符瑾 文立 陳麗麗

(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心高壓氧科，海南 海口 570311)

缺血性腦卒中等急性腦血管疾病具有高病發(fā)率、高死亡率等特點(diǎn)，已嚴(yán)重威脅人類生命安全，缺血缺氧可引起神經(jīng)細(xì)胞損傷而造成神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，目前急性腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，因而探究其發(fā)病機(jī)制有助于提高其治療效果及改善患者預(yù)后〔1〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在缺氧誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12中表達(dá)異常，沉默LncRNA MEG3可通過抑制TIMP2啟動(dòng)子甲基化而減輕缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷〔2〕。LncRNA EFNA3表達(dá)下調(diào)通過上調(diào)miR-101a加重缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷〔3〕。微小RNA-331-3p(miR-331-3p)在脊髓損傷中表達(dá)下調(diào)，并可通過靶向RAP1A減輕脊髓損傷，Starbase預(yù)測(cè)顯示LncRNA LINC01503與miR-331-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，已知LINC01503表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖及侵襲〔4,5〕。腦組織氧化應(yīng)激可激活核因子相關(guān)因子(Nrf)2/Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap)1信號(hào)通路從而造成腦組織損傷〔6〕。本研究探究LINC01503對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激的影響，及其對(duì)miR-331-3p/Nrf2/Keap1信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 上海通派生物提供大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12；上海聯(lián)邁生物提供Trizol試劑；北京天根生化提供反轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量PCR試劑；上海吉瑪制藥提供si-NC、si-LINC01503、miR-NC、miR-331-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-331-3p；美國(guó)Invitrogen提供pcDNA3.1、pcDNA-LINC01503、Lipofectamine2000；上海江林生物提供噻唑藍(lán)(MTT)試劑；上海翊圣生物提供細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；南京建成生物提供丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒；美國(guó)Santa Cruz提供兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3抗體；武漢博士德生物提供辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，于37℃、95%O2、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，PC12細(xì)胞接種于6孔板(5×103個(gè)/孔)或96孔板(3×103個(gè)/孔)，置于37℃、1%O2、95%N2、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧處理24 h〔7〕，記為hypoxia組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。采用Lipofectamine2000試劑分別將si-NC、si-LINC01503、miR-NC、miR-331-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-331-3p、si-LINC01503與anti-miR-NC、si-LINC01503與anti-miR-331-3p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞48 h后進(jìn)行缺氧處理24 h，分別記為hypoxia+si-NC組、hypoxia+si-LINC01503組、hypoxia+miR-NC組、hypoxia+miR-331-3p組、anti-miR-NC+hypoxia組、anti-miR-331-3p+hypoxia組、si-LINC01503+anti-miR-NC+hypoxia組、si-LINC01503+anti-miR-331-3p+hypoxia組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中LINC01503、miR-331-3p的表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組PC12細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄。按照熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測(cè)各組細(xì)胞中LINC01503(內(nèi)參β-actin)、miR-331-3p(內(nèi)參U6)相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組PC12細(xì)胞接種于96孔板(3×103個(gè)/孔)，分別加入MTT溶液(20 μl/孔)與二甲基亞砜(DMSO，150 μl/孔)，培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO(室溫孵育5 min)，檢測(cè)各組相對(duì)吸光度(A)值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組PC12細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，加入結(jié)合緩沖液200 μl重懸細(xì)胞，分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)與碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液后應(yīng)用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5檢測(cè)MDA、LDH、SOD的含量 取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)LDH、MDA、SOD的含量。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)LINC01503與miR-331-3p靶向關(guān)系 構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體LINC01503-WT與含有突變位點(diǎn)的突變型載體LINC01503-MUT，分別將miR-NC、miR-331-3p mimics與LINC01503-WT、LINC01503-MUT共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，檢測(cè)其相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3、Nrf2、Keap1蛋白表達(dá) 取各組PC12細(xì)胞加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(400 μl)提取細(xì)胞總蛋白，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗稀釋液(1∶1 000)24 h(4℃)，TBST洗滌后孵育二抗稀釋液(1∶5 000)1 h(室溫)，滴加電化學(xué)發(fā)光液(ECL)，曝光、顯影后應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型中，LINC01503和miR-331-3p表達(dá)情況 與NC組比較，hypoxia組LINC01503的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-331-3p的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型中，LINC01503和miR-331-3p表達(dá)

2.2低表達(dá)LINC01503對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響 與NC組比較，hypoxia組A值、CyclinD1蛋白水平、SOD含量明顯降低，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、MDA、LDH明顯升高(P<0.05)；與hypoxia+si-NC組比較，hypoxia+si-LINC01503組A值、CyclinD1蛋白水平、SOD含量明顯升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、MDA、LDH含量明顯降低(P<0.05)，見圖1、表2、圖2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表2 低表達(dá)LINC01503對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響

