蔡 婷 潘力弢 李蔣鳳 譚 亮 張 夢 李晶晶 樊光輝，3△

（1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430061；2.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055；3.深圳大學附屬華南醫(yī)院，廣東 深圳 518111）

動脈粥樣硬化是導致急性心腦血管危重癥的重要因素，嚴重威脅人類生命健康［1］。血管平滑肌細胞（VSMC）是血管中膜的主要細胞成分，在動脈粥樣硬化的形成中起重要作用［2］。當血管內(nèi)皮細胞受到損傷時，血管釋放炎性細胞因子和生長因子，誘導VSMC遷移、增殖和分化，導致內(nèi)膜增厚、斑塊形成和管腔狹窄［2-4］。三七是臨床常用的傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、消腫鎮(zhèn)痛、強壯補虛等功效。三七皂苷R1（Notoginsenoside R1）是三七提取物中有效活性成分之一，具有減輕炎癥、修復內(nèi)皮細胞障礙等作用，可減輕動脈粥樣硬化的進展［5-7］，然而，三七皂苷R1對VSMC遷移的影響尚不清楚。本研究觀察了三七皂苷R1對VSMC遷移的影響并初步探討了其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人源VSMC（貨號：MZ-1186）購自寧波明舟生物科技有限公司。用DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，DMEM完全培養(yǎng)基含有10%FBS、1%雙抗生素（青霉素/鏈霉素）、10 mmol/L HEPES和10 mmol/L TES。

1.2 試藥與儀器 三七皂苷R1（上海源葉生物技術(shù)有限公司，貨號：B21099），純度≥98%。AngⅡ（Med Chem Express公司，貨號：HY-13948）。DMEM培養(yǎng)基（貨號：11965118）和胎牛血清（貨號：10100147）購自Thermo Fisher Scientific公司。兔抗鼠MMP2（貨號：ab92536）、MMP9（貨號：ab76003）、phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（貨號：ab4822）和 GAPDH（貨號：ab181602）均購自Abcam公司，兔抗鼠p38 MAPK（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：AF7668）。鼠抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG抗體（Santa Cruz公司，貨號：sc-2357）。倒置顯微鏡（Olympus公司，型號：BX43）。

1.3 分組與干預 取對數(shù)生長期細胞，制備細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度為1×105/mL，均勻接種于6孔板中。參照課題組前期實驗及相關文獻選用1 μmol/L的AngⅡ誘導VSMC遷移，建立細胞遷移模型［8-10］。將發(fā)生遷移的VSMC隨機分組，用不同濃度（5、10、20 μmol/L）的三七皂苷R1干預48 h，分別記為三七皂苷R1低、中、高劑量組，未用藥物處理的則為對照組。

1.4 細胞劃痕實驗 當細胞處于峰-谷生長狀態(tài)時，用10 μL的無菌槍頭在每個6孔板中劃上3～5條平行橫線。無菌PBS清洗以除去不黏附的細胞，隨后按照各實驗組的要求處理細胞并培養(yǎng)48 h。用4%多聚甲醛固定細胞15 min，按照結(jié)晶紫染色步驟進行染色，用倒置顯微鏡觀察細胞傷口愈合情況。用Image J軟件計算各實驗組的相對遷移面積。

1.5 蛋白質(zhì)印跡實驗 按照各實驗組的要求處理細胞并培養(yǎng)48 h。用含有蛋白酶的RIPA裂解緩沖液在冰上裂解VSMC細胞收集總蛋白質(zhì)?？偟鞍踪|(zhì)經(jīng)BCA定量后，每孔上樣20 μg，用10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液在25℃下孵育膜1 h。然后用TBST洗滌膜，并與相應的抗體（1∶1 000稀釋）在4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，然后與HRP結(jié)合的二抗溶液（1∶5 000稀釋液）在25℃孵育1 h，TBST洗滌，曝光、顯影，用ImageJ軟件對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。組間差異比較采用單因素方差分析，然后采用LSD法進行檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組VSMC遷移面積的比較 見表1。三七皂苷R1對AngⅡ誘導的VSMC遷移有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比有顯著差異，見圖1。進一步用Image J軟件分析各組細胞遷移面積，與對照組相比，三七皂苷R1低、中、高劑量組能顯著減少VSMC遷移面積，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與低劑量組相比，中劑量組減少VSMC遷移面積不明顯，但高劑量組能顯著減少VSMC遷移面積，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組VSMC相對遷移面積比較（±s）

表1 各組VSMC相對遷移面積比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與三七皂苷R1低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 相對遷移面積（%）對照組三七皂苷R1低劑量組三七皂苷R1中劑量組三七皂苷R1高劑量組100.00±3.92 80.35±4.36*67.60±5.23*46.83±6.66**△

