賀天虎，鄧娟，雷慧，曹云桂

上海市嘉定區(qū)婦幼保健院婦科，上海 201821

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而且其在發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率已經(jīng)和宮頸癌趨平[1]。大量的流行病學(xué)研究提示二甲雙胍能夠降低2型糖尿病患者發(fā)生癌癥風(fēng)險(xiǎn)和癌癥相關(guān)的死亡率[2-3]，隨后許多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究[4-5]進(jìn)一步證實(shí)二甲雙胍對(duì)人體很多組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖和遷徙具有顯著的抑制作用。在婦科腫瘤方面，也有多項(xiàng)基礎(chǔ)研究顯示二甲雙胍能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，并降低其侵襲轉(zhuǎn)移的能力[6-7]，認(rèn)為其有希望成為一種新的抗腫瘤輔助藥物，作用機(jī)制可能與其抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mTOR)通路的活性有關(guān)，但是其更詳細(xì)的抗腫瘤分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。有研究提示二甲雙胍輔助治療有助于將子宮內(nèi)膜非典型增生逆轉(zhuǎn)為正常子宮內(nèi)膜組織，并減少與內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的細(xì)胞增殖生物標(biāo)志物，以及可能提高子宮內(nèi)膜癌的總體生存率[8]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展、腫瘤新生血管的形成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，并且COX-2的抑制劑有可能成為腫瘤治療新的靶點(diǎn)[9]。此外，研究報(bào)道在子宮內(nèi)膜癌的患者中經(jīng)常出現(xiàn)張力蛋白同源第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(PTEN)等基因的改變，但是PTEN基因突變的意義仍然不是非常清楚[10]，有待進(jìn)一步的研究。

為了進(jìn)一步探究二甲雙胍的抗腫瘤作用機(jī)制，本研究擬從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)入手，通過(guò)檢測(cè)不同濃度的二甲雙胍對(duì)4種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞COX-2、VEGF及PTEN表達(dá)的影響，深入探討其可能的抗腫瘤作用機(jī)制，并為二甲雙胍能夠成為一種新的抗腫瘤輔助藥物提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系、RL95-2細(xì)胞系和HEC-1A細(xì)胞系、KLE細(xì)胞系分別購(gòu)自中國(guó)江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司、中國(guó)南京科佰生物科技有限公司和中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司，人COX2-ELISA檢測(cè)試劑盒、人VEGF-ELISA檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自購(gòu)自英國(guó)Abcam生物技術(shù)有限公司(AB267646)和中國(guó)江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司(KGEHC108-1)，PTEN Rabbit antibody購(gòu)自英國(guó)Abcam生物技術(shù)有限公司(AB267787)，不完全RMPI-1640培養(yǎng)基、D/F12培養(yǎng)基和McCoy's培養(yǎng)基及Western blotting其余試劑均購(gòu)自中國(guó)江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組藥物干預(yù) 4種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系分別按照要求常規(guī)培養(yǎng)于特定培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱設(shè)定條件：恒溫37℃、CO2濃度5%、飽和濕度。按照二甲雙胍干預(yù)藥物濃度的不同，將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(0.01 mmol/L組，0.1 mmol/L組，1 mmol/L組，10 mmol/L組)和對(duì)照組(0 mmol/L組)，其中對(duì)照組以等體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替二甲雙胍對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 EILA法檢測(cè)COX-2和VEGF的表達(dá) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后按照3×105/孔的標(biāo)準(zhǔn)接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)一定時(shí)間后用不同濃度的二甲雙胍干預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，24 h后收集相應(yīng)孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢測(cè)。酶標(biāo)包被板分別按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)孔加樣后置37℃溫育90 min。揭掉封板模，洗板后依次加入提前1 h內(nèi)配制的生物素標(biāo)記抗體稀釋液，封板后置于37℃溫育60 min。洗板，加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記親和素工作液，置于37℃溫育30 min。洗板，加底物顯色液顯色。肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品變藍(lán)色后加入終止液。15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀調(diào)零后在450 nm波長(zhǎng)處依次測(cè)量各孔的吸光度(OD值)并以此計(jì)算蛋白濃度。