1～4：NC組，hypoxia組，hypoxia+si-NC組，hypoxia+si-LINC01503組

2.3高表達(dá)miR-331-3p對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響 與hypoxia+miR-NC組比較，hypoxia+miR-331-3p組 miR-331-3p、A值、CyclinD1蛋白水平、SOD含量明顯升高，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、MDA、LDH含量明顯降低(P<0.05)，見圖3、表3。

1～2：hypoxia+miR-NC組，hypoxia+miR-miR-331-3p組

表3 高表達(dá)miR-331-3p對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響

2.4LINC01503靶向miR-331-3p，調(diào)控miR-331-3p的表達(dá) Starbase預(yù)測(cè)顯示LINC01503與miR-331-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。miR-331-3p過表達(dá)可降低野生型載體LINC01503-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，見表4。qRT-PCR檢測(cè)miR-331-3p表達(dá)，si-NC組miR-331-3p為(1.00±0.10)，si-LINC01503組miR-331-3p為(1.68±0.15)，pcDNA-NC組miR-331-3p為(1.02±0.11)，pcDNA-LINC01503組miR-331-3p為(0.48±0.03)。轉(zhuǎn)染si-LINC01503可促進(jìn)miR-331-3p表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcDNA-LINC01503可抑制miR-331-3p表達(dá)(P<0.05)。

2.5低表達(dá)miR-331-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC01503低表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響 與anti-miR-NC+hypoxia組比較，anti-miR-331-3p+hypoxia組miR-331-3p、A值、CyclinD1蛋白水平、SOD含量明顯降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、MDA、LDH含量明顯升高(均P<0.05)；與si-LINC01503+anti-miR-NC+hypoxia組比較，si-LINC01503+anti-miR-331-3p+hypoxia組miR-331-3p、A值、CyclinD1蛋白水平、SOD含量明顯降低，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平、MDA、LDH含量明顯升高(P<0.05)，見圖5、表5。

圖4 Starbase對(duì)LINC01503和miR-331-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)

表4 miR-NC或miR-331-3p與LINC01503-野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

2.6各組Nrf2/Keap1信號(hào)通路蛋白表達(dá) 與NC組比較，hypoxia組Nrf2、Keap1蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與anti-miR-NC+hypoxia組比較，anti-miR-331-3p+hypoxia組Nrf2、Keap1蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與hypoxia+si-NC組比較，hypoxia+si-LINC01503組Nrf2、Keap1蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與si-LINC01503+anti-miR-NC+hypoxia組比較，si-LINC01503+anti-miR-331-3p+hypoxia組Nrf2、Keap1蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖6、表6。

1～4：anti-miR-NC+hypoxia組,anti-miR-331-3p+hypoxia組,si-LINC01503+anti-miR-NC+hypoxia組,hypoxia+si-LINC01503+anti-miR-331-3p+hypoxia組

表5 低表達(dá)miR-331-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC01503低表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響

1～8：NC組，hypoxia組，anti-miR-NC+hypoxia組，anti-miR-331-3p+hypoxia組，hypoxia+si-NC組，hypoxia+si-LINC01503組，si-LINC01503+anti-miR-NC+hypoxia組，si-LINC01503+anti-miR-331-3p+hypoxia組

表6 Western印跡檢測(cè)Nrf2/Keap1信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討 論

腦缺血發(fā)生后可引起腦組織氧化應(yīng)激、炎癥損傷進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，PC12細(xì)胞是目前研究腦缺血損傷的常用細(xì)胞模型，既往研究顯示LncRNA GAS5通過下調(diào)miR-124加重缺氧誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷〔8〕。沉默LncRNA MEG3通過靶向miR-21減輕缺氧誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷〔9〕。LncRNA UCA1/miR-18a/SOX6分子軸在缺氧誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷中可發(fā)揮重要調(diào)控作用〔10〕。

LINC01503在結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔11～13〕。本研究提示LINC01503高表達(dá)可能加重缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞后細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，還能夠提高M(jìn)DA、LDH的含量及降低SOD的含量，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似〔14～16〕。提示成功建立PC12細(xì)胞損傷模型。本研究結(jié)果顯示，抑制LINC01503表達(dá)可明顯提高缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，還可降低MDA、LDH的含量及提高SOD的含量。本研究雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC01503可靶向結(jié)合miR-331-3p。miR-331-3p抑制卵巢癌〔17〕、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞〔18〕增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果提示抑制LINC01503表達(dá)可通過上調(diào)miR-331-3p的表達(dá)從而減輕缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷。Nrf2/Keap1信號(hào)通路在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷及心肌缺血再灌注損傷中可發(fā)揮重要調(diào)控作用〔19，20〕。本研究結(jié)果提示抑制LINC01503表達(dá)可能通過調(diào)控miR-331-3p/Nrf2/Keap1信號(hào)通路從而減輕缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷。

綜上，缺氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中LINC01503的表達(dá)上調(diào)，而miR-331-3p的表達(dá)下調(diào)，抑制LINC01503表達(dá)可通過上調(diào)miR-331-3p的表達(dá)而減輕缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制Nrf2/Keap1信號(hào)通路的活化有關(guān)，可為進(jìn)一步闡釋急性腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。