圖1 各組VSMC遷移情況（結(jié)晶紫染色，40倍）

2.2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表達的比較 見表2。三七皂苷R1使MMP2、MMP9和P-p38 MAPK蛋白表達減少，且與三七皂苷R1劑量呈負相關，p38 MAPK蛋白在各組中沒有變化，見圖2。用Image J分析蛋白條帶灰度值，與對照組相比，三七皂苷R1中劑量組和三七皂苷R1高劑量組的MMP2和MMP9蛋白條帶相對灰度值明顯減少，有顯著差異（P＜0.05）；p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值在各組中沒有任何變化（P＞0.05），但P-p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值隨著三七皂苷R1劑量增加而減少，中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與低劑量組比較，中、高劑量組的MMP2和MMP9蛋白條帶相對灰度值明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值各組均無變化；中劑量組的P-p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值減少，但差異不明顯；高劑量組的P-p38 MAPK蛋白條帶相對灰度值顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK蛋白表達

表2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表達比較（%，±s）

表2 各組MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表達比較（%，±s）

注：MMP2、MMP9和p38 MAPK數(shù)值均是其條帶灰度值相對內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的百分比值；P-p38 MAPK數(shù)值是其相對p38 MAPK條帶灰度值的百分比值。

組別MMP2MMP9p38 MAPK P-p38 MAPK對照組三七皂苷R1低劑量組三七皂苷R1中劑量組三七皂苷R1高劑量組126.56±3.74 107.93±3.07 61.60±2.15**△53.67±2.04**△△117.17±3.46 106.37±3.03 50.70±1.77**△△33.31±1.27**△△132.18±4.17 134.92±2.12 136.36±2.83 134.99±1.09 95.72±3.18 77.68±2.21 51.18±2.62*47.60±2.48**△△

3 討 論

動脈粥樣硬化是急性心腦血管疾病的病理基礎，也是急性心腦血管事件發(fā)生的重要危險因素。動脈粥樣硬化是現(xiàn)代醫(yī)學名，中醫(yī)學中并無其記載，但根據(jù)其致病特點和臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于“瘀證”“痰證”“脈痹”等范疇［11］，其累及的臟腑多為肝脾腎三臟，脾失運化，肝不條達，腎氣化失常，故津液輸布異常，聚液為痰，痰濁壅塞脈道，脈道不暢，氣血運行無力，導致血液凝滯，瘀血生成，痰濁與瘀血相互膠著，故脈道狹窄閉塞導致了一系列疾病。故痰濁、瘀血是動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的關鍵，痰瘀互結(jié)、損傷脈道是動脈粥樣硬化的重要病機［12-13］。

中藥三七歸肝、胃經(jīng)，性溫，味辛，具有活血化瘀、消腫定痛等功效。三七皂苷R1是從三七中提取的單體皂苷，具有保護心臟、改善缺血-再灌注血管損傷、抑制炎癥、抗動脈粥樣硬化等作用［14-17］，然而，其在抑制VSMC遷移中的作用尚不清楚。本實驗以三七皂苷R1低、中、高3種劑量干預遷移的VSMC細胞，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1低、中、高劑量組能顯著減少VSMC遷移面積，且與三七皂苷R1的劑量相關，說明三七皂苷R1對AngⅡ誘導的VSMC遷移有抑制作用，且這種抑制作用隨三七皂苷R1劑量的增加而增強。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在細胞遷移中起重要作用，是動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的生物標志物，其升高與動脈粥樣硬化導致的急性危重型心血管事件的發(fā)生風險呈正相關［18-19］。在本實驗中，與對照組比較，三七皂苷R1可抑制MMP2和MMP9的表達，且呈劑量依賴性。因此，三七皂苷R1具有抑制VSMC遷移從而阻止動脈粥樣硬化發(fā)展的潛力，然而其分子機制尚不明確，還有待進一步探討。p38 MAPK的活化與細胞遷移活動有關［20］，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，三七皂苷R1可降低磷酸化p38 MAPK蛋白的水平且與劑量相關，這說明三七皂苷R1抑制VSMC遷移可能與降低磷酸化p38 MAPK有關。

綜上所述，本研究提示三七皂苷R1抑制了AngⅡ誘導的VSMC遷移面積，同時下調(diào)MMP2和MMP9遷移蛋白，且呈劑量依賴性，其機制可能與降低p38 MAPK蛋白磷酸化有關，這些結(jié)果為三七皂苷R1靶向治療動脈粥樣硬化提供了新的治療思路。