麻華膽 黃慶 鄭愛甜 劉賢彬 李政 王琳 曾娜 吳標(biāo)良

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 百色 533000;2研究生學(xué)院)

糖尿病潰瘍創(chuàng)面為糖尿病常見的并發(fā)癥，其中糖尿病足潰瘍是非外傷性低位截肢的主要原因〔1〕，給家庭與社會(huì)帶來嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。糖尿病潰瘍創(chuàng)面屬慢性難愈性創(chuàng)面，愈合機(jī)制復(fù)雜，其潛在機(jī)制尚未完全闡明。細(xì)胞自噬是一個(gè)保守的細(xì)胞降解過程，在維持體內(nèi)平衡和預(yù)防營養(yǎng)、代謝和感染介導(dǎo)的應(yīng)激中起重要作用，自噬與凋亡之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，在糖尿病潰瘍創(chuàng)面的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。自噬相關(guān)蛋白(Beclin)1可單獨(dú)或以Beclin1-B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2復(fù)合物的形式參與自噬和凋亡的調(diào)節(jié)〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察糖尿病創(chuàng)面愈合過程中Beclin1表達(dá)的變化，探討糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合不良的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級Wistar雄性大鼠18只，體重230～260 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ) 北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn)；Beclin1、p-Beclin1(phos Ser 14)抗體：Abcam公司生產(chǎn)；二抗、β-actin抗體：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Beclin1、β-actin引物：上海捷瑞生物工程有限公司合成；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green熒光定量檢測試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.3動(dòng)物分組及創(chuàng)面模型建立 大鼠予適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為對照組、模型組各9只。對照組不建立糖尿病模型，在背部備皮后即行全層皮膚切除(面積約2.5 cm×2.5 cm)；模型組給予STZ誘導(dǎo)建立糖尿病模型，模型復(fù)制成功后進(jìn)行全層皮膚切除，即完成糖尿病創(chuàng)面大鼠模型的建立〔3〕。

1.4標(biāo)本采集與處理 各組分別于皮膚切除后第1天、第11天、第18天各隨機(jī)取3只大鼠，麻醉后剪取創(chuàng)面組織，分別用于制作蘇木素-伊紅(HE)染色切片及行實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和Western印跡檢測。

1.5HE染色觀察創(chuàng)面組織病理改變 創(chuàng)面組織予10%甲醛溶液固定48 h后依次用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片、HE染色制片，光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤、血管形成及再上皮化情況。

1.6Western印跡檢測Beclin1、p-Beclin1的表達(dá) 將預(yù)先加入磷酸酶抑制劑的組織裂解液裂解組織樣品，提取總蛋白，制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后等體積上樣，以Beclin1和p-Beclin1一抗孵育聚偏氟乙烯(PVDF)膜過夜，次日進(jìn)行二抗孵育，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影，蛋白質(zhì)灰度分析采用ImageJ軟件。

1.7qRT-PCR法檢測Beclin1 mRNA的表達(dá) 以未造模大鼠背部正常皮膚組織作為對照樣本，Trizol法提取總RNA，測定總RNA濃度并進(jìn)行質(zhì)量分析，按照反轉(zhuǎn)錄說明書將質(zhì)量合格(A260/A280比值在1.8～2.1之間)的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR，采用公式F=2-ΔΔCt對Ct值進(jìn)行轉(zhuǎn)換。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1創(chuàng)面愈合情況及組織病理改變 第11天，對照組創(chuàng)面干燥平整，表面覆蓋少許痂皮，模型組創(chuàng)面水腫明顯，表面凹凸不平，對照組創(chuàng)面面積明顯小于模型組。顯微鏡下，對照組膠原及毛細(xì)血管形成情況優(yōu)于模型組，而炎癥細(xì)胞浸潤較輕。第18天，對照組創(chuàng)面基本愈合，鏡下可觀察到完整表皮及皮膚附屬器；模型組創(chuàng)面紅潤，輕微水腫，鏡下可見炎癥細(xì)胞浸潤及廣泛分布的毛細(xì)血管網(wǎng)，但均較第11天明顯減少。見圖1、圖2。

圖2 兩組創(chuàng)面愈合情況

2.2Beclin1、p-Beclin1蛋白檢測 Western印跡結(jié)果顯示，第1天、第11天，對照組Beclin1、p-Beclin1表達(dá)明顯高于模型組，第18天，對照組Beclin1、p-Beclin1表達(dá)明顯低于模型組(均P<0.05)。創(chuàng)面愈合過程中，對照組Beclin1、p-Beclin1表達(dá)升高后下降，第11天的表達(dá)量最高；模型組Beclin1、p-Beclin1表達(dá)升高后趨于平穩(wěn)或輕微下降，第11天的表達(dá)量最高，第1天的表達(dá)量最低。見表1、圖3。

2.3Beclin1 mRNA檢測 qRT-PCR結(jié)果顯示，第1天、第11天，對照組Beclin1 mRNA表達(dá)明顯高于模型組，第18天，對照組Beclin1 mRNA表達(dá)明顯低于模型組(P<0.05)。創(chuàng)面愈合過程中，對照組Beclin1 mRNA表達(dá)升高后下降，第11天的表達(dá)量最高，第1天的表達(dá)量最低；模型組Beclin1 mRNA表達(dá)升高后趨于平穩(wěn)，第11天的表達(dá)量最高，第1天的表達(dá)量最低。見表1。

