李屹 張際政 孫曉華 車津立 任萬陸

(天津醫(yī)院麻醉科，天津 300211)

炎性疼痛是常見的臨床癥狀，廣泛存在于各種急慢性疾病中。一般情況下，急性炎癥對于保護身體免受入侵的病原體及促進組織重塑和修復至關重要。持續(xù)6 w或更長時間的慢性炎癥是嚴重影響患者生活質(zhì)量的最常見不適之一，可導致組織損傷〔1〕。促炎介質(zhì)(如前列腺素、細胞因子、趨化因子、蛋白酶、神經(jīng)肽和生長因子)在炎癥部位釋放能夠使周圍的痛覺神經(jīng)元敏感。目前，非甾體抗炎藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥仍是臨床上常用的藥物，但近50%的患者會感到疼痛緩解不足、胃腸道不適和其他嚴重的副作用(如便秘、抑郁)〔2,3〕。因此，開發(fā)高效、低毒的鎮(zhèn)痛藥一直受到醫(yī)學界的關注。右美托咪定(Dex)是一種具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、輔助麻醉等作用的新一代高選擇性α2腎上腺素能受體(α2 AR)激動劑；是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的在重癥監(jiān)護病房(ICU)中對插管和機械通氣患者進行鎮(zhèn)靜的常用藥物〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，對2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大鼠慢性炎性內(nèi)臟痛表現(xiàn)較強的鎮(zhèn)痛作用〔5,6〕；研究發(fā)現(xiàn)Dex區(qū)域麻醉干預對術后鎮(zhèn)痛非常有用，可以減少對阿片類藥物的需求并提高術后患者的滿意度〔7〕。

嘌呤能P2X7已被證明在傷害性炎癥和神經(jīng)性疼痛的動物模型中起核心作用，在患有慢性傷害性和神經(jīng)性疼痛的患者外周血中可見P2X7明顯上調(diào)和白細胞介素(IL)-1β釋放增加〔8～10〕。動物研究也發(fā)現(xiàn)P2X7可通過激活VOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3/IL-1β信號通路，參與大鼠炎性痛的形成〔11〕。Dex可抑制P2X4和NLRP3的表達，減弱糖尿病性神經(jīng)性疼痛大鼠〔12〕；并可下調(diào)NLRP3的表達，降低IL-1β的釋放，抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥〔13〕。而Dex能否通過P2X7調(diào)控NLRP3/IL-1β減輕大鼠炎性痛還未可知，故本研究通過建立慢性炎性痛大鼠模型，探討Dex在該模型中對P2X7及NLRP3/IL-1β通路的影響，為Dex能否作為安全、高效的鎮(zhèn)痛藥提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級雄性SD大鼠66只，體重(180±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證為SCXK(京)2019-0009。將所有大鼠放在可控制的光照下保持12 h明暗交替，溫度(20±2)℃，相對濕度為45%～60%，可以自由獲取食物和水。研究已由機構動物護理和使用委員會批準，并遵循《實驗動物的護理和使用指南》。鹽酸Dex注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準字H20090248,2 ml:200 μg)；2′(3′)-O-(4-苯甲酰苯甲酰)腺苷5′-三磷酸三乙銨鹽(Bz-ATP，P2X7激動劑，≥93%，美國Sigma-Aldrich公司，CAS號：112898-15-4)；完全弗氏佐劑(CFA，P2036)、RIPA裂解液(P0013B)和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(P0012S)均購自碧云天生物科技公司；大鼠IL-1β(RA20020)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗P2X7(ab109054)、NLRP3(ab263899)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1(ab238972)、IL-1β(ab200478)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(ab9485)、羊抗兔IgG H&L辣根過氧化物酶(HRP)(ab205718)、小鼠抗神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN，ab104224)、Alexa Fluor 647標記的山羊抗兔IgG H&L(ab150079)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG H&L(ab6785)均購自英國abcam公司；BME-403 Von Frey、BME-410C全自動熱痛刺激儀均購自中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所；iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2模型制備 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。將60只大鼠隨機分為對照組、模型組、Dex低、高劑量組(10、20 μg/kg)〔12〕、Bz-ATP組(Dex 20 μg/kg+P2X7激動劑Bz-ATP 15 μg/kg)〔11〕，每組12只。1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，左后爪足底內(nèi)注射20 μl的CFA誘發(fā)炎癥性疼痛模型〔14〕。大鼠于建模前1 d、建模后即刻及建模后1、2、3 d進行腹腔注射給藥，對照組和模型組注射生理鹽水，Dex低、高劑量組分別注射相應劑量的Dex，Bz-ATP組在給予Dex的同時注射P2X7激動劑Bz-ATP(溶于無菌的0.9%生理鹽水中，并稀釋至所需濃度)，1次/d，注射體積為1 ml。