1.2.3 Western Blotting印跡法檢測(cè)PTEN的表達(dá) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后按照3×105/孔的標(biāo)準(zhǔn)接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)一定時(shí)間后用不同濃度的二甲雙胍干預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，24 h后收集貼壁培養(yǎng)細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白待檢測(cè)。應(yīng)用BCA蛋白測(cè)定試劑盒計(jì)算蛋白含量并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒的要求配置凝膠后依次加樣并電泳分離蛋白。按照“三明治”結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜封閉后予抗體孵育和免疫反應(yīng)。ECL試劑按比例混勻后滴加至PVDF膜表面后室溫靜置，保鮮膜包裹PVDF膜，用化學(xué)發(fā)光成像分析儀曝光，然后進(jìn)行目的條帶的灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞COX-2和VEGF表達(dá)的影響 不同濃度的二甲雙胍干預(yù)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、RL-952、HEC-1A和KLE細(xì)胞24 h后，ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和RL-952細(xì)胞組中4個(gè)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組COX-2和VEGF的表達(dá)隨著二甲雙胍濃度的增加均呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HEC-1A和KLE細(xì)胞組中4個(gè)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組COX-2的表達(dá)隨著二甲雙胍濃度的增加呈下降趨勢(shì)，但是僅有HEC-1A細(xì)胞組中10 mmol/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HEC-1A和KLE細(xì)胞組中4個(gè)實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組VEGF的表達(dá)隨著二甲雙胍濃度的增加均呈明顯下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1和表2。

表1 二甲雙胍對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響(±s)Table 1 Effect of metformin on COX-2 expression in human endometrial cancer cells(±s)

表1 二甲雙胍對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響(±s)Table 1 Effect of metformin on COX-2 expression in human endometrial cancer cells(±s)

注：不同濃度二甲雙胍組與對(duì)照組比較，a P<0.05。Note:Compared with thecontrol group,a P<0.05.

細(xì)胞系種類二甲雙胍濃度分組(mmol/L)COX-2(ng/mL)F/t值P值Ishikawa細(xì)胞RL95-2細(xì)胞HEC-1A細(xì)胞KLE細(xì)胞對(duì)照組0.01 0.1 1 10對(duì)照組0.01 0.1 1 10對(duì)照組0.01 0.1 1 10對(duì)照組0.01 0.1 1 10 9.13±1.03 7.61±0.99 6.91±0.37a 5.84±0.89a 5.61±0.97a 7.76±0.41 7.48±0.58 6.52±0.18a 6.53±0.37a 5.66±0.53a 3.92±0.27 3.62±0.53 3.50±0.47 3.12±0.48 2.88±0.22a 5.58±1.26 4.99±0.14 4.86±0.50 4.72±1.10 4.46±0.38 7.841 1.832 3.498 4.182 4.302 11.119 0.638 4.768 3.883 5.408 3.025 0.878 1.356 2.542 5.187 0.805 0.802 0.921 0.889 1.467 0.004 0.141 0.025 0.014 0.013 0.001 0.532 0.009 0.018 0.006 0.071 0.430 0.246 0.064 0.007 0.549 0.468 0.409 0.424 0.216

表2 二甲雙胍對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響(±s)Table2 Effect of metformin on VEGF expression in human endometrial cancer cells(±s)

表2 二甲雙胍對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響(±s)Table2 Effect of metformin on VEGF expression in human endometrial cancer cells(±s)

注：不同濃度二甲雙胍組與對(duì)照組比較，a P<0.05。Note:Compared with thecontrol group,a P<0.05.