表1 兩組創(chuàng)面組織內(nèi)Beclin1蛋白p-Beclin1蛋白及Beclin1 mRNA表達(dá)水平比較

圖3 兩組創(chuàng)面組織內(nèi)Beclin1/p-Beclin1蛋白表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞自噬在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要作用，在創(chuàng)面形成早期，自噬通過激活炎癥細(xì)胞、增強(qiáng)其吞噬功能而發(fā)揮高效的抗感染免疫，在炎癥反應(yīng)后期，巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)其向M2轉(zhuǎn)化，啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)，此后，細(xì)胞自噬一方面加強(qiáng)血管形成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖分化及膠原合成，別一方面促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移而加快創(chuàng)面組織上皮化〔4〕。反之，細(xì)胞凋亡的增加被認(rèn)為是創(chuàng)面愈合延遲的主要原因之一。Beclin1是UNC-51樣激酶(ULK)1的下游分子，活化的ULK1通過磷酸化Beclin1的Ser 14位點(diǎn)，進(jìn)一步激活膜泡分揀蛋白(VPS)34，以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生〔2〕。自噬活性亦與Beclin1-Bcl-2復(fù)合體的狀態(tài)相關(guān)，Bcl-2通過與Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合而抑制Beclin1的活性，反之，Beclin1-Bcl-2復(fù)合體的解離則恢復(fù)Beclin1活性，有利于提高自噬水平〔5〕。Bcl-2作為重要的抗凋亡蛋白，與Beclin1的穩(wěn)定結(jié)合亦影響其生物學(xué)功能而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔6〕。

本研究結(jié)果表明，糖尿病狀態(tài)抑制創(chuàng)面的愈合，主要原因?yàn)橐葝u素相對或絕對不足引起的細(xì)胞代謝異常、糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的堆積〔7〕、免疫功能紊亂〔8〕等，上述眾多因素相互影響、共同作用，導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面炎癥反應(yīng)遷延不愈、成纖維細(xì)胞增殖分化受限、膠原合成減少、再上皮化延遲。本研究結(jié)果表明，細(xì)胞自噬在糖尿病創(chuàng)面組織中受到抑制，可能與糖尿病狀態(tài)下的細(xì)胞功能受損及蛋白合成障礙有關(guān)。研究表明，高糖可直接〔9〕或通過AGEs〔10〕的堆積，引起溶酶體功能受損并阻斷自噬流。另有研究指出，高糖環(huán)境下，自噬相關(guān)蛋白(Atg)基因的轉(zhuǎn)錄受抑制，進(jìn)而導(dǎo)致自噬失活〔11〕。本研究結(jié)果提示，創(chuàng)面形成早期高度的應(yīng)激及缺血缺氧有關(guān)的細(xì)胞饑餓狀態(tài)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體(mTORC)1，進(jìn)而激活自噬啟動(dòng)因子ULK1，引發(fā)自噬。在此過程中，Beclin1的表達(dá)及磷酸化水平與自噬體的形成密切相關(guān)。研究表明，Beclin1的磷酸化是Beclin1從Beclin1-Bcl-2復(fù)合體解離而恢復(fù)其生物活性所必須〔2，5〕，可見，在特定情況下，Beclin1的磷酸化水平與其表達(dá)量及活性相輔相成，共同影響自噬活性。創(chuàng)面愈合晚期，對照組Beclin1、p-Beclin1蛋白及Beclin1 mRNA表達(dá)水平的顯著降低可能是隨著創(chuàng)面的愈合，缺血缺氧改善，蛋白合成增加，mTORC1抑制解除，引起B(yǎng)eclin1低表達(dá)并發(fā)生去磷酸化。由于模型組創(chuàng)面愈合延遲，至第18天仍未完全上皮化，細(xì)胞仍處于能量缺乏狀態(tài)，而對照組在此時(shí)已基本愈合，血運(yùn)的恢復(fù)使局部缺血缺氧改善，蛋白質(zhì)充分合成，因此模型組較對照組具有更強(qiáng)的自噬誘導(dǎo)作用，從而表現(xiàn)為模型組Beclin1、p-Beclin1蛋白及Beclin1 mRNA在第18天的表達(dá)量高于對照組，且與組內(nèi)第11天的表達(dá)量無明顯差異。該結(jié)果同時(shí)表明，雖然糖尿病狀態(tài)抑制創(chuàng)面組織細(xì)胞自噬，但該抑制作用遠(yuǎn)不如能量缺乏對自噬的誘導(dǎo)作用。

自噬和凋亡為兩種主要的細(xì)胞程序性死亡機(jī)制，在諸多情況下，二者表現(xiàn)為相互抑制的關(guān)系，Beclin1-Bcl-2復(fù)合體被認(rèn)為是細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡的“切換開關(guān)”，Beclin1及其磷酸化水平的升高在激活自噬的同時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡〔6〕。因此，模型組創(chuàng)面愈合早期Beclin1、p-Beclin1蛋白及Beclin1 mRNA的低表達(dá)也可能與細(xì)胞凋亡的激活有關(guān)，即糖尿病通過影響B(tài)eclin1的表達(dá)及磷酸化水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，糖尿病狀態(tài)抑制Beclin1表達(dá)，可能為糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合延遲的機(jī)制之一。