蔣露 張燕 任偉宏

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)

胃癌是全球第五大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因，對人類的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅〔1〕。由于缺乏有效的生物分子標(biāo)志物，胃癌通常被發(fā)現(xiàn)時已為晚期，其5年生存率為20%～30%〔2,3〕。包括遺傳學(xué)，表觀遺傳學(xué)和環(huán)境在內(nèi)的多種因素均能影響胃癌的發(fā)生發(fā)展〔4〕?，F(xiàn)階段胃癌的臨床治療仍缺乏有效的手段，主要還是采用手術(shù)并配合化療或者化療與靶向治療聯(lián)合的方式，因此不可避免地可能會產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象〔5〕，已有報道表明，耐藥的胃癌細(xì)胞可能更易發(fā)生轉(zhuǎn)移〔6〕。而影響胃癌轉(zhuǎn)移的因素眾多，涉及多條信號通路的調(diào)控及多種遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。因此，探究胃癌敏感和耐藥細(xì)胞遷移的強(qiáng)弱及其調(diào)控機(jī)制對改善胃癌的治療提供了臨床參考。微小RNA(miR)是長度為20 nt左右是非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA特異性結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)〔7〕。有研究表明，miR-107可以調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、轉(zhuǎn)移等多個生物學(xué)過程〔8～10〕。成纖維細(xì)胞生長因子受體 (FGFR)5，也被稱為FGFRL1，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、黏附、融合等過程中發(fā)揮重要作用〔11〕。有報道表明，F(xiàn)GFRL1也能調(diào)控一些腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程〔12,13〕，但其是否能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的遷移及其與miR-107之間的相互關(guān)系并不十分清楚，且miR-107是否通過靶標(biāo)FGFRL1來調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的遷移，并沒有相關(guān)報道。本研究以胃癌敏感和耐藥細(xì)胞為研究對象，探究miR-107和FGFRL1對其轉(zhuǎn)移的影響，并進(jìn)一步闡明其調(diào)節(jié)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 人胃癌敏感株和5-氟尿嘧啶耐藥株細(xì)胞(SGC-7901，SGC-7901/5-Fu)購自上?；鄯f生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素、RIPA組織/細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和苯甲基磺氟(PMSF)購自索萊寶公司；opti-減/低血清培養(yǎng)基(MEM)購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司；TRIzol購自Life Technologies公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher公司；SYBR green Premix Ex TaqTM熒光定量檢測試劑盒購自TaKaRa公司；miRNA 提取純化試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒及miRNA qPCR定量分析試劑盒購自康為世紀(jì)生物有限公司；Lipofectamine 2000購自invitrogen公司；24孔懸掛transwell(孔徑8 μm)購自Millipore公司；抗-FGFRL1抗體購自BBI公司；抗-GAPDH抗體和抗兔二抗購自Proteintech公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自Genecopoeia公司。