細(xì)胞系種類Ishikawa細(xì)胞RL95-2細(xì)胞HEC-1A細(xì)胞KLE細(xì)胞二甲雙胍濃度分組(mmol/L)對(duì)照組0.01 0.1 1 10對(duì)照組0.01 0.1 1 10對(duì)照組0.01 0.1 1 10對(duì)照組0.01 0.1 1 10 VEGF(ng/mL)59.84±1.26 54.06±0.73a 50.23±0.64a 44.87±0.29a 40.96±0.40a 36.80±1.25 33.21±0.83a 31.04±1.22a 29.09±0.24a 27.66±1.22a 69.19±0.85 66.34±0.29a 62.79±1.76a 61.72±0.74a 57.02±1.05a 28.18±0.66 25.37±0.61a 23.86±1.69a 20.06±1.11a 18.21±0.57a F/t值298.406 6.864 11.760 20.032 24.723 36.615 4.140 5.699 10.493 9.056 58.015 5.468 5.664 11.426 15.566 46.578 5.407 4.138 10.863 19.800 P值0.001 0.002 0.001 0.001 0.001 0.001 0.014 0.005 0.007 0.001 0.001 0.005 0.005 0.001 0.001 0.001 0.006 0.014 0.001 0.001

2.2 二甲雙胍對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的二甲雙胍干預(yù)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、RL-952、HEC-1A和KLE細(xì)胞24 h后，Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，而且促進(jìn)作用呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其對(duì)RL-952、HEC-1A和KLE細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)無(wú)顯著影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 二甲雙胍對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of metformin on PTEN protein expression in endometrial cancer cells

3 討論

近年來(lái)的研究普遍認(rèn)為惡性腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是實(shí)體腫瘤進(jìn)展過(guò)程的關(guān)鍵。而其中COX-2是腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的重要介質(zhì)，并且腫瘤組織中COX-2蛋白的含量與VEGF的陽(yáng)性表達(dá)密切相關(guān)，并認(rèn)為COX-2的抑制劑有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[11]。在婦科惡性腫瘤方面，也有研究發(fā)現(xiàn)異常血管生成在子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，提示血清COX-2的水平可能是子宮內(nèi)膜癌早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的潛在指標(biāo)。同時(shí)研究也證實(shí)，COX-2的表達(dá)是子宮內(nèi)膜癌患者獨(dú)立的臨床病理因素和影響預(yù)后因素[12]，COX-2的抑制劑可能在子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)防和治療中發(fā)揮重要作用[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)4種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(Ishikawa、RL-952、HEC-1A和KLE細(xì)胞)中均存在COX-2和VEGF的高表達(dá)，而且二甲雙胍能夠抑制內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2和VEGF的表達(dá)。COX-2在人體子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)率相較于正常子宮內(nèi)膜組織明顯增強(qiáng)[15-16]，并且子宮內(nèi)膜組織中COX-2的表達(dá)率隨著子宮內(nèi)膜從良性病變-非典型增生-惡性病變的進(jìn)展呈階梯性升高趨勢(shì)[17]，提示COX-2抑制劑可能有助于阻止子宮內(nèi)膜良性病變向侵襲性子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展。也有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)程度與侵襲性參數(shù)和COX-2的表達(dá)率也密切相關(guān)[18]。同時(shí)，COX-2與腫瘤組織中微血管密度(MVD)也存在密切關(guān)系。多項(xiàng)研究[19-20]發(fā)現(xiàn)在人體子宮內(nèi)膜癌組織中COX-2和VEGF的表達(dá)有非常顯著的相關(guān)性，COX-2的表達(dá)增強(qiáng)伴有VEGF蛋白水平的明顯升高、MVD的增加以及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。另有研究指出人體子宮內(nèi)膜癌中VEGF、COX-2的表達(dá)強(qiáng)度與子宮內(nèi)膜癌的病理分級(jí)呈正相關(guān)[21]，而且COX-2的高表達(dá)對(duì)促進(jìn)VEGF的表達(dá)有顯著作用[13，22]。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著二甲雙胍干預(yù)濃度的增加，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2和VEGF的表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示COX-2和VEGF的表達(dá)具有密切相關(guān)性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)較弱，而其余3種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(RL-952、HEC-1A和KLE)則高表達(dá)PTEN，這與李小毛等[23]的研究結(jié)果基本一致。Iglesias等[24]的研究也證實(shí)HEC-1A細(xì)胞高表達(dá)PTEN蛋白，而Ishikawa細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)缺失，這也與本研究的結(jié)果相同。而且，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著二甲雙胍干預(yù)濃度的增加，Ishikawa細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)也呈增強(qiáng)趨勢(shì)，而其對(duì)RL-952、HEC-1A和KLE細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)則無(wú)顯著影響。

