周華俊，丁榆德，楊 帆

殼聚糖是由自然界儲(chǔ)量豐富的幾丁質(zhì)經(jīng)酶處理或化學(xué)處理的方法，脫去部分乙酰基后得到的一種有機(jī)高分子材料。它具有生物相容性良好、抗菌等特性[1]。藥劑學(xué)上的微球(圖1)通常是指藥物溶解或分散在納米和微米尺度的球形或類球形物體。微球需使用微球加工技術(shù)制備而成，有更大的比表面積，利于細(xì)胞黏附和增殖，提高藥物的傳送能力，在藥物載體、組織工程學(xué)支架等應(yīng)用方面具有一定優(yōu)勢(shì)[2]。而殼聚糖的可塑性強(qiáng)，是目前制備微球的主要材料之一，可通過乳化交聯(lián)法、離子凝膠法、噴霧干燥法、凝聚沉淀法加工成殼聚糖基微球(chitosan-based microspheres，CBM)[3-6]。口腔作為一個(gè)特殊的“外環(huán)境”，局部用藥容易受進(jìn)食以及唾液的影響，維持藥物足夠的緩釋時(shí)間往往是治療的難點(diǎn)?？谇唤M織缺損修復(fù)是一個(gè)周期性的過程，持續(xù)的藥物釋放對(duì)于組織反應(yīng)的誘導(dǎo)作用更具有長(zhǎng)效性。這就十分考驗(yàn)口腔用藥載體的性能。CBM是一種易于加工，且具備良好載藥性能的藥物載體，同時(shí)，在口腔組織再生領(lǐng)域中還能起到支架的作用。目前，CBM在口腔臨床中的應(yīng)用仍處于基礎(chǔ)研究階段，尚未真正應(yīng)用于臨床。本文就目前國內(nèi)外對(duì)于CBM在口腔頜骨組織缺損、牙周病損、牙體牙髓病變及神經(jīng)組織損傷治療方面的研究進(jìn)展作一綜述，為后續(xù)研究及最終實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用提供參考。

圖1 沉淀法制備的殼聚糖微球電鏡觀察

1 CBM在頜骨缺損修復(fù)中的作用研究

1.1 CBM搭載生長(zhǎng)因子

用有機(jī)高分子材料作為骨再生支架，一直是頜骨缺損修復(fù)的研究熱點(diǎn)。殼聚糖良好的生物相容性、可降解性、無毒性及抗菌活性使其受到眾多學(xué)者關(guān)注和研究[7-9]。另外，微球可以負(fù)載蛋白類生長(zhǎng)因子，并起到保護(hù)和緩控釋生長(zhǎng)因子的作用[10]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是成骨生長(zhǎng)因子之一，其骨誘導(dǎo)能力得到了動(dòng)物學(xué)以及人類臨床研究的證實(shí)[11-12]。為了延長(zhǎng)BMP-2的釋放時(shí)間，Xia等[13]采用離子凝膠法制備硫酸葡聚糖殼聚糖微球的載藥系統(tǒng)，相對(duì)于單純殼聚糖微球，陰離子硫酸葡聚糖先與BMP-2結(jié)合，再與陽離子殼聚糖攪拌成球，實(shí)現(xiàn)了更高的蛋白質(zhì)包封率和加載比。同時(shí)，使得保持活性的BMP-2從該微球中持續(xù)釋放超過20 d。另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了載BMP-2的CBM在雄性大鼠體內(nèi)的異位成骨能力，證實(shí)殼聚糖/BMP-2微球系統(tǒng)顯著增強(qiáng)了BMP-2對(duì)異位成骨的誘導(dǎo)和促進(jìn)作用[14]。這些研究結(jié)果均提示利用CBM搭載BMP-2在臨床修復(fù)骨缺損方面具有巨大的潛力。

但是，單純殼聚糖微球本身機(jī)械強(qiáng)度不足，單獨(dú)載藥使用時(shí)，無法有效維持骨增量空間。于是，學(xué)者們嘗試將殼聚糖復(fù)合其他材料，來提高骨增量過程中材料的機(jī)械性能，在調(diào)控載藥微球緩釋效率的同時(shí)，保證成骨過程的空間[15-16]。例如，Thangavelu等[15]通過離子交聯(lián)微球技術(shù)對(duì)現(xiàn)有植骨材料的再加工，混合雙相磷酸鈣，來提高CBM的力學(xué)性能，并證明其相較單純CBM具備更佳的骨傳導(dǎo)性能。Sobhani等[16]制備了一種新型磷酸鈣/聚磷腈多孔支架，與采用乳液離子法制備且載有BMP-2的CBM結(jié)合，研究其在骨缺損修復(fù)中的效果。研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)支架相比，載有BMP-2的支架既增加了細(xì)胞的成骨分化潛能，又克服了單純殼聚糖微球作為成骨材料強(qiáng)度不足的缺點(diǎn)，還改善了微球搭載BMP-2突釋的問題，為最終實(shí)現(xiàn)CBM搭載生長(zhǎng)因子的臨床應(yīng)用提供了新方式。

