張 夢(mèng)，史鵬飛，劉春增，李本銀，丁 麗，張 琳，鄭春風(fēng)，張成蘭, 何春梅，施海帆，呂玉虎，常單娜，曹衛(wèi)東*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002；2.信陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；3.河南省作物分子育種研究院，河南 鄭州 450002；4.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建 福州 350013；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095；6.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

紫云英(AstragalussinicusL.)是我國(guó)南方稻田重要的冬季綠肥，在培肥地力、降低化肥依賴、提升稻米產(chǎn)量和品質(zhì)中發(fā)揮重要作用[1-2]。我國(guó)是紫云英的起源地，種質(zhì)資源豐富，據(jù)推測(cè)紫云英起源中心在我國(guó)秦嶺以南的中部山間河谷地帶，并向東、向南擴(kuò)展[3]。上世紀(jì)90年代以前，紫云英是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要有機(jī)肥源之一，種植分布廣泛，形成了眾多地方品種[4-5]。90年代以后，由于種植結(jié)構(gòu)調(diào)整以及化學(xué)肥料的普及使用，紫云英種植應(yīng)用范圍急劇縮小，紫云英研究和選育工作停滯[2]。近年來(lái)，隨著國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略和社會(huì)大眾對(duì)生態(tài)環(huán)境的重視，紫云英的產(chǎn)業(yè)化推廣與應(yīng)用獲得了恢復(fù)性發(fā)展。但由于種質(zhì)利用和研究中斷多年，原有品種退化、損失、混雜嚴(yán)重，現(xiàn)有紫云英地方品種和種質(zhì)資源遺傳關(guān)系不明確，制約了對(duì)紫云英新品種的科學(xué)選育和管理認(rèn)證[6]。

分子標(biāo)記在作物遺傳育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，對(duì)于揭示供試材料遺傳特征具有重要意義。陳堅(jiān)等[7]利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記分析了9個(gè)紫云英品種遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)供試品種可聚為2個(gè)類群，且表現(xiàn)出一定的區(qū)域分布特征。與其他分子標(biāo)記相比，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子(Inter-simple sequence repeat，ISSR)標(biāo)記具有穩(wěn)定、多態(tài)性高、簡(jiǎn)便及易操作等優(yōu)點(diǎn)，被視為理想的遺傳標(biāo)記方法，已在多種動(dòng)植物的親緣關(guān)系[8]、種質(zhì)鑒定[9]、遺傳完整性[10]等研究方面得到應(yīng)用。孫清信等針對(duì)紫云英優(yōu)化了ISSR-PCR反應(yīng)體系[11]，張慧等[12]利用ISSR標(biāo)記研究了 22個(gè)紫云英品種遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)供試品種平均多態(tài)率為59.2%，品種間的相似性系數(shù)界于0.63～0.95，22個(gè)紫云英品種可分為 4類。然而，由于長(zhǎng)期缺乏有效管理和保護(hù)，加之研究中斷造成部分品種和種質(zhì)資源來(lái)源不明，育種資源遺傳特征研究的不足制約了以紫云英為代表綠肥種業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

綠肥是基于綠肥作物通過(guò)固定光合產(chǎn)物和環(huán)境養(yǎng)分并在一定時(shí)期翻壓還田形成的有機(jī)肥源，它的生產(chǎn)需要配合不同的生產(chǎn)制度和種植模式，在空間和時(shí)間“夾縫”中實(shí)現(xiàn)資源高效利用。因此，綠肥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展需要不斷強(qiáng)化種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用、培育優(yōu)質(zhì)綠肥新品種，以適應(yīng)生產(chǎn)方式、種植制度和應(yīng)用模式的多樣化需求，從根本上擺脫“依靠財(cái)政投入才能推廣應(yīng)用的傳統(tǒng)有機(jī)肥料”之尷尬局面。因此，本文以綠肥作物紫云英為研究對(duì)象，利用國(guó)家綠肥種質(zhì)資源庫(kù)及各地不同時(shí)期的紫云英種質(zhì)資源，通過(guò)分子標(biāo)記分析供試資源的遺傳多樣性，明確不同紫云英種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系及其遺傳結(jié)構(gòu)，評(píng)價(jià)育種材料在省份間交流和利用情況，以期為紫云英現(xiàn)有種質(zhì)資源的充分利用、新品種選育以及現(xiàn)有品種的有效鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試紫云英種質(zhì)資源共77份(表1)，其中53份資源由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所(編號(hào)1～14，17和42～77)和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所(編號(hào)15～16)提供；22份資源(編號(hào)18～39)為研究團(tuán)隊(duì)近5年在豫南地區(qū)收集獲得；2份資源(編號(hào)40～41)為豫南地區(qū)主推紫云英品種。研究中根據(jù)來(lái)源地的不同將供試資源進(jìn)行分類編號(hào)。

