錢(qián) 英，代 義，喻慧琳，格汝娜姆，趙婷婷

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，重慶 400016)

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為紅色斑塊、鱗屑和瘙癢。在銀屑病皮損部位角質(zhì)形成細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞、免疫細(xì)胞等串?dāng)_，形成炎癥的惡性循環(huán)。而白細(xì)胞介素-23(IL-23)/IL-17炎癥軸在驅(qū)動(dòng)銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)、外源性刺激(如遺傳因素和皮膚屏障破壞等)均會(huì)誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞等釋放IL-23，激活輔助性T淋巴細(xì)胞17分泌IL-17和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖并分泌其他炎癥介質(zhì)[1]。其中細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)參與了T淋巴細(xì)胞的激活、遷移、黏附和再激活，介導(dǎo)斑塊的形成和維持[2]。ICAM-1以可溶性ICAM-1(sICAM-1)在血清中被檢測(cè)到。sICAM-1不僅在一定程度上反映表皮中ICAM-1表達(dá)水平，且與病情嚴(yán)重程度及活動(dòng)度密切相關(guān)[3-4]。此外，銀屑病中的內(nèi)源性一氧化氮(NO)在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化及炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著復(fù)雜的雙相作用。低水平NO 誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，加重炎癥；高水平NO誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，有助于表皮屏障恢復(fù)[5]。因此，促進(jìn)NO釋放可能是減輕銀屑病炎癥及修復(fù)皮膚屏障的新方向。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，莪術(shù)油可作用于合成NO的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOs)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOs)，且含有莪術(shù)醇、β-欖香烯和吉馬酮等多種成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等生物活性[6-7]。其中β-欖香烯及相關(guān)衍生物可能通過(guò)激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/eNOs信號(hào)通路誘導(dǎo)NO釋放，改善內(nèi)皮功能障礙[8-9]。以β-欖香烯為母體化合物引入呋喃烷 NO 供體基團(tuán)開(kāi)發(fā)出的β-欖香烯雜合體，顯示出了顯著的抗腫瘤活性[10]。莪術(shù)油可能是作用于銀屑病的潛在NO供體，從而達(dá)到治療銀屑病的作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，莪術(shù)油外用治療銀屑病具有較好的療效，且不良反應(yīng)較小，適合銀屑病穩(wěn)定期患者長(zhǎng)期維持用藥，以預(yù)防皮損復(fù)發(fā)，但其降低銀屑病炎癥并抑制表皮增厚的作用機(jī)制尚不明確[11-12]。本研究通過(guò)建立咪喹莫特乳膏(IMQ)誘導(dǎo)的小鼠銀屑病皮損模型，初步探討了莪術(shù)油對(duì)銀屑病穩(wěn)定期小鼠血清ICAM-1、NO水平的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 BALB/c小鼠44只(雄性、體重18～25 g)，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(渝)2018-0003]，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷。莪術(shù)油購(gòu)于江西省吉水縣健民天然香料油廠，IMQ購(gòu)于四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，凡士林購(gòu)于聯(lián)合利華(中國(guó))有限公司，乳膏基質(zhì)為遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院自制，ICAM-1、NO酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自寧波舜宇儀器有限公司，KD-BM組織包埋機(jī)購(gòu)自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，Leica RM2255(徠卡)組織切片機(jī)購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司，MULTISKAN GO酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，均由重慶醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模、分組和給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1周后刮除背部絨毛，形成大小2 cm×3 cm暴露區(qū)域。將44只BALB/c小鼠隨機(jī)打上1～44號(hào)耳標(biāo)，采用計(jì)算機(jī)Excel表格函數(shù)生成44個(gè)隨機(jī)不重復(fù)整數(shù)。按照空白對(duì)照組、IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對(duì)照組、5%莪術(shù)油組和10%莪術(shù)油組的順序依次完成隨機(jī)分組，IMQ模型組12只，其余每組8只。隨機(jī)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后除空白對(duì)照組涂抹凡士林外，其余4組連續(xù)14 d每天于小鼠背部裸露皮膚涂抹5% IMQ 62.5 mg，于第7天開(kāi)始分別給予凡士林、乳膏基質(zhì)、5%莪術(shù)油、10%莪術(shù)油進(jìn)行治療，用量均為12.5 mg/cm2。

1.2.2皮損嚴(yán)重程度評(píng)估及取材 根據(jù)銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)，于第2、4、6、8、12、14天進(jìn)行評(píng)分，皮損紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)增厚程度均為0～4分，三者評(píng)分相加即為總評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)皮損計(jì)0分，輕度皮損計(jì)1分，中度皮損計(jì)2分，重度皮損計(jì)3分，極重度皮損計(jì)4分。給藥第8、11天隨機(jī)抽取2只IMQ模型組小鼠處死，余下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于第15天全部處死。眼球取血，2 000 r/min離心10 min，吸取上清液備用。同時(shí)，迅速剝離小鼠背部裸露皮膚組織，游標(biāo)卡尺測(cè)量皮膚厚度，每只小鼠取3個(gè)表皮位置進(jìn)行測(cè)量，取平均值，然后置于4%多聚甲醛中固定備用。剝離小鼠脾臟組織，觀察脾臟長(zhǎng)度并稱(chēng)重，計(jì)算脾指數(shù)(脾臟重量/體重)。評(píng)估莪術(shù)油抗銀屑病活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)圖1。

