呂廣瑞，吳 龍?，戴曉勇，徐 慶，李占勇

（天津科技大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，天津市輕工與食品工程機(jī)械裝備集成設(shè)計(jì)與在線(xiàn)監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市低碳綠色過(guò)程裝備國(guó)際聯(lián)合研究中心，天津 300222）

精釀啤酒是世界上廣泛流行的飲料，2022年上半年，我國(guó)新增精釀啤酒相關(guān)企業(yè)1 645家，同比增加 21.8%[1]。近年來(lái)，精釀啤酒企業(yè)數(shù)量也出現(xiàn)了顯著增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2025年中國(guó)精釀啤酒消費(fèi)量可達(dá)26億L[2-3]。與傳統(tǒng)工業(yè)啤酒相比，精釀啤酒具有原料選擇精細(xì)、風(fēng)味多樣的特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[4]。精釀啤酒在生產(chǎn)過(guò)程中，其口感和新鮮程度會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致啤酒品質(zhì)的劣變，從而容易產(chǎn)生細(xì)菌[5]。精釀啤酒的品質(zhì)與生產(chǎn)工藝、儲(chǔ)備環(huán)境等相關(guān)，直接影響企業(yè)的品牌信譽(yù)，以及消費(fèi)者的接受程度[6]。因此，這就需要合適的殺菌方式對(duì)精釀啤酒進(jìn)行殺菌并且保證品質(zhì)。

目前，精釀啤酒通過(guò)傳統(tǒng)的熱殺菌方式會(huì)使其品質(zhì)受到很大的影響，不能保證口感及品質(zhì)。目前，一些新型殺菌技術(shù)對(duì)精釀啤酒的殺菌逐漸流行起來(lái)，例如超高壓[7]和高溫瞬時(shí)技術(shù)[5]對(duì)精釀啤酒的殺菌都有很好的效果。張帆[7]等利用超高壓處理工坊啤酒可有效地殺滅有害微生物并且保證其品質(zhì)。低溫等離子體是一種比較新穎的滅菌技術(shù)，其殺菌的機(jī)制主要包括紫外線(xiàn)、電場(chǎng)和活性氧氮等殺菌物質(zhì)的作用[8-11]。馬良軍[12]等利用介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體在70 kV、150 s能夠完全殺滅腸炎沙門(mén)氏菌。劉雅夫等[13]使用低溫等離子體處理金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的殺菌率分別為 90.00%和 98.99%。關(guān)于等離子體在果蔬汁方面的研究很多，比如獼猴桃汁[14]，蘋(píng)果汁[15]，梨汁[16]等，但低溫等離子體技術(shù)處理精釀啤酒的相關(guān)研究尚無(wú)報(bào)道。

本文采用等離子體殺菌裝置，研究了對(duì)精釀啤酒殺菌率及理化性質(zhì)的影響，并與巴氏殺菌進(jìn)行對(duì)比。探究等離子體在不同電壓和處理時(shí)間條件下對(duì)啤酒中菌落總數(shù)、大腸桿菌、酵母菌的影響；在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化等離子體殺菌條件，并在最佳條件下處理精釀啤酒，為低溫等離子體殺菌技術(shù)在精釀啤酒中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

精釀啤酒：某生啤酒；塑料培養(yǎng)皿：湖南比克曼生物科技有限公司；無(wú)菌膠頭滴管：常德比克曼生物科技有限公司；錐形瓶、玻璃棒、燒杯：江蘇華歐玻璃有限公司；結(jié)晶紫中性紅膽鹽、孟加拉紅培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂，均為分析純：北京奧博星生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G-135電子天平：常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；HSP-150BE恒溫恒濕培養(yǎng)箱、LSH-18B高壓蒸汽滅菌鍋、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、SW-CJ-1G型單人雙面凈化工作臺(tái)：上海力辰邦西儀器科技有限公司；分光測(cè)色儀：深圳市三恩時(shí)科技有限公司；DIPump550-B163蠕動(dòng)泵：卡川爾流體科技（上海）有限公司；低溫等離子體發(fā)生器：南京蘇曼等離子體科技有限公司；啤酒泡持杯：朗鑫化玻璃儀器有限公司；pH-6011筆式pH計(jì)：臺(tái)灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司。