表1 77份紫云英種質(zhì)資源

1.2 DNA提取

采用苗盤培養(yǎng)的方式，于苗期4片真葉完全展開時(shí)，對(duì)供試的77份資源進(jìn)行采樣。鑒于異花授粉植物群體內(nèi)遺傳多樣性豐富，個(gè)體間可能存在較大差異，參考陳堅(jiān)等[13]研究結(jié)果及供試資源數(shù)量，本研究采用多單株分別提取混合測(cè)定的取樣策略：每份資源分別選擇生長(zhǎng)正常的紫云英幼苗25個(gè)單株，采集頂部真葉粉碎混勻后采用磁珠試劑盒(北京博友順生物技術(shù)有限公司)分別提取紫云英葉片DNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量。將檢測(cè)合格的DNA樣品稀釋至40 μg·L-1，最后把同一資源的25份DNA稀釋液等體積混合，置于—20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及PCR擴(kuò)增

參考孫清信等[11]和張慧等[12]的方法，以‘浙紫71-107’‘寧綠1號(hào)’‘閩紫3號(hào)’‘XYXH17-4’為模板，依據(jù)最優(yōu)ISSR-PCR體系中的擴(kuò)增條件，通過(guò)初步篩選及溫度梯度復(fù)篩，從56條ISSR引物(北京六合華大基因科技有限公司)中篩選條帶多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清晰的引物14條，對(duì)供試紫云英種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分析。其中，PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL，DNA模板40 ng，10×Bufer 2.5 μL，primer 0.3 μmol·L-1，dNTP mixture 0.25 μmol·L-1，MgCl21.5 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1.25U(TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司)；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)：94℃變性45 s，56～52℃復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(電壓120 V，電泳50 min，電泳緩沖液濃度TAE)，Marker為2 000 bp。電泳后凝膠成像儀(K8300北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司)進(jìn)行成像拍照并保存DNA檢測(cè)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無(wú)DNA條帶記為0。使用Gel-pro analyzer軟件估算出每個(gè)引物多態(tài)性條帶，形成ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)行有關(guān)分析。

1.4.1個(gè)體間遺傳特征分析 使用NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)(DICE系數(shù))，對(duì)77份紫云英地方種質(zhì)資源進(jìn)行UPGMA聚類分析。參考宋海斌等[14]和王琰琰等[15]方法，構(gòu)建不同種質(zhì)資源的指紋圖譜：將14條引物依次編碼為A～N，條帶由小到大進(jìn)行數(shù)字編號(hào)。根據(jù)擴(kuò)增情況，每個(gè)紫云英種質(zhì)資源形成了由字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成的帶型信息碼，如A1A5B2，表示該材料在引物A的第1和第5位點(diǎn)擴(kuò)增出條帶，在引物B第2位點(diǎn)擴(kuò)增出條帶。使用Excel中COUNTIF函數(shù)，逐次迭代比對(duì)信息碼的條帶信息，獲得各引物可單獨(dú)鑒別供試紫云英資源的數(shù)量和種類信息，并據(jù)此優(yōu)化組合并縮減引物數(shù)量，獲得核心引物(用最少的引物組合區(qū)分供試材料)。利用SPSS 22中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模塊的多層感知器進(jìn)行特征選擇，依據(jù)特征重要性逐次迭代核心引物位點(diǎn)信息，篩選能夠區(qū)分供試資源的最小特征位點(diǎn)集合，最終構(gòu)建出基于供試紫云英種質(zhì)資源的指紋圖譜編碼。

1.4.2群體間遺傳特征分析 采用GenAlEx 6.503加載宏[16]對(duì)不同省份(地區(qū))的種質(zhì)資源ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，POPGENE 1.32軟件[17]對(duì)不同來(lái)源地供試材料進(jìn)行群體遺傳相似性分析。由于本研究不同省份(地區(qū))種質(zhì)資源數(shù)量差異較大，因此基于主坐標(biāo)分析和群體遺傳相似性特征，將江蘇-上海-安徽資源合并為蘇滬皖資源庫(kù)(SHW)、湖南-江西-廣西-四川資源合并為湘贛桂川資源庫(kù)(XGGC)，對(duì)河南資源庫(kù)(HE，24份資源)、福建資源庫(kù)(FJ，13份資源)、浙江資源庫(kù)(ZJ，11份資源)以及蘇滬皖資源庫(kù)(SHW，8份資源)、湘贛桂川資源庫(kù)(XGGC，20份資源)進(jìn)行分子遺傳變異方差分析(AMOVA)。日本兵庫(kù)種(AB-01)由于無(wú)法推測(cè)傳播途徑，未納入本分析。

