宋光捷 方毅 陳黎 馮建青

(1湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 襄陽(yáng) 441000；2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九九一醫(yī)院骨科；3中國(guó)人民解放軍96608部隊(duì)醫(yī)院內(nèi)一科)

缺血性腦卒中是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一，盡管大量的神經(jīng)保護(hù)劑被不斷研究和開(kāi)發(fā)，但仍未取得滿意的效果〔1〕。缺血性腦卒中在溶栓治療過(guò)程中，極有可能出現(xiàn)腦缺血再灌注損傷，進(jìn)而造成神經(jīng)細(xì)胞損傷或促進(jìn)神經(jīng)元凋亡〔2〕。因此，深入了解缺血再灌注所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷機(jī)制，為缺血性腦卒中提供新的治療方法，具有十分重要的意義。Janus激酶(JAK)1是Janus激酶家族中的成員之一，存在于細(xì)胞膜表面，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)1是STAT家族中的成員之一，存在于細(xì)胞質(zhì)中，JAK1/STAT1信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用〔3〕。機(jī)體一旦出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞膜表面的JAK1被異常激活，隨后STAT1被JAK1激酶的細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶磷酸化，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡等一系列信號(hào)通路〔4〕。研究表明〔5〕，抑制JAK1/STAT1信號(hào)通路可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減輕缺血性腦損傷。白藜蘆醇(Res)是一種多酚類(lèi)化合物，存在于葡萄、桑葚、花生和葡萄酒中，被認(rèn)為是一種有效的抗氧化、抗感染和抗凋亡藥物〔6〕。研究表明〔7,8〕，Res對(duì)腦缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，但其詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究探討Res基于JAK1/STAT1信號(hào)通路減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器 Res(純度>98%，北京索萊寶科技有限公司)；10%水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)；2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(上海澤葉生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；鼠抗JAK1單克隆抗體、鼠抗STAT1單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，8～10周齡，體重260～300 g，由南京君科生物工程有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2019-0002。所有大鼠喂養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，控制溫度為22～24℃，并使其自由攝取食物和水。動(dòng)物研究均嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生研究所和醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)所批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南執(zhí)行。

1.3模型建立和分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)所有大鼠1 w，并將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、腦缺血再灌注(I/R)組、Res低劑量組(10 mg/kg)、Res中劑量組(30 mg/kg)和Res高劑量組(60 mg/kg)各8只。采用文獻(xiàn)介紹的大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)法以建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，步驟如下，首先采用1 ml/100 g的10%水合氯醛溶液對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，從頸正中行一切口，使得右側(cè)頸總動(dòng)脈暴露，并游離頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈距離頸總動(dòng)脈交叉位置10 mm處結(jié)扎、離斷，使用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，并于頸外動(dòng)脈距離頸總動(dòng)脈交叉位置5 mm處作出一個(gè)小切口，將線栓(直徑0.24 mm)經(jīng)切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，將頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾松開(kāi)，繼續(xù)將線栓插入到達(dá)右側(cè)大腦中動(dòng)脈，當(dāng)線栓頂端距離頸總動(dòng)脈分叉位置18～20 mm且感覺(jué)到有阻力時(shí)停止，并松開(kāi)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾，等到大鼠蘇醒之后進(jìn)行Longa神經(jīng)功能缺失評(píng)分，≥2分則判斷為栓塞成功，2 h后將線栓退到頸外動(dòng)脈殘端位置以實(shí)現(xiàn)再灌注，假手術(shù)組不插入線栓，并注射生理鹽水，Res低、中、高劑量組于再灌注前通過(guò)大鼠尾部進(jìn)行靜脈注射10、30、60 mg/kg劑量的Res。

1.4方法

1.4.1各組神經(jīng)功能缺失評(píng)分 再灌注24 h之后，參照Z(yǔ)ea Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分，采用4級(jí)評(píng)分法，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失；1分：輕度缺失，提尾時(shí)右前肢無(wú)法完全伸展；2分：中度缺失，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：中至重度缺失，向右側(cè)傾倒；4分：重度缺失，意識(shí)喪失，甚至出現(xiàn)死亡。

1.4.2各組腦梗死體積和腦水腫率測(cè)定 再灌注24 h之后，取10%水合氯醛麻醉各組大鼠，斷頭取腦組織，均勻切成2 mm厚度冠狀切片，并浸入2% TTC溶液中，并置于37℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，再浸入4%多聚甲醛中固定24 h，取出腦切片平鋪于培養(yǎng)皿中，并拍照，利用ImageJ軟件測(cè)定腦梗死體積。使用電子天平測(cè)定大鼠左、右兩側(cè)大腦濕重，置入100℃烤箱24 h，再測(cè)定干重，腦水腫率=(腦組織濕重-腦組織干重)×100%。

