī)古籍中沒有相關記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于“頭痛病”“眩暈病”等，在臨床應用中針刺治療高血壓的取穴多集中于多氣多血的手足陽明經(jīng)上。實驗前筆者對冀來喜教授的腧穴“降壓方”組成進行資料查詢發(fā)現(xiàn)，人迎穴、足三里穴、曲池穴單穴降壓效果明確：針刺人迎穴降壓的機制可能與其周圍有豐富的神經(jīng)分布有關，進而影響神經(jīng)信號傳導來達到降壓目的［8］。張紅星等［9］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)針刺曲池穴降壓起效時間明顯早于舌下含服硝苯地平片；針刺足三里穴可抑制交感神經(jīng)興奮性而發(fā)揮其降壓作用［10］。關于針刺降壓腧穴處方，以石學敏院士的“活血散風，疏肝健脾”降壓針刺法降壓療效確切，又可減輕靶器官的損害，為臨床針刺降壓提供依據(jù)［11］，并兼有潛在抗焦慮、抗抑郁而達到降壓目的的作用［12］，體現(xiàn)了中醫(yī)針刺的整體調(diào)節(jié)作用。

本實驗研究表明針刺1周時，模型組血壓較針刺前升高，針刺組血壓較針刺前有所下降，說明針刺腧穴“降壓方”可以降低血壓；在針刺2周后，模型組SBP及DBP持續(xù)上升，針刺組血壓逐漸下降且兩組相比針刺組SBP及DBP均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明連續(xù)針刺腧穴“降壓方”可使血壓持續(xù)降低；針刺第3、4周后，針刺組與模型組相比，SBP及DBP均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從上述結果可以看出連續(xù)針刺腧穴“降壓方”可在第2周后平穩(wěn)持續(xù)降低SHR的血壓。針刺過程中一般行為觀察結果表明：針刺前模型組、針刺組、對照組3組相比，模型組和針刺組較對照組表現(xiàn)出明顯的警惕、應激狀態(tài)，且同籠中經(jīng)常有打斗、撕咬等現(xiàn)象，毛色光澤度、攝食、飲水量也有明顯差異。針刺組在針刺前和針刺1周后，與模型組表現(xiàn)相似，無明顯區(qū)別；針刺組針刺2周后，順從性好轉，激惹程度下降；針刺結束時，針刺組激惹程度明顯下降，與模型組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明模型組出現(xiàn)了易激惹程度高的病理行為改變。以上結果表明針刺腧穴“降壓方”可以改善高血壓一般行為特征。激惹程度增高是SHR交感亢進的病理行為學表征。屈會化等［7］研究顯示，高血壓治療的療效可以從SHR宏觀表征和行為學改變更全面的反映出來。張志國等［13］通過SHR動物實驗研究表明，長期血壓控制不佳易引起腦組織損傷，造成認知功能障礙，并可引起行為改變。這些均與本實驗研究結果一致。

原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制目前尚未完全明了，其中ACE、AngⅡ參與的對血壓調(diào)節(jié)有關鍵性作用［14］的RAAS是高血壓的主要發(fā)病機制之一。血壓的升高與RAAS的激活有直接關系，其中在心血管和血壓調(diào)節(jié)中起關鍵作用的ACE-AngⅡ-AT1R軸是RAAS的經(jīng)典途徑。近年來實驗已證明RAAS系統(tǒng)中的核心活性肽AngⅡ在自發(fā)性高血壓大鼠血壓變化的病理生理過程中有重要意義［15］，隨著AngⅡ含量的增加血壓也在升高，AngⅡ的含量取決于ACE及其受體AT1R。對比本實驗各組大鼠的AngⅡ含量，發(fā)現(xiàn)針刺4周后，針刺組與模型組相比有顯著差異，這說明針刺腧穴“降壓方”的降壓機制與AngⅡ密切相關。廣泛分布于體內(nèi)的激肽酶ACE通過轉化或降低酶活性使血漿和組織中的AngⅡ含量增加［16］，進而激活RAAS使血壓升高。本實驗中模型組的ACE含量較對照組明顯升高，針刺4周后，針刺組的ACE含量較模型組下降幅度明顯，說明針刺腧穴“降壓方”可能是通過降低ACE、AngⅡ含量，進而抑制了RAAS的活性，達到使血壓下降的目的。

現(xiàn)已證明AngⅡ的大部分生理病理過程是通過AngⅡ受體AT1介導，并且該亞型在AngⅡ誘導的血管功能中起到主要作用［17］。本實驗通過免疫組化方法檢驗各組大鼠AT1R的陽性表達，其中模型組較對照組棕黃色陽性表達十分明顯，說明AT1R在SHR主動脈中表達強烈，針刺4周后，針刺組較模型組棕黃色顆粒明顯減少，說明針刺腧穴“降壓方”是通過調(diào)節(jié)AngⅡ受體含量達到降壓的效果。在調(diào)節(jié)血管功能中起著重要作用的前纖維蛋白Profilin-1是一種小分子量的肌動蛋白的結合蛋白，從本實驗的結果可以看出模型組的陽性表達明顯增多，說明隨著血壓的升高，血管功能降低，在針刺4周后，針刺組較模型組陽性表達降低，說明針刺腧穴“降壓方”能夠影響血管功能。

本實驗所選用的動物模型是生長過程與人類原發(fā)性高血壓發(fā)展過程有很多相似之處的SHR，12周齡時的SHR出現(xiàn)外周阻力升高說明其存在小動脈硬化的病理損傷［18］，此時不僅需要降壓，還需要降低外周阻力，臨床高血壓也多處于此期。選用不具備高血壓特征且血壓穩(wěn)定與SHR同一品系的WKR作為正常對照組，通過觀察血壓及其行為的變化，分析評價針刺效果，實驗結果可為臨床應用提供依據(jù)。

本研究結果表明，針刺腧穴“降壓方”降壓效應明確，降壓機制可能是通過調(diào)節(jié)ACE-AngⅡ-AT1R軸及Profilin-1實現(xiàn)的。