1.4.3省份材料遺傳結(jié)構(gòu)分析 不同于野外自然材料，供試綠肥種質(zhì)資源在不同地區(qū)的數(shù)量確定，包括野生材料和人工雜交選擇的育種材料。同時(shí)，由于材料來(lái)源較為復(fù)雜，野生材料不能明確是否為人工選育材料散落后的自然變異，部分育種材料亦不能考證親本來(lái)源(與90年代后相關(guān)研究中斷有關(guān))。因此，鑒于供試材料涵蓋了全國(guó)主要的紫云英生產(chǎn)省份以及主要栽培種，參考分子生態(tài)學(xué)方法利用Structure軟件[18-19]，對(duì)群體進(jìn)行K=1～10的貝葉斯聚類，計(jì)算群體和個(gè)體Q矩陣，利用Structure Harvester[19]計(jì)算lnP(K)和ΔK，利用CLUMPP軟件[20]對(duì)重復(fù)抽樣數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，Distruct軟件[21]對(duì)群體結(jié)構(gòu)分析并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化，以評(píng)價(jià)不同省份對(duì)紫云英種質(zhì)資源的利用程度，推測(cè)我國(guó)主要紫云英栽培省份種質(zhì)資源特征。標(biāo)準(zhǔn)地圖由自然資源部地圖技術(shù)審查中心標(biāo)準(zhǔn)地圖服務(wù)網(wǎng)(http://bzdt.ch.mnr.gov.cn/)獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

提取基因組總DNA的OD260/OD280在1.573～1.789之間，DNA濃度均大于40 μg·L-1，定量稀釋混合后滿足ISSR標(biāo)記分析。篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、條帶數(shù)較多、多態(tài)性良好的ISSR引物(圖1)。在77個(gè)樣品中共擴(kuò)增出了150條清晰條帶，137條為多態(tài)位點(diǎn)，平均多態(tài)性比率89.34%(表2)。各引物擴(kuò)增的條帶在4～16條之間，平均每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為10.7條。觀測(cè)等位基因數(shù)1.50～2.00，有效等位基因數(shù)1.13～1.70，基因多樣性指數(shù)0.10～0.40，信息指數(shù)0.18～0.59，均以P809引物最高(表2)。引物分析顯示，ISSR標(biāo)記在77份供試紫云英種質(zhì)資源中具有豐富的多態(tài)性，具備反映供試資源遺傳特征的作用。

表2 ISSR引物信息及擴(kuò)增結(jié)果

2.2 不同紫云英種質(zhì)資源的個(gè)體遺傳關(guān)系

77份紫云英種質(zhì)資源的遺傳相似性系數(shù)(Genetic similarity，GS)介于 0.567 7～0.868 6之間(圖2)。其中，安徽‘當(dāng)涂種’(AH-01)與‘弋江籽’(AH-02)之間遺傳相似性系數(shù)最大(GS=0.868 6)，說(shuō)明兩個(gè)資源親緣關(guān)系最近；湖南‘澧縣種’(HU-10)與河南‘DSQS17-4’(HE-14)之間相似系數(shù)最小(GS=0.567 7)，說(shuō)明兩個(gè)資源親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣，對(duì)77份供試材料進(jìn)行聚類分析，得到樹狀聚類圖(圖2)。在遺傳相似系數(shù)為0.720 0時(shí)，77份資源可分為6個(gè)聚類：聚類Ⅰ包括日本‘兵庫(kù)種’、廣西‘萍寧3號(hào)’、四川‘川西種’以及全部供試江西資源和6份湖南資源；聚類Ⅱ包括全部供試安徽資源和17個(gè)河南資源；聚類Ⅲ包括12個(gè)福建資源、6個(gè)湖南資源、5個(gè)河南資源以及全部供試江蘇、上海、浙江的資源；聚類Ⅳ為福建‘閩紫3號(hào)’；聚類Ⅴ為河南‘DSQS17-4’；聚類Ⅵ為河南‘DSHS17-6’，供試資源在聚類中的分布呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域聚集特征。