1.4.3免疫組化染色檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組腦組織進(jìn)行石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟水化，再置于蘇木素中染色5 min，清水沖洗，再水化15 s，清水沖洗，再放入75%酒精、85%酒精各2 min，再置于0.5%伊紅中染色1 min，再次放入95%酒精Ⅰ、Ⅱ和100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各5 min及二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各5 min，最后，采用中性樹(shù)膠封片，并在顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)變化。

1.4.4原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)法(TUNEL)檢測(cè)缺血再灌注區(qū)腦神經(jīng)元凋亡水平 取各組缺血再灌注區(qū)腦組織切片，常規(guī)脫蠟，滴加20 μg/ml不含DNA酶的蛋白酶K 50 μl，置于37℃烤箱孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，5 min/次，再加入TUNEL檢測(cè)液50 μl，37℃烤箱孵育1 h，PBS漂洗3次，5 min/次，最后使用抗熒光淬滅封片液在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.5RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá) 取各組缺血再灌注區(qū)腦組織，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列如下：GAPDH正向：5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′， 反向：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′；B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2正向：5′-AGGATTGTGGCCTTCTTTGA-3′，反向：5′-CAGATGCCGGTTCAGGTACT-3′；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)正向：5′-GCTGGACACTGGACTTCCTC-3′， 反向：5′-ACTCCAGCCACAAAGATGGT-3′；含半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)-3正向：5′-TGCCAGAAGATACCAGTGGA-3′， 反向：5-TGACTGGATGAACCATGAC-C-3。引物由南京金斯瑞公司進(jìn)行合成。最后采用SYBR試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.4.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 取各組缺血再灌注區(qū)腦組織100 mg提取蛋白，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離膠轉(zhuǎn)移至與目的蛋白區(qū)域大小對(duì)應(yīng)的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，放入電泳槽進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，加入一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、caspase-3(1∶500)、JAK1(1∶500)、STAT1(1∶500)、p-JAK1(1∶500)、p-STAT1(1∶500)孵育4℃過(guò)夜，TBST緩沖液清洗3次，各5 min，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液清洗3次，各5 min，最后滴加1∶1混勻的A液和B液，以GAPDH作為內(nèi)參，將膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，拍照，并采用ImageJ軟件分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Res對(duì)I/R大鼠神經(jīng)功能的影響 I/R組神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著高于Sham組(P<0.01)，提示大腦中動(dòng)脈栓塞后局部腦組織缺血，導(dǎo)致了明顯的神經(jīng)功能缺失；Res低劑量組神經(jīng)功能缺失評(píng)分與I/R組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著低于I/R組(P<0.01)，其中Res中劑量組改善效果最佳。見(jiàn)表1。

2.2Res對(duì)I/R大鼠腦梗死體積和腦水腫率的影響 I/R組腦梗死體積、腦水腫率顯著大于Sham組(P<0.01)，Res低劑量組腦梗死體積、腦水腫率與I/R組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組腦梗死體積、腦水腫率顯著小于I/R組(P<0.05)，表明30、60 mg/kg劑量的Res處理可顯著降低I/R大鼠腦梗死體積、腦水腫率。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦梗死體積百分比、腦水腫率、神經(jīng)元凋亡及腦組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較

紅色表示正常腦組織，白色表示腦梗死組織

2.3Res對(duì)I/R大鼠病理改變的影響 Sham組腦神經(jīng)元細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，形態(tài)正常，無(wú)間質(zhì)水腫，核仁清楚可見(jiàn)；I/R組腦缺血側(cè)結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞輪廓模糊，間質(zhì)明顯水腫，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增加，可見(jiàn)空泡形成；Res低劑量、中、高劑量組病理?yè)p傷均有不同程度上的減輕，與I/R組相比，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，正常神經(jīng)元細(xì)胞明顯增多，Res中劑量組神經(jīng)保護(hù)作用最明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色檢測(cè)各組病理改變(×400)

2.4Res對(duì)I/R神經(jīng)元凋亡的影響 I/R組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著多于Sham組(P<0.001)，Res低劑量組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與I/R組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著少于I/R組(P<0.001)，表明30、60 mg/kg劑量的Res處理可顯著抑制I/R大鼠梗死區(qū)腦神經(jīng)元凋亡。見(jiàn)表1。