1.2劃痕實(shí)驗(yàn) 將胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu或轉(zhuǎn)染的SGC-7901/5-Fu細(xì)胞種于12孔板，待細(xì)胞融合達(dá)95%以上，用無菌小移液器滴頭橫豎劃細(xì)胞單層，形成劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌除去劃掉的細(xì)胞碎片，用1%血清RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0 h和24 h時間點(diǎn)進(jìn)行拍照記錄，計算細(xì)胞相對遷移距離：(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.3Transwell小室實(shí)驗(yàn) 將胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu或轉(zhuǎn)染的SGC-7901/5-Fu細(xì)胞種于6孔板，隨后用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。將Transwell小室(孔徑8 μm)懸掛于24孔板，下室20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基為誘導(dǎo)劑，上室種200 μl胃癌細(xì)胞懸液，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦去濾膜上面未遷出的細(xì)胞，用4%多聚甲醛和0.1%結(jié)晶紫對穿過孔徑的濾膜下面的細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，并計數(shù)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將胃癌SGC-7901/5-Fu耐藥細(xì)胞接種到12孔或6孔板中，并分為4組：mimic NC組、miR-107 mimic組、NC組和siFGFRL1組。所用RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，miR-107 mimic序列為：上游5′-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3′，下游5′-AUAGCCCUGUACAAU GCUGCUUU-3′；siFGFRL1序列為：上游5′-CGACGGCUCCUACCUCAAUAATT-3′，下游5′-UUAUUGAGGUAGGAGCCGUCGTT-3′；相對應(yīng)的對照RNA由生工生物工程(上海)股份有限公司贈送。培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)70%左右，吸棄RPMI1640培養(yǎng)基，加入一定體積opti-MEM培養(yǎng)基，用Lipofectamine2000作為轉(zhuǎn)染試劑，用opti-MEM分別稀釋Lipofectamine2000和RNA，并將稀釋的RNA逐滴加入到稀釋的轉(zhuǎn)染試劑中，靜置10 min；將RNA-Lipofectamine2000混合物逐滴滴加到SGC-7901/5-Fu耐藥細(xì)胞中，輕輕混勻，6 h后，棄上清，加入10%FBS RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5qPCR檢測FGFRL1 mRNA和miR-107水平 胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu及轉(zhuǎn)染的SGC-7901/5-Fu細(xì)胞沉淀重懸在1 ml Trizol中。然后將混合物在室溫放置5 min，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩1 min，12 000 r/min，4℃，離心15 min。再向上清中加入500 μl異丙醇，劇烈震蕩1 min，12 000 r/min，4℃，離心10 min。用75%乙醇洗滌沉淀2次，干燥，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。測定RNA樣品濃度，用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA(2 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR green Premix Ex TaqTM試劑盒檢測FGFRL1基因相對表達(dá)水平，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。FGFRL1引物序列為：上游5′-GTGTGAGGAGCATGGGTCTC -3′和下游5′- GTGTGTGTGTGTGTGTGTGGA-3′，GAPDH引物序列為：上游5′-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3′和下游5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′。按照miRNA 提取純化試劑盒，miRNA cDNA合成試劑盒及miRNA qPCR定量分析試劑盒的說明提取胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu細(xì)胞的miRNA，并進(jìn)行miRNA的加Poly(A)尾修飾的過程，修飾后的miRNA再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行定量檢測，其中miRNA cDNA合成試劑盒須與miRNA qPCR定量分析試劑盒配套使用，試劑盒提供了下游引物。miR-107上游引物序列為：5′-CGCAGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3′，內(nèi)參基因U6上游引物序列為：5′-CCGAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 用細(xì)胞裂解液(RIPA裂解液，1% 蛋白酶抑制劑和1 mmol/L PMSF)重懸胃癌SGC-7901，SGC-7901/5-Fu細(xì)胞，加至玻璃均漿器中進(jìn)行均漿破碎，將裂解液4℃，5 000 r/min離心15 min，取上清，測定蛋白濃度。將細(xì)胞裂解液在100℃下煮沸10 min變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，恒流將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，4℃過夜孵育抗FGFRL1抗體(1∶400)，抗p-AKT抗體(1∶500)，抗AKT抗體(1∶2 000)，抗E-鈣黏附蛋白(Cadherin)抗體(1∶1 000)，抗波形蛋白(Vimentin)抗體(1∶500)，抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9抗體(1∶1 000)和抗GAPDH抗體(1∶3 000)，洗滌后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育3 h，用增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光(ECL)液進(jìn)行曝光，并用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 用TargetScan (http：//www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測出miR-107對FGFRL1的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)有2處，并用高斯熒光素酶(Gluc)報告載體(pEZX-MT05)構(gòu)建了FGFRL1野生型表達(dá)載體(插入序列為：5′-cTGGACACACAGATAATGCTGCc-3′和5′-aCACACACACAGATAATGCTGCc-3′)和突變型表達(dá)載體(插入序列為：5′-cTGGACACACAGATTACGACGc-3′和5′-aCACACACACAGATTTACGACGc -3′)，該熒光素酶報告載體的內(nèi)參報告基因?yàn)榉置谛蛪A性磷酸酶(SeAP)，載體構(gòu)建由Genecopoeia公司完成。