圖2 基于ISSR的77份紫云英種質(zhì)資源的聚類圖

2.3 地區(qū)間種質(zhì)資源的群體遺傳分化

各地區(qū)紫云英種質(zhì)群體間的遺傳距離(Genetic distance，GD)存在差異(表3)，地區(qū)間資源的平均遺傳距離呈現(xiàn)出：國(guó)外>廣西>四川>安徽>上海>江蘇>河南>江西>福建>湖南。國(guó)外資源與湖南、江西、福建資源的遺傳距離相對(duì)較小(GD<0.30)，與安徽、四川資源的遺傳距離相對(duì)較大(GD > 0.37)。各省份資源中，存在福建-浙江、福建-湖南、福建-河南、湖南-江西等4個(gè)遺傳較為相似(GD< 0.05)的群體。主坐標(biāo)分析進(jìn)一步呈現(xiàn)出不同地區(qū)資源的相似性(圖3)?？傮w上，福建紫云英資源位于軸坐標(biāo)中心位置，河南、安徽、江蘇、上海紫云英資源位于橫軸負(fù)值區(qū)域，江西、湖南、四川以及國(guó)外資源位于橫軸正值縱軸負(fù)值區(qū)域，浙江資源則位于橫軸縱軸正值區(qū)域(圖3，不同地區(qū)個(gè)別資源存在一定的離散)，說(shuō)明不同地區(qū)紫云英資源具有一定分化，而福建紫云英資源可能與其他省份存在遺傳交流。由于不同省份(地區(qū))種質(zhì)資源數(shù)量差異較大，廣西、四川、上海、安徽資源較少，因此基于主坐標(biāo)分析和群體遺傳相似性特征，將江蘇-上海-安徽資源歸為蘇滬皖資源庫(kù)(SHW)、湖南-江西-廣西-四川資源歸為湘贛桂川資源庫(kù)(XGGC)。對(duì)河南資源庫(kù)(HE，24份資源)、福建資源庫(kù)(FJ，13份資源)、浙江資源庫(kù)(ZJ，11份資源)以及上述兩個(gè)資源庫(kù)(SHW，8份資源；XGGC，20份資源)進(jìn)行分子遺傳變異方差分析(AMOVA)，進(jìn)一步驗(yàn)證區(qū)域資源的遺傳分化情況。結(jié)果顯示，群體分化系數(shù)為0.136 3，達(dá)到極顯著水平(P< 0.001)，其中種群間變異占比13.9%，種群內(nèi)變異占比86.1%(表4)，說(shuō)明5個(gè)供試群體存在顯著的遺傳分化。

表3 不同地區(qū)紫云英種質(zhì)資源群體的遺傳距離

表4 紫云英種質(zhì)資源群體的分子遺傳變異方差分析

圖3 不同地區(qū)紫云英種質(zhì)資源的主坐標(biāo)分析

2.4 不同地區(qū)種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)

不同地區(qū)紫云英種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)存在差異(圖4)。當(dāng)假設(shè)供試種質(zhì)資源存在2個(gè)亞群體(K=2)時(shí)，10個(gè)地區(qū)中，河南、安徽、江蘇、上海遺傳結(jié)構(gòu)相似，四川、廣西、湖南、江西、浙江資源的遺傳結(jié)構(gòu)相似，福建則為亞群體混合型；當(dāng)假設(shè)存在3個(gè)亞群體(K=3)時(shí)，河南、安徽遺傳結(jié)構(gòu)相似，江蘇、上海相似，四川、廣西、湖南、江西相似，浙江則自為一體，福建仍呈現(xiàn)亞群體混合型?；跀?shù)據(jù)對(duì)數(shù)概率變化率(ΔK)推測(cè)最佳亞群體數(shù)，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK=36.59，而K≥3時(shí)，ΔK<2.8，說(shuō)明10個(gè)省份(群體)的供試種質(zhì)資源最佳亞群體數(shù)應(yīng)為2個(gè)。關(guān)聯(lián)地理位置及推測(cè)的起源中心，供試紫云英呈現(xiàn)明顯的傳播特征，即以河南-安徽-江蘇-上海-福建為一線(北方資源庫(kù))，以四川-廣西-湖南-江西-福建為一線(西部和南方資源庫(kù))，紫云英群體遺傳結(jié)構(gòu)逐漸變化。需要說(shuō)明的是，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析與個(gè)體聚類結(jié)果存在差別(圖2和圖4)，主要原因是兩者分析方法和研究對(duì)象不同所致。