1.2 CBM增強(qiáng)屏障膜強(qiáng)度

在骨缺損修復(fù)中，屏障膜也是必不可少的材料之一。在骨缺損區(qū)填充骨材料后，表面覆蓋的屏障膜起到阻止成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入的作用，使得成骨細(xì)胞有充足的時(shí)間長(zhǎng)入成骨材料之間進(jìn)行骨組織重建。但是，現(xiàn)在使用的膠原屏障膜經(jīng)常存在強(qiáng)度不足的問題，在骨引導(dǎo)再生(bone guided regeneration，GBR)過程中無法維持良好的成骨空間。而CBM在復(fù)合加入屏障膜的結(jié)構(gòu)中后，不僅可以作為屏障膜中的藥物載體，同時(shí)也大大提升了膜的強(qiáng)度。有學(xué)者將納米羥基磷灰石/CBM加入殼聚糖膜中，發(fā)現(xiàn)它的抗斷裂強(qiáng)度是單純殼聚糖膜的3倍[17]?？梢娺@種屏障膜在引導(dǎo)骨再生的應(yīng)用中具有一定的前景?？梢酝茰y(cè)，CBM的添加，使得屏障膜的強(qiáng)度得到提升，可減少臨床技術(shù)敏感性，使骨增量的療效更具可預(yù)期性。

1.3 改性CBM雙相載藥功能

殼聚糖還可通過接枝羧基改性，經(jīng)氯乙酸醚化后，得到水溶性的殼聚糖衍生物，提高成球后的降解速率。微球在控釋藥物的方面具有可注射性、低毒、高效等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在小鼠骨愈合過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)在早期達(dá)到峰值，而BMP-2表達(dá)在后期達(dá)到峰值[18-19]。Dou等[20]采用乳液法并用香草醛交聯(lián)制備羧甲基殼聚糖微球，以微球和膠原分別載藥，構(gòu)建了具有BMP-2和VEGF雙因子復(fù)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)緩釋系統(tǒng)，支架實(shí)現(xiàn)了雙因子的順序釋放，VEGF和BMP-2雙因子的支架比僅有BMP-2的支架組有更多的膠原蛋白組織和新血管形成，最終促進(jìn)成骨作用。多因子的協(xié)同作用可以降低藥物使用劑量，增強(qiáng)療效。利用CBM載藥功能可達(dá)到多因子協(xié)同作用，為實(shí)現(xiàn)高效的骨再生提供了新方法。

2 CBM在牙周病損中的修復(fù)中的作用研究

2.1 CBM搭載抗菌藥物

牙周疾病中，牙周或種植體周的炎癥反應(yīng)伴隨始終，疾病末期還會(huì)出現(xiàn)骨喪失的現(xiàn)象。臨床中的非手術(shù)治療手段包括牙周基礎(chǔ)治療和藥物治療，而針對(duì)牙周袋這種局部的感染，局部用藥往往能避免全身用藥并發(fā)癥，并獲得一定的療效[21-22]。但是，牙周袋內(nèi)的局部用藥會(huì)受到口腔環(huán)境的影響，唾液的沖刷、稀釋作用都會(huì)導(dǎo)致藥效維持時(shí)間過短，無法獲得滿意的療效。而CBM所具有的載藥性能、黏膜黏附性能，正是牙周局部用藥所需要的特性[23]。Yadav等[23-24]先采用離子凝膠法載抗菌藥的CBM，后又改良加入海藻酸鈉，控制了微球突釋，延長(zhǎng)了藥物釋放時(shí)間，都驗(yàn)證了兩種微球在黏膜的黏附和釋藥作用，且擁有抗菌活性，為牙周今后的局部用藥研究提供了新的思路。