1.3 內(nèi)容與方法

1.3.1 精釀啤酒的準(zhǔn)備

（1）精釀啤酒：采用未經(jīng)處理的青島原產(chǎn)地精釀啤酒，作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照。

（2）巴氏殺菌：70 ℃條件下水浴加熱30 min。

（3）低溫等離子體殺菌：分別在處理時(shí)間5、10、15 s，電壓為30、35、40、45、50 kV，考察等離子體對(duì)精釀啤酒的殺菌效果，此時(shí)N2流速為60 mL/min。每個(gè)條件做3次取平均值。

1.3.2 等離子體裝置

本文采用自行設(shè)計(jì)的低溫等離子體殺菌裝置由高壓電源、低溫等離子發(fā)生器、介質(zhì)阻擋反應(yīng)器、蠕動(dòng)泵、N2瓶等輔助設(shè)備組成，如圖1。精釀啤酒放置在玻璃瓶中，流動(dòng)速度及等離子體處理時(shí)間通過(guò)蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)。等離子體放電殺菌反應(yīng)器裝置是使用石英材料設(shè)計(jì)的反應(yīng)釜（長(zhǎng)140 mm，寬60 mm，高10 mm），石英介質(zhì)厚度為1 mm。等離子體放電電極采用鋁型材料（長(zhǎng)80 mm，寬60 mm，高18 mm），放電電極分別于電源的輸出端相連，絕緣介質(zhì)套于電極外部，兩電極間的最大間距為10 mm。出料口連接玻璃瓶進(jìn)行收集，氣體排出口與通風(fēng)櫥相連接。

圖1 等離子體殺菌裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasma sterilization device

以精釀啤酒為原料，選擇500 mL的透明玻璃瓶將其放入高壓滅菌鍋滅菌。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前使用紫外線(xiàn)燈在超凈工作臺(tái)照射30 min后，使用熱水流通整個(gè)裝置進(jìn)行滅菌。待冷卻后開(kāi)啟等離子發(fā)生器及操作系統(tǒng)預(yù)熱1 min并通入氮?dú)?，將精釀啤酒裝入500 mL玻璃瓶，開(kāi)啟蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)流速計(jì)算等離子體殺菌時(shí)間，其處理時(shí)間為 5、10、15 s。等離子體處理電壓為 30、35、40、45、50 kV。殺菌完成后立即進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，同時(shí)進(jìn)行微生物和品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.3 微生物檢測(cè)

選取菌落總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌作為微生物指標(biāo)。菌落總數(shù)的細(xì)菌檢測(cè)根據(jù) GB_4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。酵母菌的檢測(cè)根據(jù) GB_4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》。大腸桿菌的檢測(cè)根據(jù) GB_4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸桿菌計(jì)數(shù)》。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以電壓、處理時(shí)間、氣體流速為工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以菌落總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌以及亮度為響應(yīng)值，通過(guò)等高線(xiàn)圖、響應(yīng)面圖以及ANOVA進(jìn)行分析，以–1、0、+1進(jìn)行編碼，如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平Table 1 Response surface factor levels

1.3.5 pH值的測(cè)定

將待測(cè)的精釀啤酒搖勻除氣后，取30 mL于燒杯中，使用pH計(jì)在室溫下測(cè)定其pH值。每次處理取3瓶樣品測(cè)定，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

1.3.6 色度的測(cè)定

采用色差儀測(cè)定精釀啤酒的色澤，將除氣后的精釀啤酒搖勻后置于25 mL的比色杯中，測(cè)定總色差 ΔE[17]。具體操作方法參考 GB/T_4928—2008《啤酒分析方法》。

1.3.7 泡持性的測(cè)定

利用讀秒法，其原理是用目視法測(cè)定泡沫消失的速度，以秒表示。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%[18]。具體操作方法參考 GB/T_4928—2008《啤酒分析方法》。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用 Origin9.0軟件、Design Expert軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 未經(jīng)殺菌處理的精釀啤酒中微生物含量