隨后在HEK 293T工具細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-107與FGFRL1的靶標(biāo)關(guān)系，將293T細(xì)胞種于24孔板，用Lipofectamine2000將上述構(gòu)建的野生型或突變型熒光素酶報告載體與miR-107 mimics或miR-107 mimics NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞上清，用熒光素酶活性試劑盒對Gluc和SeAP的活性進(jìn)行定量測定，并計算出高斯熒光素酶的相對活性。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPASS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1胃癌SGC-7901/5-Fu耐藥株細(xì)胞遷移能力更強(qiáng) 用wound-healing劃痕和transwell小室實(shí)驗(yàn)測定了5-FU敏感和耐藥SGC-7901細(xì)胞遷移能力。結(jié)果表明，與敏感株SGC-7901相比，SGC-7901/5-Fu耐藥株細(xì)胞劃痕愈合相對遷移距離明顯更大，穿過小室的細(xì)胞數(shù)量明顯更多，耐藥株細(xì)胞的遷移能力顯著強(qiáng)于SGC-7901敏感株細(xì)胞(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 0和24 h劃痕及transwell小室實(shí)驗(yàn)測定SGC-7901和SGC-7901/5-Fu細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色，×200)

表1 SGC-7901敏感和耐藥細(xì)胞遷移水平、miR-107、FGFRL1 miRNA和蛋白表達(dá)比較

2.2胃癌SGC-7901敏感和耐藥株細(xì)胞中miR-107和FGFRL1表達(dá)水平 與敏感株細(xì)胞SGC-7901相比，SGC-7901/5-Fu耐藥株細(xì)胞中miR-107顯著低表達(dá)，而FGFRL1 mRNA及蛋白顯著高表達(dá)(P<0.05)。推測miR-107可能通過調(diào)控FGFRL1的表達(dá)調(diào)節(jié)胃癌SGC-7901敏感和耐藥株細(xì)胞的遷移。見表1、圖2。

圖2 FGFRL1在SGC-7901和SGC-7901/5-Fu細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)鑒定FGFRL1是miR-107的靶標(biāo)分子 根據(jù)Targetscan軟件分析結(jié)果，F(xiàn)GFRL1的3′-UTR有2處潛在的miR-107結(jié)合位點(diǎn)，如圖3A所示，并且熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FGFRL1與miR-107的靶標(biāo)關(guān)系。結(jié)果表明，與共轉(zhuǎn)染pEZX-MT05-WT/miR-107 mimic NC組(1.11±0.04)相比，共轉(zhuǎn)染pEZX-MT05-WT/miR-107 mimic組的熒光素酶的相對活力(0.50±0.04)顯著降低(P<0.05)，但是在pEZX-MT05-MUT突變表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染mimic NC組與miR-107 mimic組之間，熒光素酶的相對活力(1.08±0.04 vs 1.00±0.06)沒有明顯差別(P>0.05)，證明miR-107與FGFRL1之間有靶向結(jié)合位點(diǎn)。與mimic NC組和NC組相比，miR-107 mimic組和siFGFRL1組的FGFRL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)約5倍(圖3B、表2)。表明在胃癌SGC-7901/5-Fu細(xì)胞中miR-107可以調(diào)控FGFRL1的表達(dá)，F(xiàn)GFRL1是miR-107的下游靶標(biāo)分子。

A.在FGFRL1的3′-UTR預(yù)測的2處miR-107結(jié)合位點(diǎn)；B.Western印跡檢測7901/5-FU細(xì)胞各處理組FGFRL1蛋白表達(dá)水平。1～4:mimic NC組、miR-107 mimic組、NC組、siFGFRL1組；圖4B同

表2 SGC-7901/5-FU細(xì)胞各組FGFRL1蛋白及mRNA表達(dá)水平

2.4miR-107通過抑制FGFRL1/AKT活性調(diào)節(jié)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá) 與SGC-7901敏感株細(xì)胞相比，SGC-7901/5-Fu耐藥株細(xì)胞FGFRL1呈明顯高表達(dá)，耐藥株細(xì)胞中AKT的活性(p-AKT水平)明顯升高，遷移相關(guān)蛋白Vimentin和MMP9明顯高表達(dá)，而E-Cadherin呈明顯低表達(dá)(P<0.05)，見圖4A。說明SGC-7901/5-Fu耐藥株細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力。與mimic NC組和NC組相比，在miR-107 mimic組和siFGFRL1組中FGFRL1、AKT活性及Vimentin和MMP9蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，而E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖4B、表3。表明miR-107通過靶向FGFRL1調(diào)節(jié)AKT的活性，調(diào)控下游遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，影響耐藥腫瘤細(xì)胞的遷移。