圖4 不同省份紫云英資源的遺傳結(jié)構(gòu)

2.5 引物鑒別分析及指紋圖譜構(gòu)建

利用循環(huán)迭代的方法分析了14個(gè)引物對(duì)77份紫云英種質(zhì)資源的鑒別能力，發(fā)現(xiàn)不同ISSR引物擴(kuò)增條帶信息鑒別供試資源的能力存在差異，表現(xiàn)為P809=P825>P886>P821>P810>P836>P868>P843>P811>P844>P846>P859>P857=P889，其中P809和P825均可單獨(dú)鑒別67份資源，而P857和P889無(wú)法單獨(dú)鑒別供試資源(如圖5)。基于引物的鑒別能力，通過(guò)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行特征提取，篩選出P809和P886為核心引物，同時(shí)為盡可能降低指紋位數(shù)，通過(guò)迭代法篩選特征位點(diǎn)，構(gòu)建出以P809第3，8，9，10，12，15擴(kuò)增位點(diǎn)以及P886第1，3，5，9，10，11擴(kuò)增位點(diǎn)為特征的指紋圖譜(表5)。

圖5 ISSR引物鑒別特征圖譜

3 討論

3.1 紫云英種質(zhì)資源的遺傳多樣性與指紋圖譜構(gòu)建

本研究對(duì)11個(gè)地區(qū)收集的77份紫云英地方種質(zhì)資源開展ISSR分子標(biāo)記分析，14條引物共擴(kuò)增出150個(gè)條帶，137條為多態(tài)性條帶，各引物的基因多樣性和信息指數(shù)為0.10～0.40和0.18～0.59。陳堅(jiān)等[7]對(duì)9個(gè)紫云英品種遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，供試資源遺傳多樣性指數(shù)為0.13～0.38，多態(tài)信息指數(shù)為 0.22～0.56，與本研究結(jié)果相似。此外，本研究供試種質(zhì)資源之間遺傳相似性系數(shù)為0.567 7～0.868 6，相似性最高的安徽‘當(dāng)涂種’(AH-01)與‘弋江籽’(AH-02)之間亦檢測(cè)出23個(gè)差異位點(diǎn)，占總多態(tài)性位點(diǎn)的16.8%，說(shuō)明77份紫云英地方資源不存在異名同種現(xiàn)象，具備遺傳特異性。目前，不同紫云英的分子標(biāo)記鑒別方法并未形成，如何高效便捷鑒定不同紫云英資源，成為綠肥行業(yè)發(fā)展面臨的重要問(wèn)題。本研究中發(fā)現(xiàn)不同ISSR引物對(duì)77份紫云英資源的分子標(biāo)記特征存在差異，雖然14個(gè)引物的多態(tài)性條帶比率為50%～100%，但引物對(duì)不同資源的區(qū)分能力卻存在差別，表現(xiàn)為P809=P825>P886>P821>P810>P836>P868>P843>P811>P844>P846>P859>P857=P889，其中P809和P825單獨(dú)可區(qū)分67份資源，而P857和P889無(wú)法單獨(dú)鑒別供試資源。因此，基于資源的遺傳特異性以及ISSR不同引物對(duì)資源的區(qū)分鑒別能力，構(gòu)建了以P809和P886條帶為核心的紫云英ISSR標(biāo)記指紋圖譜。宋海斌等[11]和王琰琰等[15]利用SSR標(biāo)記分別對(duì)102份甜瓜(CucumismeloL.)品種和220份雪茄煙(NicotianatabacumL.)種質(zhì)資源進(jìn)行了指紋圖譜分析，提取核心引物18對(duì)和14對(duì)用作指紋分析，與本研究方法相似，但引物數(shù)量較多，原因可能是其供試資源數(shù)量高于本研究、使用的分子標(biāo)記亦不同。指紋圖譜應(yīng)用具有一定局限性，如P809和P886分別可擴(kuò)增16和14個(gè)條帶，理論上最高可鑒別230=1 073 741 824份資源，77份資源鑒別僅需要7個(gè)有效條帶(27=128>77)，而實(shí)際情況卻是14個(gè)供試引物均無(wú)法單獨(dú)鑒別77份資源，說(shuō)明引物的每個(gè)條帶并非皆為區(qū)分種質(zhì)資源的有效條帶。因此，若紫云英種質(zhì)資源數(shù)量增大，核心引物或者特征位點(diǎn)數(shù)量也將增多。目前，我國(guó)紫云英種質(zhì)資源主要保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，有效種質(zhì)資源的具體數(shù)量并未明確，對(duì)紫云英指紋圖譜的開發(fā)和應(yīng)用仍有待深入研究。