圖1 評(píng)估莪術(shù)油抗銀屑病活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)染色及組織病理觀察 皮膚組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水后包埋在石蠟中。使用HE染色對(duì)5 μm石蠟切片進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下評(píng)估銀屑病的組織病理學(xué)特征，包括過(guò)度角化、顆粒層變薄或消失、棘層肥厚、表皮波浪狀起伏并向真皮下延伸，以及皮脂腺增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。

1.2.4ELISA檢測(cè)血清ICAM-1、NO表達(dá) 使用ELISA法對(duì)各組小鼠血清ICAM-1、NO水平進(jìn)行定量分析，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)PASI評(píng)分比較 各組小鼠第0～8天均逐漸出現(xiàn)紅斑、浸潤(rùn)、鱗屑等。IMQ模型組小鼠第8～14天PASI評(píng)分出現(xiàn)下降，但仍明顯高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。乳膏基質(zhì)對(duì)照組、5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠PASI評(píng)分均高于IMQ模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：A.不同時(shí)間點(diǎn)PASI總分；B.治療后PASI總分；aP<0.05。

2.2各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)表皮厚度比較 IMQ模型組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)表皮厚度均明顯高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對(duì)照組、5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠表皮厚度均明顯高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IMQ模型組比較，5%莪術(shù)油組小鼠表皮厚度明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與乳膏基質(zhì)對(duì)照組比較，5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠表皮厚度均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

注：aP<0.05。

表1 各組小鼠表皮厚度比較

注：aP<0.05。

2.3各組小鼠皮膚組織病理學(xué)特征比較 與空白對(duì)照組比較，IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對(duì)照組、5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠均出現(xiàn)不同程度表皮增厚、角化過(guò)度、角化不全、顆粒層變薄、棘層肥厚、表皮突呈杵狀向真皮下延伸等。此外，皮脂腺增多，出現(xiàn)Munro微膿腫和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠皮膚組織病理學(xué)特征比較(HE染色，200×)

2.4各組小鼠脾腫大情況比較 與空白對(duì)照組比較，IMQ模型組小鼠脾臟大小和重量均明顯增加，且脾指數(shù)也增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IMQ模型組、乳膏基質(zhì)對(duì)照組比較，5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠脾臟大小和重量均明顯降低，且脾指數(shù)也降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖6、7。

表2 各組小鼠脾腫大情況比較

圖6 各組小鼠脾臟大小比較

2.5各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清ICAM-1、NO水平比較 IMQ模型組小鼠第0、8、11、15天血清ICAM-1、NO水平見(jiàn)表3、圖8。IMQ模型組小鼠血清ICAM-1、NO水平與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對(duì)照組、乳膏基質(zhì)對(duì)照組比較，5%莪術(shù)油組、10%莪術(shù)油組小鼠血清ICAM-1水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IMQ模型組比較，10%莪術(shù)油組小鼠血清ICAM-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，乳膏基質(zhì)對(duì)照組和5%莪術(shù)油組小鼠血清NO水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IMQ模型組比較，5%莪術(shù)油組小鼠血清NO水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖9。

注：aP<0.05。

表3 IMQ模型組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清ICAM-1、NO水平

圖8 IMQ模型組不同時(shí)間點(diǎn)血清ICAM-1、NO水平

表4 各組小鼠血清ICAM-1、NO水平比較

注：aP<0.05。

3 討 論

銀屑病是一種慢性炎癥疾病，分為急性發(fā)病期、穩(wěn)定期和消退期。IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型可模擬與人類(lèi)相似的銀屑病病程。在銀屑病急性發(fā)病期IMQ激活Toll樣受體7/8，通過(guò)IL-23/IL-17炎癥軸激活下游炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并招募中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞遷移至表皮[1]。而在銀屑病穩(wěn)定期，盡管局部炎性細(xì)胞因子，如IL-22和TNF-α短暫增加后降低，但表皮中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞與持續(xù)激活的轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)、STAT3，以及腺苷受體共同維持了穩(wěn)定期銀屑病局部皮損[13-14]。此外，IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病復(fù)發(fā)模型表明，即使肉眼觀察皮損消退，小鼠局部皮膚仍保留銀屑病的病理改變，病灶中浸潤(rùn)的記憶CD8+T淋巴細(xì)胞容易再次被IMQ激活而復(fù)發(fā)銀屑病[15]。