A.Western印跡檢測胃癌SGC-7901敏感株細(xì)胞和SGC-7901/5-FU耐藥株細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；1～2：SGC-7901、SGC-7901/5-FU；B.轉(zhuǎn)染處理后，Western印跡檢測SGC-7901/5-FU耐藥株細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

表3 胃癌SGC-7901、SGC-7901/5-FU細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.5過表達(dá)miR-107和敲減FGFRL1對SGC-7901/5-Fu細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響 miR-107 mimic組和siFGFRL1組與其對照的mimic NC組和NC組相比，SGC-7901/5-Fu耐藥細(xì)胞劃痕愈合距離和穿過小室細(xì)胞數(shù)量均顯著減少，遷移水平顯著抑制(P<0.05)，見表4、圖5。表明敲低FGFRL1的表達(dá)可以明顯抑制耐藥株細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而過表達(dá)miR-107則可以下調(diào)FGFRL1表達(dá)，進(jìn)而抑制SGC-7901/5-Fu轉(zhuǎn)移。

表4 SGC-7901/5-FU細(xì)胞各組細(xì)胞遷移

圖5 劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-107和敲減FGFRL1抑制SGC-7901/5-FU細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

在現(xiàn)階段胃癌的臨床治療過程中，化療藥物耐藥的現(xiàn)象頻繁發(fā)生，并且耐藥的胃癌細(xì)胞有更強(qiáng)的遷移能力，腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力大大降低了患者的存活時間。雖然已有很多報道研究了各種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制及調(diào)控因素，但對耐藥腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究并不多見，因此，探究調(diào)控耐藥胃癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制能對進(jìn)一步改善胃癌的臨床治療提供參考靶點(diǎn)。已有報道表明miRNA-107在多種疾病的發(fā)生中起到調(diào)節(jié)作用，如關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病等〔14，15〕，尤其對腫瘤細(xì)胞而言，miRNA-107在其生長、藥物敏感性及遷移方面起重要的調(diào)節(jié)作用〔8～10〕。由于miR-107對多種腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移過程有重要的調(diào)節(jié)作用，可推測miR-107可能在調(diào)節(jié)耐藥胃癌細(xì)胞遷移中起調(diào)控作用。本研究結(jié)果說明，miR-107確實(shí)可以調(diào)控耐藥胃癌細(xì)胞的遷移。

由于FGFRL1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFRs)家族的其他受體不同，其C端不包含酪氨酸激酶區(qū)域，其功能也與經(jīng)典的成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)/FGFRs通路不同〔16〕。雖然已有研究表明，F(xiàn)GFRL1會影響細(xì)胞的一些生物學(xué)功能，但其對腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用并不十分清楚，有待深入探究〔17〕。有文獻(xiàn)表明，miR-107在非小細(xì)胞肺癌中可以通過調(diào)控FGFRL1的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞增殖〔18〕。但在胃癌細(xì)胞中，miR-107是否靶向FGFRL1基因，調(diào)控FGFRL1的表達(dá)及miR-107調(diào)控胃癌細(xì)胞遷移的作用是否通過FGFRL1介導(dǎo)都鮮有報道。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測，熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)鑒定及過表達(dá)miR-107后，檢測FGFRL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明miR-107可以靶向調(diào)控FGFRL1的表達(dá)，F(xiàn)GFRL1是miR-107的分子靶標(biāo)，且過表達(dá)miR-107和敲低FGFRL1后，耐藥細(xì)胞的遷移能力極顯著的被抑制，驗(yàn)證了miR-107調(diào)控耐藥胃癌細(xì)胞的遷移是通過FGFRL1介導(dǎo)的。就作用機(jī)制而言，有文獻(xiàn)研究表明，F(xiàn)GFRL1可以通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信號調(diào)節(jié)小細(xì)胞肺癌化療耐藥的現(xiàn)象〔19〕，但FGFRL1是否通過調(diào)節(jié)AKT活性影響腫瘤細(xì)胞的遷移，尤其是對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，并沒有相關(guān)報道。而本研究新發(fā)現(xiàn)，改變miR-107或FGFRL1表達(dá)后，可以調(diào)節(jié)AKT的活性進(jìn)而影響了一些遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終影響了胃癌耐藥細(xì)胞的遷移。