啤酒中常見(jiàn)的菌種有酵母菌和大腸桿菌，酵母菌是啤酒發(fā)酵過(guò)程中比較常見(jiàn)的一個(gè)菌種，富含酵母菌易導(dǎo)致酒液微生物系統(tǒng)不穩(wěn)定；大腸菌群是較理想的水體受糞便污染的指示菌，微生物超標(biāo)導(dǎo)致啤酒易變質(zhì)[19]。表2結(jié)果顯示，菌落總數(shù)及大腸桿菌含量均超過(guò)啤酒微生物限量（菌落總數(shù)≤30 cfu/mL，大腸桿菌≤15 cfu/mL）。

表2 精釀啤酒中微生物檢測(cè)結(jié)果Table 2 Microbiological detection results in craft beer cfu/mL

2.2 等離子體電壓對(duì)精釀啤酒殺菌的影響

分別在保壓時(shí)間 5、10、15 s，氮?dú)饬魉?0 mL/min條件下，探究等離子體處理電壓為30、35、40、45、50 kV對(duì)精釀啤酒中菌落總數(shù)、大腸桿菌和酵母菌的影響。

2.2.1 不同處理時(shí)間對(duì)精釀啤酒殺菌的影響

如圖2（a）所示，當(dāng)電壓為40 kV，時(shí)間為5 s時(shí)，菌落總數(shù)的殺菌率為81.2%；時(shí)間為10 s時(shí)，菌落總數(shù)被完全殺滅。說(shuō)明隨著處理時(shí)間的增加，菌落總數(shù)減少速率增大。馬良軍等[12]也得到了類(lèi)似的結(jié)論，處理時(shí)間的增加能增強(qiáng)等離子體的殺菌效果。由圖2（b）可知，在電壓大于40 kV，時(shí)間僅用5 s就可以有很好的殺菌效果，殺菌率可以達(dá)到95%。國(guó)標(biāo)中未對(duì)酵母菌含量有明確的要求，但是過(guò)多的酵母菌會(huì)使精釀啤酒變質(zhì)和有異味，影響其品質(zhì)和口感。由于圖2（b）和圖2（c）中大腸桿菌含量幾乎相同，從而導(dǎo)致線(xiàn)條重疊。從圖2（c）中可以看出，當(dāng)電壓為30 kV時(shí)，處理時(shí)間從5 s和10 s大腸桿菌濃度含量的變化很大，因?yàn)樵诙虝r(shí)間等離子體釋放的殺菌成分較少，到達(dá)一定時(shí)間后，活性成分釋放量不斷增加使得大腸桿菌被殺滅[20]。

圖2 不同處理時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)（a）、酵母菌（b）、大腸桿菌（c）的殺菌效果Fig.2 Bactericidal effects of different treatment times on the total number of colonies (a),yeast (b) and Escherichia coli (c)

2.2.2 不同電壓對(duì)精釀啤酒殺菌的影響

由圖3（a）可知，當(dāng)時(shí)間為10 s，電壓為30 kV，菌落總數(shù)的含量減少到460 cfu/mL，電壓為40 kV時(shí)，減少到15 cfu/mL?？梢钥闯鲭S著電壓的增大菌落總數(shù)減少速率逐漸增加。可能由于電壓的增加，使得等離子體產(chǎn)生高速離子對(duì)細(xì)菌的穿透作用導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。圖3（b）中，當(dāng)時(shí)間為5 s，電壓從30 kV增加到40 kV，酵母菌的殺菌率從51%增加到 96%。表明高壓使微生物細(xì)胞膜被電擊穿，產(chǎn)生不可修復(fù)的穿孔或破裂，使細(xì)胞組織受損，導(dǎo)致微生物失活，而達(dá)到殺菌效果[21]。從圖3（c）可以看出，由于精釀啤酒中大腸桿菌的含量較少，當(dāng)時(shí)間≥10 s，電壓≥35 kV時(shí)，大腸桿菌已經(jīng)被完全殺滅。其原因可能是由于等離子體含有大量活性物，通過(guò)氧化作用引起大腸桿菌的死亡。孫艷[22]等發(fā)現(xiàn)等離子體電壓對(duì)殺菌效率有顯著影響，電壓增高，殺菌率增大。

圖3 不同電壓對(duì)菌落總數(shù)（a）、酵母菌（b）、大腸桿菌（c）的殺菌效果Fig.3 Bactericidal effects of different voltages on the total number of colonies (a), yeast (b) and Escherichia coli (c)