目前，銀屑病無(wú)法治愈，銀屑病患者需接受持續(xù)治療，以防止復(fù)發(fā)。急性模型不適合長(zhǎng)期治療藥物的研究。因此，本研究連續(xù)7 d涂抹IMQ誘導(dǎo)小鼠急性發(fā)病期銀屑病皮損，再通過(guò)維持劑量IMQ模擬慢性炎癥穩(wěn)定期，即第8～14天，以更好地模擬慢性銀屑病患者體內(nèi)的長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示，IMQ持續(xù)作用7 d誘發(fā)小鼠背部皮膚的紅斑、鱗屑和浸潤(rùn)，第8～14天IMQ模型組小鼠銀屑病皮損消退，但仍表現(xiàn)出嚴(yán)重的表皮組織病理學(xué)改變，以及脾指數(shù)的明顯增加。涂抹5%、10%莪術(shù)油乳膏治療后可明顯減少小鼠表皮厚度、減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脾臟腫大，而乳膏基質(zhì)對(duì)照組小鼠PASI評(píng)分仍高于IMQ模型組，可能是因?yàn)槿楦嗷|(zhì)對(duì)皮膚存在較輕微的刺激性。因此，推測(cè)PASI評(píng)分在IMQ誘導(dǎo)的銀屑病穩(wěn)定期小鼠模型中可能存在不準(zhǔn)確性，尤其是當(dāng)穩(wěn)定期IMQ模型組的肉眼造模效果下降時(shí)治療藥物對(duì)皮膚的不良反應(yīng)可能會(huì)干擾對(duì)藥物療效的評(píng)估。

本研究結(jié)果顯示，涂抹5%、10%莪術(shù)油乳膏治療后小鼠血清ICAM-1水平明顯低于空白對(duì)照組和IMQ模型組，提示莪術(shù)油可能具有較強(qiáng)抑制銀屑病病灶內(nèi)免疫細(xì)胞黏附的作用。而5%莪術(shù)油組小鼠血清NO水平明顯高于空白對(duì)照組和IMQ模型組，可能與莪術(shù)油作用于iNOs、eNOs有關(guān)。另外，乳膏基質(zhì)成分中常見(jiàn)的成分為石蠟，可激活多環(huán)芳烴芳香烴受體，誘導(dǎo)NO釋放。表明莪術(shù)油乳膏可能上調(diào)NO水平抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分化，逆轉(zhuǎn)低水平NO引發(fā)的炎性反應(yīng)。

急性期和緩解期銀屑病患者血清中均可檢測(cè)到顯著升高的sICAM-1[17]。在受到γ干擾素和TNF-α等炎性細(xì)胞因子刺激后角質(zhì)細(xì)胞及真皮層中微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的膜型ICAM-1會(huì)脫落釋放sICAM-1[18]。病灶中增高的基質(zhì)金屬蛋白酶-9切割 ICAM-1胞外域也會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放sICAM-1[19]。鑒于sICAM-1常被認(rèn)為是動(dòng)態(tài)觀測(cè)銀屑病療效及預(yù)后的炎癥標(biāo)志物，抑制其釋放可能是一種有效的抗銀屑病策略[20]。本研究結(jié)果顯示，莪術(shù)油明顯降低了血清ICAM-1水平，發(fā)揮了抗炎作用。此外，莪術(shù)油可能作為一種停用依法珠單抗(阻斷淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 α亞基CD11a與配體ICAM-1結(jié)合)后的過(guò)渡性治療藥物，持續(xù)靶向ICAM-1以阻止T淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞流入皮膚，進(jìn)而延長(zhǎng)緩解期，增強(qiáng)生物制劑的療效。

銀屑病局部皮損中核因子κB、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子等炎癥通路誘導(dǎo)iNOs表達(dá)[21-22]，但過(guò)表達(dá)精氨酸酶1與其競(jìng)爭(zhēng)底物L(fēng)-精氨酸，最終導(dǎo)致iNOs活性降低，產(chǎn)生較低水平的NO，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，并增加血管通透性，促進(jìn)炎癥介質(zhì)滲出[23]。另外，銀屑病局部病灶中缺氧、高氧化應(yīng)激、精氨酸酶活躍的微環(huán)境誘導(dǎo)eNOs解偶聯(lián)，產(chǎn)生超氧化物而不是NO，同樣會(huì)導(dǎo)致NO的生物利用度降低[24-26]。而較高水平NO則可抑制角質(zhì)形成增殖并促進(jìn)其正常的分化和凋亡，誘導(dǎo)角化包膜及絲聚蛋白表達(dá)，有助于表皮屏障穩(wěn)態(tài)恢復(fù)[5]。高水平NO還顯著抑制角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1[27]。此外，臨床使用局部NO供體顯著改善了銀屑病皮損的紅斑、脫屑等[28]。結(jié)合iNOs、eNOs對(duì)表皮滲透屏障潛在的正向調(diào)節(jié)作用[29-30]，本研究假設(shè)莪術(shù)油可能通過(guò)調(diào)控iNOs、eNOs上調(diào)血清NO水平，進(jìn)而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖并促進(jìn)其分化。

綜上所述，本研究證明了復(fù)方莪術(shù)油乳膏對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病穩(wěn)定期小鼠的治療作用。復(fù)方莪術(shù)油乳膏不僅下調(diào)血清ICAM-1水平，阻止免疫細(xì)胞遷移，而且誘導(dǎo)高水平NO抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖，最終降低銀屑病體內(nèi)炎癥水平和表皮厚度。