隨著種植體的廣泛使用，種植體周圍炎的發(fā)病率逐年增高。種植體周圍炎的抗菌治療與牙周炎的治療方式相似，但因?yàn)榉N植體特殊的納米表面特征，種植體周機(jī)械清創(chuàng)的效果比牙周差，更需要抗菌藥物的協(xié)同作用。Yoon等[25-26]進(jìn)行了載米諾環(huán)素的殼聚糖-海藻酸鈉微球(chitosan-alginate，CA)用于比格犬種植體周圍炎和種植體黏膜炎的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該微球表現(xiàn)出了長(zhǎng)而持久的抑菌效果。對(duì)于動(dòng)物種植體周的炎癥治療，聚丙烯酸酯甘油微球(polyacrylate-glycerin，PG)組在第14天已無藥物殘留，CA組可以檢測(cè)到藥物。體外抗菌實(shí)驗(yàn)中，CA組的抗菌時(shí)間為(7.0±5.7)d，而PG組為(1.2±2.6)d。說明CA在藥物緩釋時(shí)間和抗菌能力上更具優(yōu)勢(shì)。該載藥系統(tǒng)在未來臨床上有希望成為重要的輔助治療手段。

2.2 CBM的支架作用

牙周炎發(fā)生后導(dǎo)致的牙槽骨吸收是臨床中最常見的并發(fā)癥。因此，牙周炎的治療不僅要對(duì)牙周的感染進(jìn)行控制，臨床工作者更希望控制感染的同時(shí)，能對(duì)喪失的牙槽骨進(jìn)行牙周組織的引導(dǎo)再生。關(guān)于牙周組織再生的文獻(xiàn)主要圍繞干細(xì)胞與其他支架展開相關(guān)研究，但CBM與牙周組織再生相關(guān)的研究報(bào)道較少。目前牙周再生目標(biāo)是引導(dǎo)具有再生能力的細(xì)胞重新修復(fù)缺損區(qū)并建立新的牙周附著[27]。Inan?等[28]將人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)加載到殼聚糖-羥基磷灰石微球上后，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出一定的成骨分化潛能，并觀察到hPDLFs在體外誘導(dǎo)后能夠在二維和三維培養(yǎng)條件下進(jìn)行成骨分化，因此認(rèn)為在微重力生物反應(yīng)器中的殼聚糖-羥基磷灰石微球可作為合適的三維環(huán)境來支持體外hPDLFs的成骨分化，該實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CBM能夠作為支架，具有引導(dǎo)牙周組織再生的潛能。但目前的研究仍處于基礎(chǔ)階段，要實(shí)現(xiàn)牙周膜成纖維細(xì)胞的組織再生或建立牙周重新附著的目標(biāo)還有很長(zhǎng)的路要走。

3 CBM在牙體牙髓病損的治療中的作用研究

3.1 CBM搭載氟輕松和生長(zhǎng)因子

牙齒發(fā)育有不同的階段，年輕恒牙期的牙根還未發(fā)育完全，但可能會(huì)因?yàn)橥鈧?、齲病等原因，導(dǎo)致牙髓炎癥，甚至是根尖周炎。為了促使根尖繼續(xù)發(fā)育，解決牙根抗力差的問題，以氫氧化鈣為基礎(chǔ)的根尖誘導(dǎo)成形術(shù)是目前臨床廣泛使用的治療方法之一。但其治療周期長(zhǎng)，需要多次換藥，從而有增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[29]。研究已證明BMP-2能夠誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，形成牙本質(zhì)[30]?，F(xiàn)有學(xué)者將CBM作為生長(zhǎng)因子載體應(yīng)用于牙本質(zhì)誘導(dǎo)的研究。持續(xù)炎癥存在會(huì)影響骨形成，Niu等[31]基于此開發(fā)了一種共聚乳酸-CBM，它是由共聚乳酸-殼聚糖的納米球先包裹疏水性藥物氟輕松，再混合親水性生物分子BMP-2，由三聚磷酸鹽交聯(lián)成微球，并可同時(shí)抑制炎癥和促進(jìn)牙體組織礦化相關(guān)因子的表達(dá)。該微球載藥平臺(tái)有望能控制年輕恒牙的感染和促進(jìn)組織發(fā)育，為根尖發(fā)育不足的誘導(dǎo)治療提供了新思路，也是一種同時(shí)搭載疏水藥物與親水藥物的優(yōu)良載體。

3.2 CBM搭載轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

牙體組織缺損是臨床常見的疾病之一，醫(yī)生常使用的是氫氧化鈣和生物陶瓷作為蓋髓材料，保留牙髓組織，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。已有研究證明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以作為蓋髓劑誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成[32]。Li等[33]采用乳液交聯(lián)法制備含TGF-β1的CBM，且微球被雙層殼聚糖膜所包被，它由一側(cè)的致密膜和另一側(cè)的大孔海綿組成。其原理是使用致密的薄膜來阻止細(xì)菌入侵穿孔的牙髓，并使用含有TGF-β1的微球加載到多孔海綿進(jìn)行緩釋。該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到含有TGF-β1的微球產(chǎn)生的修復(fù)牙本質(zhì)厚度比不含TGF的商用Dycal或殼聚糖雙層膜厚3～6倍，具有更顯著的修復(fù)牙本質(zhì)療效。因此，利用CBM包含TGF-β1的新型牙科材料有可能是實(shí)現(xiàn)牙髓組織再生的新選擇。

