戚飛飛，李廣秋，冷雷

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院白云醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科 廣東 廣州 510470；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510120；3.暨南大學(xué)附屬廣州市紅十字會醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510220

結(jié)腸癌在臨床上主要表現(xiàn)為消化不良、腹脹、黏液膿性血便等[1]。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升，臨床實踐發(fā)現(xiàn)，超過60%的患者在確診時已處于晚期，而結(jié)腸癌患者的5年生存率不足15%，預(yù)后較差[2-3]。因此，在發(fā)病初期選擇能夠準(zhǔn)確鑒別結(jié)腸癌的診斷手段對于提高其臨床治療及預(yù)后都具有重要意義。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA核受體亞家族2F組成員1-反義RNA1(Lnc RNA NR2F1-AS1)的表達與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移有關(guān)[4]。染色體凝縮蛋白復(fù)合物I的亞基D2(NCAPD2)從屬于染色體凝縮蛋白復(fù)合物I，NCAPD2通過影響其他凝縮蛋白亞基在染色體上的正常定位，進而影響細(xì)胞有絲分裂進程[5]。NCAPD2的異常表達與癌細(xì)胞的遷移、侵襲和周期轉(zhuǎn)變的分子機制密切相關(guān)。核孔蛋白107(Nup 107)是Nup復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，是組裝核孔復(fù)合物和mRNA輸出的關(guān)鍵，在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多類型癌癥中表現(xiàn)為過度表達[6]。本研究旨在探究結(jié)腸癌患者組織中NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107表達及其與預(yù)后的關(guān)系，為結(jié)腸癌患者的病情及預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年6月至2019年6月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院及暨南大學(xué)附屬廣州市紅十字會醫(yī)院進行根治性切除術(shù)的60例原發(fā)性結(jié)腸癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《NCCN結(jié)腸癌臨床實踐指南(2021年V2版)》[7]中關(guān)于結(jié)腸癌的相關(guān)診治標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)明確證實為原發(fā)性結(jié)腸腺癌；(2)術(shù)前無化療、放療等任何輔助治療者；(3)臨床病歷資料齊全完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重要臟器合并嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；(2)病理學(xué)檢查不明確者。60例患者中男性29例，女性31例；年齡34～74歲，平均(58.18±10.50)歲；<50歲者17例，≥50歲者43例；腫瘤直徑1.73～6.11 cm，平均(4.09±0.97)cm，其中<4 cm者27例，≥4cm者33例；腫瘤位于左半結(jié)腸26例，位于右半結(jié)腸34例；分化程度：高分化22例，中分化23例，低分化15例；浸潤程度：T1期10例，T2期12例，T3期24例，T4期14例。轉(zhuǎn)移情況：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，遠端轉(zhuǎn)移34例。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院及暨南大學(xué)附屬廣州市紅十字會醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者或直系親屬均詳細(xì)知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 Lnc RNA NR2F1-AS1檢測 將所有患者的結(jié)腸癌組織標(biāo)本和距離結(jié)腸癌組織>2 cm的癌旁正常組織標(biāo)本置于液氮罐中冷凍保存24 h后轉(zhuǎn)移至-80℃的低溫環(huán)境中保存、待檢。Lnc RNA NR2F1-AS1檢測采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法進行：取冰凍的組織樣本放置在研缽中，在液氮環(huán)境下研磨至粉末狀，添加Trizol試劑(南京森貝伽生物科技有限公司)，抽提標(biāo)本總RNA，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。利用超微量分光光度計檢測標(biāo)本在260 mm、280 mm波長處的吸光度值(A)，以A260/A280比值范圍在1.8～2.0提純RNA。以2μL總DNA為模版，采用First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cRNA。之后采用SYBR Green PCR Master Mix(購自上海恪敏生物科技有限公司)配置PCR擴增反應(yīng)體系，PCR擴增循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：96℃預(yù)變性1 min，95℃變性40 s，62℃退火/延伸40 s，40個循環(huán)。Lnc RNA NR2F1-AS1(上、下游引物序列分別為：5'-CAGCGGTGCAAACCATGTGC-3'、5'-AGCAAGTTGGCTGAACCAAATG-3')以GAPDH為內(nèi)參(上、下游引物序列分別為：5'-CAGTGCCAGCCTGGTCTAT-3'、5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3')。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，以2-△△CT法計算Lnc RNA NR2F1-AS1的相對表達量。以結(jié)腸癌患者癌組織Lnc RNA NR2F1-AS1相對表達量的平均值0.70為界限，將低于0.70的患者作為Lnc RNA NR2F1-AS1低表達組，高于0.70的作為Lnc RNA NR2F-AS1高表達組，就兩組患者的臨床病歷資料進行分析、比較。