1.3行為學測試

1.3.1機械痛敏 在大鼠注射前1 d及給藥結束后30 min進行機械痛敏測定。實驗前將大鼠連續(xù)3 d放置在測試籠中30 min以適應測試環(huán)境，每次測試前，將大鼠放進測試籠中適應15 min，然后用電子Von Frey刺激針刺激大鼠左側足底，從1.0 g開始，逐漸增加纖毛折力，記錄出現(xiàn)抬足或舔足反射的最小刺激強度為機械縮足反射閾值(MWT)，每只大鼠測量5次，每次間隔5 min，計算其平均值。

1.3.2熱痛敏 分別用移動的熱輻射光源照射各組大鼠左側足底，大鼠快速抬足或舔足即停止照射，記錄熱輻射持續(xù)時間即縮足反射潛伏期(PWTL)，每只大鼠測量5次，每次間隔5 min，計算其平均值。為避免灼傷大鼠足底，刺激時間設置為15 s，若15 s內(nèi)大鼠對熱刺激無反應則記為15 s。

1.3.3ELISA檢測腦脊液IL-1β水平 行為學檢測結束后，使用戊巴比妥(80 mg/kg)深度麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，剪開枕骨嵴附近皮膚，使用微量進樣器穿過肌肉進入延髓池，緩慢抽取100 μl腦脊液，-80℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說明書的操作檢測腦脊液中IL-1β水平。

1.3.4免疫熒光檢測背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X7、NLRP3與NeuN的共表達 取腦脊液完成后處死大鼠，經(jīng)心灌注150 ml生理鹽水和400 ml 4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。分離L4～L6 DRG，每組隨機選取6只大鼠的樣本，在4%多聚甲醛中固定3 h，然后轉移至15%和30%的蔗糖進行脫水。OCT包埋后在冷凍低溫恒溫器上將DRG切成14 μm的切片。將切片用TBST(0.1%Tween-20)沖洗，并在37℃下用5%正常山羊血清封閉1 h。然后將切片與兔抗P2X7(1∶100)、NLRP3(1∶100)和小鼠抗NeuN(1∶200)于4℃孵育過夜。清洗后，與Alexa Fluor 647標記的山羊抗兔和FITC標記的山羊抗小鼠二抗IgG抗體(1∶200)進行第二次孵育2 h。4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育30 min，漂洗后使用熒光顯微鏡拍攝圖像。每張切片選擇四個區(qū)域，分別計算P2X7(紅色)與NeuN(綠色)、NLRP3(紅色)與NeuN(綠色)共表達的平均熒光強度(黃色)。

1.3.5Western印跡檢測DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達 每組剩余6只大鼠DRG加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測量組織裂解液中的蛋白濃度，變性后取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應的一抗(P2X7、NLRP3、Caspase、IL-1β 1∶1 000，GAPDH按1∶2 000比例稀釋)于4℃下孵育過夜，洗去一抗，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗去二坑，電化學發(fā)光(ECL)顯影，測量每個條帶的蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的條帶的相對表達水平。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0和Image-Pro Plus6.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1Dex對慢性炎性痛大鼠痛閾的影響 與建模前相比，建模后大鼠MWT、PWTL均顯著下降(P<0.05)；給藥結束后，與對照組相比，模型組MWT、PWTL顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組MWT、PWTL明顯升高(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)；見表1。

表1 各組痛閾、腦脊液中IL-1β水平及DRG中P2X7、NLRP3與NeuN共表達的比較

2.2Dex對慢性炎性痛大鼠腦脊液中IL-1β的影響 與對照組相比，模型組腦脊液中IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組IL-1β水平明顯降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；見表1。

2.3Dex對慢性炎性痛大鼠DRG中P2X7、NLRP3與NeuN共表達的影響 與對照組相比，模型組DRG中P2X7與NeuN、NLRP3與NeuN共表達均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組P2X7與NeuN、NLRP3與NeuN共表達明顯降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組P2X7與NeuN、NLRP3與NeuN共表達明顯升高(P<0.05)；見圖1、表1。

圖1 各組DRG中P2X7、NLRP3與NeuN共表達水平(免疫熒光染色，×400)

2.4Dex對慢性炎性痛大鼠DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達明顯降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達明顯升高(P<0.05)；見表2、圖2。