2.2.3 精釀啤酒微生物檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，精釀啤酒中菌落總數(shù)和大腸桿菌都超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)限值。國(guó)標(biāo)中未對(duì)酵母菌含量進(jìn)行限制，但是過(guò)多的酵母菌會(huì)使啤酒持續(xù)發(fā)酵，從而導(dǎo)致啤酒腐敗。等離子體殺菌（電壓45 kV、處理時(shí)間10 s和氮?dú)饬魉?0 mL/min）和巴氏殺菌（70 ℃和處理時(shí)間30 min）都有很好的殺菌作用，菌落總數(shù)和大腸桿菌均未檢測(cè)出，等離子體殺菌中酵母菌的殺菌率達(dá)到97.96%，而巴氏殺菌對(duì)酵母菌的殺菌率為99.99%。

表3 不同處理微生物檢測(cè)結(jié)果Table 3 Microbial detection results of different treatments cfu/mL

2.3 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒓帮@著性檢驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化處理?xiàng)l件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取處理電壓、處理時(shí)間和處理極距氣體流速對(duì)精釀啤酒中菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌殺菌率及亮度影響顯著的因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。表4列出了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果，表5列出了亮度的響應(yīng)面方差分析結(jié)果。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of response surface

表5 亮度響應(yīng)面方差結(jié)果Table 5 Brightness response surface variance results

由表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到二次多項(xiàng)回歸方程見(jiàn)公式：

式中A為電壓，kV；B為時(shí)間，s；C為氣體流速，mL/min

由表4可知，回歸模型顯著，說(shuō)明該方程擬合得較好。表5顯示一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)AB、AC、二次項(xiàng)A2是極顯著的。各因素對(duì)亮度的影響由強(qiáng)到弱依次電壓＞時(shí)間＞氣體流速。

2.4 等離子體殺菌效果響應(yīng)面分析

應(yīng)用Design Expert軟件，分析電壓、時(shí)間和氣體流速三因素對(duì)菌落總數(shù)、酵母菌、大腸桿菌以及亮度影響。

圖4為電壓與時(shí)間作用對(duì)菌落總數(shù)的影響，由圖可以看出，菌落總數(shù)的含量隨著電壓和殺菌時(shí)間的增加而減少，且電壓對(duì)菌落總數(shù)殺菌率影響比時(shí)間更加顯著。當(dāng)電壓從 30 kV增加到40 kV，時(shí)間為10 s、氣體流速為60 mL/min，其他參數(shù)不變，菌落總數(shù)減少了415 cfu/mL。

圖4 殺菌時(shí)間與電壓響應(yīng)面和等高線(xiàn)對(duì)菌落總數(shù)含量的影響Fig.4 Influence of sterilization time, voltage response surface and contour on total colony content

圖5可以看出，溫度和電壓對(duì)殺菌效果的影響接近，電壓40 kV，時(shí)間為10 s時(shí)，菌落總數(shù)的含量下降約80%，當(dāng)電壓上升到50 kV，時(shí)間為10 s，菌落總數(shù)則下降至0，這表明，隨著電壓的增大，殺菌效果增強(qiáng)趨勢(shì)顯著。當(dāng)電壓固定在40 kV，時(shí)間為15 s時(shí)，菌落總數(shù)的含量下降約95%，顯然，處理時(shí)間對(duì)殺菌效果有一定影響。

圖5 殺菌時(shí)間與電壓響應(yīng)面和等高線(xiàn)對(duì)酵母菌含量的影響Fig.5 Effect of sterilization time and voltage response surface and contour on yeast content

由圖6可知，響應(yīng)面顯示斜面較傾斜，表明電壓和時(shí)間的交互作用顯著。由于精釀啤酒中大腸桿菌含量較少，并且等離子體對(duì)大腸桿菌的殺菌作用比較強(qiáng)，因此在氮?dú)饬魉僖欢〞r(shí)，殺菌效果隨著電壓和時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)。

圖6 殺菌時(shí)間與電壓響應(yīng)面和等高線(xiàn)對(duì)大腸桿菌含量的影響Fig.6 Effects of sterilization time, voltage response surface and contour on E. coli content