1.2.2 NCAPD2檢測 采用免疫組化SP法檢測NCAPD2蛋白表達。取結(jié)腸癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本進行切片，層厚4μm，60℃烤片40～60 min。采用二甲苯進行常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，微波爐加熱檸檬酸鹽緩沖液4～8 min進行抗原修復(fù)，滴加一抗NCAPD2(1：75)，在4℃的環(huán)境中孵育過夜。次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。陽性對照為NCAPD2陽性染色切片，陰性對照為PBS代替一抗的染色結(jié)果。結(jié)果由2名病理醫(yī)師在雙盲情況下進行評估，根據(jù)著色強度和著色細(xì)胞數(shù)對NCAPD2染色結(jié)果進行評價：(1)著色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)著色細(xì)胞數(shù)：陽性細(xì)胞數(shù)0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分相乘作為最終得分，0～1分為陰性，2～4分為弱陽性，5～7分為中度陽性，≥8分為強陽性。

1.2.3 Nup107檢測 采用免疫組化法檢測Nup107蛋白表達。具體步驟同NCAPD2檢測，一抗為兔抗人Nup107多克隆抗體(1：100)。結(jié)果由兩名病理醫(yī)師在雙盲情況下進行評估，根據(jù)Nup107染色結(jié)果分別賦值0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(中陽性)和3分(強陽性)，組織最終染色得分=(3×強陽性細(xì)胞百分比+2×中陽性細(xì)胞百分比+1×弱陽性細(xì)胞百分比)×100，最終染色評分范圍為0～300。使用X-tile軟件將Nup107表達情況分為高表達或低表達，截斷值為115。

1.3 隨訪 術(shù)后對所有患者進行隨訪調(diào)查，隨訪時間不少于3年，每3個月至少隨訪一次，隨訪方式為院內(nèi)復(fù)查和電話跟蹤為主，隨訪起點為手術(shù)日期，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間滿3年，記錄患者的術(shù)后情況，計算中位生存期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用雙側(cè)t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Cox回歸分析Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達對結(jié)腸癌患者的影響；采用Kaplan-Meier曲線分析Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達情況與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達水平比較 結(jié)腸癌組織的Lnc RNA NR2F1-AS1相對表達量明顯高于癌旁組織，結(jié)腸癌組織的Lnc RNA NR2F1-AS1高表達率、NCAPD2陽性率和Nup107高表達率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1、圖2。

圖1 結(jié)腸組織中NCAPD2表達免疫組化染色結(jié)果(免疫組化SP法，100×)Figure1 Immunohistochemical results of NCAPD2 expression in colon tissue(immunohistochemical SPmethod,100×)

圖2 結(jié)腸組織中Nup表達的免疫組化染色結(jié)果(免疫組化SP法，200×)Figure 2 Immunohistochemical staining results of Nup expression in colon tissue(immunohistochemical SPmethod,200×)

2.2 Lnc RNANR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達與結(jié)腸癌患者臨床資料的關(guān)系 Lnc RNA NR2F1-AS1高表達和低表達患者、NCAPD2陽性患者和陰性患者、Nup107高表達患者和低表達患者在腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移方面比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2～表4。

表1結(jié)腸癌組織和癌旁組織的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達比較[±s，例(%)]Table1 Comparison of theexpression of Lnc RNA NR2F1-AS1,NCAPD2,and Nup107between colon cancer tissuesand adjacent tissues[±s，n(%)]

表1結(jié)腸癌組織和癌旁組織的Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達比較[±s，例(%)]Table1 Comparison of theexpression of Lnc RNA NR2F1-AS1,NCAPD2,and Nup107between colon cancer tissuesand adjacent tissues[±s，n(%)]

組織類型結(jié)腸癌組織癌旁組織t/χ2值P值例數(shù)60 60 Lnc RNA NR2F1-AS1相對表達量1.09±0.28 0.69±0.09 10.535 0.000 Lnc RNA NR2F1-AS1低表達率33(55.00)16(26.67)9.968 0.002 NCAPD2陽性率37(61.67)18(30.00)12.118 0.001 Nup107高表達率42(70.00)19(31.67)17.638 0.001

表2 Lnc RNA NR2F1-AS1表達與結(jié)腸癌患者臨床資料的關(guān)系[例(%)]Table2 Relationship between theexpression of LNC RNA NR2F1-AS1 and clinical data of patientswith colon cancer[n(%)]

表4 Nup107表達與結(jié)腸癌患者臨床資料的關(guān)系[例(%)]Table 4 Relationship between the expression of NUP107 and clinical data of patients with colon cancer[n(%)]

表3 NCAPD2表達與結(jié)腸癌患者臨床資料的關(guān)系[例(%)]Table 3 Relationship between expression of NCAPD2 and clinical data of colon cancer patients[n(%)]

2.3 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的因素 COX回歸分析 結(jié) 果 顯 示，Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2和Nup107表達均是結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)，見表5。

表5 結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響因素COX回歸分析Table 5 COX regression analysis of influencing factors of prognosis of colon cancer patients