眾所周知，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路并非單獨(dú)發(fā)揮作用，而是相互影響形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)共同協(xié)調(diào)人體的各種生理功能。多種生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合通過(guò)PI3K/Akt等信號(hào)通路發(fā)揮作用的同時(shí)也與其他生長(zhǎng)因子受體途徑存在著相互聯(lián)系。既往有研究表明二甲雙胍可以顯著增加子宮內(nèi)膜Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中p-Akt蛋白的表達(dá)，而對(duì)Akt的表達(dá)幾乎無(wú)影響[25]，認(rèn)為二甲雙胍調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路的活性可能是其發(fā)揮抗腫瘤能力的作用機(jī)制之一。同時(shí)，試驗(yàn)證實(shí)通過(guò)PI3K/Akt通路可以激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2和VEGF的表達(dá)[26]。此外，也有研究認(rèn)為人體子宮內(nèi)膜癌中表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2和VEGF的表達(dá)，提示這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的靶蛋白之一。結(jié)合以上研究推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致VEGF表達(dá)的降低，最終抑制內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，推測(cè)這可能是二甲雙胍抗腫瘤的作用機(jī)制之一。

PTEN是抑癌基因，該基因的突變是多種癌癥進(jìn)展過(guò)程的環(huán)節(jié)之一。盡管研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路中PTEN的突變是子宮內(nèi)膜癌中最常見(jiàn)的突變，但是PTEN基因突變?cè)趦?nèi)膜癌中的意義仍不是非常清楚。有研究認(rèn)為PTEN基因失活是子宮內(nèi)膜樣腺癌的主要驅(qū)動(dòng)因素[28]，小鼠模型顯示PTEN的兩個(gè)等位基因的缺失對(duì)于復(fù)雜非典型增生(CAH)的發(fā)展是必要的和充分的，PI3K/Akt通路突變或錯(cuò)配修復(fù)缺陷對(duì)進(jìn)展為癌是必需的，PTEN蛋白低表達(dá)可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展[29-30]。PTEN突變與子宮內(nèi)膜癌(EC)患者的預(yù)后良好相關(guān)，并且與腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞有關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)表明PTEN可能是EC的一個(gè)潛在的預(yù)測(cè)和治療靶點(diǎn)[31]。研究認(rèn)為HOX轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA(HOTAIR)通過(guò)抑制PTEN激活PI3K/Akt通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)程[32]。同時(shí)，也有研究提示PTEN基因缺陷的子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞對(duì)單獨(dú)的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制劑不敏感，而對(duì)復(fù)合型PI3K抑制劑表現(xiàn)出更高的敏感性[33]。而本研究中Ishikawa細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)較弱，同時(shí)二甲雙胍能夠促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，提示在子宮內(nèi)膜樣腺癌中二甲雙胍可能通過(guò)促進(jìn)PTEN的表達(dá)進(jìn)而降低PI3K/Akt通路的活性，最終抑制內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。但是，其余3種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(RL-952、HEC-1A和KLE)中高表達(dá)PTEN，而且二甲雙胍對(duì)其PTEN的表達(dá)無(wú)影響。因此，推測(cè)二甲雙胍促進(jìn)PTEN缺失子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/Akt通路的活性可能是其中重要的抗腫瘤途經(jīng)之一。

綜上所述，二甲雙胍可能通過(guò)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中COX-2與VEGF的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其部分的抗腫瘤作用，推測(cè)其作用可能與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。希望本研究結(jié)果能夠?yàn)槎纂p胍的抗腫瘤作用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。為了得到更詳細(xì)明確的依據(jù)及結(jié)論，有必要開(kāi)展進(jìn)一步基礎(chǔ)研究及前瞻性臨床對(duì)照試驗(yàn)，以了解二甲雙胍輔助治療子宮內(nèi)膜癌前病變及內(nèi)膜癌患者的影響。