表2 各組DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達的比較

1～5：對照組，模型組，Dex低劑量組，Dex高劑量組，Bz-ATP組

3 討 論

慢性炎癥疼痛是全球性的健康問題，盡管其發(fā)病機制和調(diào)節(jié)因子方面取得了重大進展，但是當前的疼痛療法不能充分緩解慢性疼痛，尋找安全、高效的鎮(zhèn)痛藥仍然是研究的重點。促炎性細胞因子信號傳導是病理性疼痛發(fā)展不可或缺的部分，這些通信的調(diào)制可能是改善疼痛的關鍵〔15〕。Dex是新一代高選擇性α2 AR激動劑，具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛，抑制交感神經(jīng)，降低麻醉劑量，增加血液動力學穩(wěn)定性及提高術后識別能力等多種優(yōu)勢〔16〕。它的安全性和有效性及可為患者提供一定程度的舒適感的能力，使其成為臨床廣泛應用的麻醉佐劑〔17〕。近年來，隨著Dex臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該藥物在各種神經(jīng)痛〔18〕、術后疼痛和炎癥控制〔19〕中表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用，可降低患者血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β和C反應蛋白(CRP)水平，而且沒有嚴重的副作用。因此，Dex是一種有前途的新型高效且安全的鎮(zhèn)痛藥。

三磷酸腺苷(ATP)是在所有組織和細胞中普遍存在的分子，在生理和病理條件下均會釋放到細胞外環(huán)境中。ATP是感覺神經(jīng)節(jié)中釋放的主要遞質(zhì)，可激活嘌呤受體，嘌呤受體在外周(PNS)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中具有廣泛組織分布，參與炎癥和慢性疼痛的發(fā)病〔20〕。DRG中的嘌呤受體在促進細胞間通訊中起重要作用，特別是在疼痛信號傳遞方面。P2X7是ATP配體門控離子通道P2X受體家族的主要成員，在P2X家族中，P2X7具有ATP誘導激活的最高閾值，只有在細胞外ATP達到病理濃度時才會觸發(fā)下游機制。在DRG中神經(jīng)元可以通過ATP釋放和P2X7激活進行通訊，參與調(diào)節(jié)炎癥性和慢性疼痛〔21〕。IL-1β是第一種被描述為與炎性疼痛和痛覺過敏有關的促炎細胞因子。IL-1β可增強脊髓板層Ⅱ神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞并抑制抑制性突觸傳遞，增強疼痛信號向大腦的傳遞；研究發(fā)現(xiàn)降低DRG中的P2X7的表達，抑制IL-1β的釋放，可減弱大鼠脊髓炎癥引起的痛覺過敏〔22〕。而IL-1β成熟和分泌的關鍵過程是ATP誘導的P2X7的激活，在我們的研究中獲得了相似的結果，將CFA注射于大鼠左后爪的足底以誘發(fā)炎癥性痛覺過敏，然后發(fā)展為持續(xù)的慢性炎性痛，其特征為強烈的局部發(fā)紅，水腫和發(fā)熱〔23〕。NeuN是神經(jīng)元特異性標志物，本研究也證實P2X7廣泛分布在神經(jīng)元中。本文結果提示P2X7在Dex介導的鎮(zhèn)痛作用中起重要作用。

研究還發(fā)現(xiàn)在CFA誘導大鼠炎性痛模型的DRG神經(jīng)元中NLRP3表達也顯著增加。而細胞外ATP刺激P2X7釋放IL-1β的過程依賴NLRP3炎性小體的激活〔24〕。NLRP3與炎癥反應密切相關，正常情況下，神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3的表達很低，在感染、炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下，釋放到胞外的ATP可通過激活靶細胞中P2X7，進一步激活NLRP3炎性小體〔25〕，隨后活化半胱天冬氨酸蛋白酶前體(Pro-Caspase)-1分解為Caspase-1，促進促炎細胞因子IL-1β、IL-18的成熟和釋放，進而影響感覺神經(jīng)元功能〔26〕。本研究提示Dex可能通過下調(diào)P2X7，進一步抑制NLRP3/IL-1β通路。

綜上，Dex可能通過下調(diào)P2X7，抑制NLRP3/IL-1β通路，減輕大鼠慢性炎性痛。慢性炎性痛有許多類型，本研究僅采用CFA誘導建立了一種炎性痛大鼠模型，在其他疼痛模型中Dex是否發(fā)揮相同的對P2X7的調(diào)控作用，有待研究。