2.4 LncRNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，Lnc RNA NR2F1-AS1高表達、NCAPD2陽性和Nup107高表達患者的中位生存期分別低于Lnc RNANR2F1-AS1低表達、NCAPD2陰性和Nup107低表達患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6和圖3～圖5。

圖3 結(jié)腸癌組織Lnc RNA NR2F1-AS1表達與患者預(yù)后的相關(guān)性Figure 3 Correlation between theexpression of Lnc RNA NR2F1-AS1 in colon cancer and theprognosisof patients

圖5 結(jié)腸癌組織Nup107表達與患者預(yù)后的相關(guān)性Figure 5 Correlation between expression of Nup107 in colon cancer and prognosisof patients

表6 結(jié)腸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果Table 6 Kaplan-Meier survival curve analysis results of colon cancer patients

圖4 結(jié)腸癌組織NCAPD2表達與患者預(yù)后的相關(guān)性Figure 4 Correlation between NCAPD2 expression in colon cancer and prognosisof patients

3 討論

結(jié)腸癌是臨床上常見的胃腸道腫瘤，患者的病死率較高，預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅患者的生存和生活質(zhì)量[8]。結(jié)腸癌在發(fā)病初期缺乏典型的臨床特征，尤其是發(fā)生在右半結(jié)腸的腫瘤的早期癥狀極不明顯，多數(shù)患者在確診時已處于晚期。早期診斷與治療對于改善結(jié)腸癌患者的臨床療效及預(yù)后生存都極為有利[9-10]。

長鏈非編碼RNA(Lnc RNA)是指廣泛分布于血液和各大器官組織的非編碼RNA分子，可參與調(diào)控個體發(fā)育、染色體重構(gòu)，細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡、免疫應(yīng)答等過程，在結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中能夠發(fā)揮重要作用[11]。據(jù)報道，Lnc RNA NR2F1-AS1在子宮內(nèi)膜癌中表達異常，在一定程度上對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲、遷移、凋亡等過程發(fā)揮調(diào)控作用[12]。另外，有研究結(jié)果顯示，Lnc RNA NR2F1-AS1在甲狀腺癌組織中表達異常，可能通過調(diào)節(jié)mi RNA-338-3p/細(xì)胞周期蛋白D1軸而促進甲狀腺細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等[13]。

細(xì)胞的異常增殖以及細(xì)胞周期的失衡均是影響惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。NCAPD2是染色體凝縮蛋白復(fù)合物I的亞基之一，參與了細(xì)胞有絲分裂、減數(shù)分裂的染色體組裝和分離[14]，通過激活mTORC1加快細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞自噬，進而促進結(jié)腸癌細(xì)胞的生長、增殖[15]。

Nup107能夠介導(dǎo)凋亡蛋白酶激活因子1的核轉(zhuǎn)位，參與了DNA損傷誘導(dǎo)的基因毒性應(yīng)激過程[16]。Nup107的缺失導(dǎo)致真核細(xì)胞凋亡，干擾Nup107的表達可促使衰老細(xì)胞的生長因子信號通路減弱。據(jù)報道，Nup107能夠在鼻咽癌細(xì)胞間期和有絲分裂期核孔復(fù)合物的形成中發(fā)揮重要作用，從而對腫瘤組織的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程造成一定影響[17]。本研究結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織的Lnc RNA NR2F1-AS1相對表達量明顯高于癌旁正常組織，結(jié)腸癌組織的Lnc RNA NR2F1-AS1表達率、NCAPD2陽性率和Nup107表達率分別為55.00%、61.67%和70.00%，均明顯高于癌旁組織的26.67%、30.00%和31.67%。另外，在腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移上，Lnc RNA NR2F1-AS1高表達和低表達患者、NCAPD2陽性患者和陰性患者、Nup107高表達患者和低表達患者均存在顯著差異。上述結(jié)果表明結(jié)腸癌患者的癌細(xì)胞組織中存在NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107的過度表達，且與結(jié)腸癌患者的腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，上述標(biāo)志物的過度表達可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

本研究還利用COX回歸模型分析了Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2、Nup107表達對結(jié)腸癌患者的影響，結(jié)果顯示，Lnc RNA NR2F1-AS1、NCAPD2和Nup107表達均與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，Lnc RNA NR2F1-AS1高表達、NCAPD2陽性和Nup107高表達患者的中位生存期分別低于Lnc RNA NR2F1-AS1低表達、NCAPD2陰性和Nup107低表達患者，結(jié)果提示結(jié)腸癌患者的NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107過度表達與不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，NCAPD2、Lnc RNANR2F1-AS1、Nup107在結(jié)腸癌中均有不同程度的異常表達，其異常表達與結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后先關(guān)。檢測NCAPD2、Lnc RNA NR2F1-AS1、Nup107的表達情況對于結(jié)腸癌患者的早期診斷和預(yù)后評估具有一定的臨床指導(dǎo)意義。