圖7為等離子殺菌對(duì)亮度的影響，亮度可以觀察出精釀啤酒的外觀評(píng)價(jià)?？梢钥闯隽炼入S著時(shí)間和電壓的升高而降低。當(dāng)電壓為30 kV、時(shí)間為5 s時(shí)，亮度為37 cd/m2。當(dāng)電壓為50 kV、時(shí)間為10 s時(shí)，亮度為33 cd/m2?？梢钥闯鲭妷汉蜁r(shí)間對(duì)精釀啤酒的亮度有一定影響。

圖7 殺菌時(shí)間與電壓響應(yīng)面和等高線(xiàn)對(duì)亮度的影響Fig.7 Effect of sterilization time and voltage response surface and contour on brightness

通過(guò)響應(yīng)面方差分析，該模型為極顯著模型，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合較好。利用已建立的數(shù)學(xué)模型在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)優(yōu)化出最優(yōu)條件為：電壓40 kV，時(shí)間10 s，氣體流速60 mL/min，各因素影響大小為電壓＞時(shí)間＞氣體流速。在此條件下，菌落總數(shù)為13 cfu/mL（符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌落總數(shù)濃度＜30 cfu/mL）、酵母菌含量為460 cfu/mL、大腸桿菌含量為 0，以及亮度為 36 cd/m2。精釀啤酒中保留少量的酵母菌可以保持口感和品質(zhì)，菌落總數(shù)和大腸桿菌達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 色度和泡持度分析結(jié)果

由表6可知，色度物質(zhì)的含量主要與色素和制取的條件有關(guān)。其等離子體處理?xiàng)l件為電壓40 kV、時(shí)間10 s和氣體流速60 mL/min，巴氏殺菌處理?xiàng)l件為處理溫度 70 ℃，時(shí)間 30 min。啤酒色度由L*、a*和b*值計(jì)算得出色差值ΔE，可以看出這種精釀啤酒屬于濃色啤酒[17]。三者經(jīng)過(guò)對(duì)比，等離子體殺菌處理后和未經(jīng)處理的精釀的色度比較相近。泡持性是啤酒泡沫能維持的時(shí)間，啤酒中的表面活性物質(zhì)能降低表面張力，可以使泡沫更加持久，泡持性越長(zhǎng)越好?？梢钥闯霭褪蠚⒕莩中员任刺幚淼木勂【婆莩中詼p少了一半，說(shuō)明巴氏殺菌影響了啤酒的外觀評(píng)價(jià)以及感官分析。

表6 色度和泡持度變化Table 6 Variation of color and bubble holdup

2.6 pH值分析結(jié)果

pH對(duì)啤酒中渾濁的產(chǎn)生都有顯著的影響[23]。釀造所用水的特性影響著啤酒風(fēng)味，pH值過(guò)低可能是是雜菌污染所導(dǎo)致的，pH值過(guò)高影響糖化過(guò)程的作用和蛋白質(zhì)的凝固。其等離子體處理?xiàng)l件為電壓40 kV、時(shí)間10 s、氣體流速60 mL/min，巴氏殺菌處理?xiàng)l件為處理溫度 70 ℃，時(shí)間30 min。如表7所示，三者的pH值的變化不對(duì)，說(shuō)明等離子和巴氏殺菌對(duì)精釀啤酒的酸堿度影響不大。

表7 pH值變化Table 7 pH change

3 結(jié)論

利用低溫等離子體連續(xù)處理精釀啤酒中菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌以及色澤、亮度、泡持度和 pH值的變化。與巴氏殺菌進(jìn)行對(duì)比，殺菌率幾乎相同，但是等離子體殺菌的品質(zhì)比巴氏殺菌更好。當(dāng)電壓為40 kV，處理時(shí)間為10 s時(shí)，菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌的殺菌率為99.1%、97.6%和 99.9%，菌落總數(shù)和大腸桿菌均到達(dá)國(guó)標(biāo)。同時(shí)亮度、色澤、泡持度以及 pH值分別為36 cd/m2、29.41 EBC、318 s、4.7，都與精釀啤酒相接近。利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面建立了低溫等離子體殺滅菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌及亮度的影響的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，此模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相似。本研究為飲料的低溫殺菌工藝提供參考，也為等離子體對(duì)菌落總數(shù)、酵母菌和大腸桿菌的殺菌效果提供理論依據(jù)?？梢?jiàn)，低溫等離子體對(duì)精釀啤酒殺菌的應(yīng)用有著很好的前景。