4 CBM在神經(jīng)組織損傷修復(fù)中的作用研究

4.1 CBM搭載神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)

腮腺與面神經(jīng)的解剖位置關(guān)系緊密，口腔頜面外科手術(shù)中，常因腮腺腫瘤的切除造成面神經(jīng)功能障礙進(jìn)而影響生活質(zhì)量。目前，自體神經(jīng)移植是治療周圍神經(jīng)損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍有很多的局限性。所以人工神經(jīng)移植物仍在研究中，而殼聚糖是人工移植物材料之一[34]。人工神經(jīng)移植物也需要生長(zhǎng)因子的幫助。NGF具有促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)、保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)再生、引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)作用[35]。Zeng等[36-37]采用乳液離子交聯(lián)法制備了載NGF的CBM，發(fā)現(xiàn)其具有7 d持續(xù)釋放NGF的能力。然后，將該CS微球加入具有縱向微通道的膠原-殼聚糖支架，其持續(xù)釋放生物活性NGF的時(shí)間提升至28 d。Zeng等[38]又進(jìn)一步改良，制備了負(fù)載NGF的殼聚糖/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)復(fù)合微球，再一次延長(zhǎng)緩釋時(shí)間，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了殼聚糖/PLGA-NGF微球能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)再生并阻止了腓腸肌萎縮。在神經(jīng)修復(fù)再生的研究領(lǐng)域中，CBM在控釋生長(zhǎng)因子方面有一定的優(yōu)勢(shì)，利用殼聚糖的載體作用，有可能推動(dòng)該研究領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。生物3D打印機(jī)可以模擬人體組織微觀結(jié)構(gòu)，通過3D打印技術(shù)制作的多孔纖維結(jié)構(gòu)較傳統(tǒng)膠原類材料更利于細(xì)胞生長(zhǎng)爬行，利于軟組織修復(fù)[39]。結(jié)合3D打印技術(shù)，載藥CBM結(jié)合生物支架將可能在神經(jīng)修復(fù)再生領(lǐng)域有更優(yōu)異的表現(xiàn)。

4.2 CBM負(fù)載促神經(jīng)修復(fù)作用的中藥提取成分

口腔診療過程中，周圍神經(jīng)的損傷發(fā)生率較高。神經(jīng)損傷后的治療以營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的全身藥物為主，但臨床療效不佳。川芎嗪在修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損方面有顯著作用[40]，并在神經(jīng)性疼痛方面有療效[41]。趙紅斌等[42]通過乳液交聯(lián)法制備CBM加載川芎嗪，并與膠原蛋白混合制成神經(jīng)導(dǎo)管，發(fā)現(xiàn)微球釋放的川芎嗪可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)，為進(jìn)一步的動(dòng)物神經(jīng)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)，但對(duì)于臨床的適用性仍需要更多的研究和改良。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，CBM擁有可靠的負(fù)載生長(zhǎng)因子、抗菌藥等藥物的能力，并且有可調(diào)控的緩釋能力[43]。CBM還可以保護(hù)藥物，減少環(huán)境改變對(duì)藥物的影響，克服局部用藥的局限性，也可避免部分藥物并發(fā)癥。殼聚糖可以混合不同的材料，例如明膠、海藻酸鈉、PLGA等，并運(yùn)用不同的技術(shù)制備出形態(tài)各異、功能不同的CBM。也因此，CBM的包封率相差較大，緩釋效果也有差別。在CBM的制作工藝上，大部分方法都使用了有毒的有機(jī)溶劑，以及納米級(jí)微球?qū)θ梭w可能存在潛在的毒害作用，且制備納米級(jí)微球往往需要用到復(fù)雜的設(shè)備，這都不利于大規(guī)模的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。在口腔領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究已有一定的成果，在臨床試驗(yàn)前，試劑還需要進(jìn)一步研究，使其安全且便捷。CBM緩釋系統(tǒng)中的藥物定量研究較少，精準(zhǔn)控釋藥物會(huì)是未來的研究方向。相信在不久的將來，通過技術(shù)改良，試劑研發(fā)以及技術(shù)之間的交叉應(yīng)用，各種困難將會(huì)被逐一克服。