2.5Res對(duì)I/R凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 I/R組缺血再灌注區(qū)腦組織Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于Sham組，Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于Sham組(P<0.05)；Res低劑量與I/R組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于I/R組，Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于I/R組(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2、圖3。

2.6Res對(duì)I/R JAK1/STAT1信號(hào)通路的影響 I/R組缺血再灌注區(qū)腦組織p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)水平顯著高于Sham組(P<0.01)；Res低劑量與I/R組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)，Res中、高劑量組p-JAK1、p-STAT1蛋白表達(dá)水平顯著低于I/R組(P<0.01)，各組JAK1、STAT1蛋白表達(dá)水平相比無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖4。

表2 各組腦組織Bcl-2、Bax、caspase-3、JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達(dá)比較

1～5:Sham組,I/R組,Res低劑量組,Res中劑量組,Res高劑量組；圖4同

圖4 Res對(duì)I/R大鼠JAK1/STAT1信號(hào)通路的影響

3 討 論

缺血性腦卒中后腦損傷是由一些列復(fù)雜的病理生理事件所導(dǎo)致的，包括興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡〔9〕。然而，有關(guān)缺血性腦卒中后腦損傷并無(wú)最佳治療措施，原因與缺血性腦卒中后發(fā)生的細(xì)胞和分子變化并不完全清楚有關(guān)，這些變化也是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的原因之一。因此，對(duì)腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，以制定出增加有效的治療方案，對(duì)改善缺血性腦卒中患者預(yù)后具有十分重要的意義。

Res廣泛存在于70多種植物中，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，藥理學(xué)研究顯示，其可對(duì)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及心血管疾病等發(fā)揮作用〔10〕。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Res對(duì)心臟損傷/心肌梗死、出血性腦、肺、皮膚損傷等有一定的保護(hù)作用，而這些作用是通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激，升高一氧化氮水平，介導(dǎo)離子通道激活以及促進(jìn)自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)的〔11〕。Fang等〔12〕研究表明，Res可降低腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦梗死面積、腦水腫量，減少神經(jīng)元凋亡，降低髓過(guò)氧化物酶和腫瘤壞死因子-α水平，提示Res對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕腦缺血再灌注所致的炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果說(shuō)明，模型建立成功，符合臨床觀察結(jié)果。本研究結(jié)果提示，中、高劑量Res能夠減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，改善神經(jīng)功能，發(fā)揮腦組織保護(hù)作用。張躍奇等〔13〕報(bào)道亦表明，Res預(yù)處理干預(yù)可有效改善大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能。

JAK/STAT信號(hào)通路是一種多效性級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路，能夠?qū)⑿盘?hào)從質(zhì)膜傳至細(xì)胞核內(nèi)〔14〕。JAK/STAT家族包含多個(gè)成員，其中JAK1/STAT1信號(hào)通路在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用〔15〕。有實(shí)驗(yàn)〔16〕表明，JAK1/STAT1信號(hào)通路可影響心肌缺血再灌注小鼠caspase-3表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌組織〔16〕。另外，JAK1/STAT1信號(hào)通路被抑制以后，氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯受到抑制，炎癥反應(yīng)也明顯減輕，腦組織凋亡亦減少，提示JAK1/STAT1信號(hào)通路能夠減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用〔17〕。本研究結(jié)果表明，Res處理可抑制p-JAK1、p-STAT1磷酸化，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，同時(shí)抑制caspase-3表達(dá)，進(jìn)而減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，以減輕腦缺血再灌注損傷，最終發(fā)揮腦組織保護(hù)作用。即Res可能是通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)，來(lái)抑制神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷。既往研究〔18〕表明，Res可上調(diào)海馬Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而減輕腦缺血神經(jīng)損傷。Park等〔19〕通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型發(fā)現(xiàn)，Res可激活蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶激酶(GSK)-3β信號(hào)通路，增加Akt、GSK-3β磷酸化水平，下調(diào)caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Lei等〔20〕研究指出，采用Res處理MCAO法建立的大鼠發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，腦水腫明顯減少，炎癥反應(yīng)明顯減輕，而使用磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制劑LY294002抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，以上作用均被阻斷，提示Res主要通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路減輕局灶性腦缺血再灌注損傷。本研究初步闡明了Res處理可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的機(jī)制，但Res調(diào)節(jié)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的詳細(xì)分子機(jī)制有待深入研究。

綜上，Res處理可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制JAK1/STAT1信號(hào)通路，降低其磷酸化水平，進(jìn)而影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)，提示Res對(duì)缺血性腦卒中有一定的治療價(jià)值。