3.2 不同地區(qū)紫云英種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系、利用情況及演化推斷

本研究中，77份供試資源可分為6個(gè)聚類，聚類組成分布呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域聚集特征，同一地區(qū)種質(zhì)資源傾向于聚集一個(gè)聚類(圖2和圖3)，說(shuō)明紫云英在傳播過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的分化和地理分割性，這種特征與劉碩等[22]對(duì)中亞及我國(guó)普通杏(PrunusarmeniacaL.)和西伯利亞杏(PrunussibiricaL.)野生居群，張旭等[23]對(duì)內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅16個(gè)不同居群紅砂(ReaumuriasoogoricaM.)的研究結(jié)果類似，卻與鄧亞博等[24]對(duì)河南省內(nèi)狗牙根(CynodondactylonP.)以及錢茱希等[25]對(duì)洞庭湖地區(qū)南荻(TriarrhenalutarioripariaL.)種質(zhì)資源研究結(jié)論(地理距離與種群的遺傳變異分布無(wú)顯著相關(guān)性)不同，推測(cè)研究的空間尺度可能影響上述結(jié)論的產(chǎn)生。另一方面，自然地理?xiàng)l件、氣候因子、人為因素都是影響物種遺傳分化的重要因素[26-27]。前人專著《中國(guó)綠肥》記錄了秦嶺、大別山各山區(qū)濕潤(rùn)地帶有野生種分布的現(xiàn)象[4]；《中國(guó)紫云英》則根據(jù)我國(guó)紫云英農(nóng)家品種大多數(shù)冬性都較強(qiáng)、有一定的耐寒性及適應(yīng)于較高的海拔等特性推測(cè)，它的起源地可能在秦嶺以南的中國(guó)中部山間河谷地帶，然后向南向東擴(kuò)展[3]。本研究基于ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)紫云英種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的地域特征，即以河南-安徽-江蘇-上海-福建為一線，供試群體遺傳結(jié)構(gòu)類似，可稱為北方資源；以四川-廣西-湖南-江西-福建為一線，資源的遺傳結(jié)構(gòu)類似，可稱為西南方資源。若參照前人所推測(cè)的起源中心，即秦嶺以南的中國(guó)中部山間河谷地帶為紫云英的起源中心(圖5)，則上述群體遺傳結(jié)構(gòu)特征印證了前人關(guān)于紫云英起源與擴(kuò)展的推斷。對(duì)于福建為何呈現(xiàn)出亞群體混合型特征，可能的原因有兩個(gè)：一是地理位置和地形原因造成福建成為紫云英傳播鏈末端；二是福建紫云英相關(guān)研究(尤其是雜交育種)開展較早、較為系統(tǒng)收集了我國(guó)其他省份的種質(zhì)資源，開展了廣泛的雜交育種工作及其相關(guān)研究[3,7-9]。然而，本研究的結(jié)論建立在14條ISSR引物對(duì)77份(國(guó)內(nèi)76份)不同地區(qū)紫云英的150個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)信息的基礎(chǔ)上，供試資源具有一定代表性，但缺少野生資源及相關(guān)育種材料親本的重要信息，人為因素(如耕作制度變化、骨干親本選擇)或自然氣候(如歷史氣溫、降水變化等)如何影響紫云英傳播和分化并未明確，不同紫云英種質(zhì)資源形成的分子生態(tài)學(xué)原理以及各省對(duì)于紫云英種質(zhì)資源在育種中的應(yīng)用仍有待深入研究。針對(duì)綠肥產(chǎn)業(yè)發(fā)展，未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)起源地科考、人工誘變研究，不斷收集和創(chuàng)制種質(zhì)資源，配合加代擴(kuò)繁、快速育種等技術(shù)，大量培育適應(yīng)不同生產(chǎn)需要的綠肥新品種，形成推動(dòng)綠肥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“源動(dòng)力”，更好服務(wù)種植業(yè)的綠色低碳發(fā)展。

4 結(jié)論

77份供試紫云英種質(zhì)資源遺傳相似性系數(shù)為0.567 7～0.868 6，既具有豐富的遺傳多樣性，又表現(xiàn)出明顯的分化和地理分割特征。根據(jù)引物條帶多態(tài)性及其鑒別能力，構(gòu)建了以P809第3，8，9，10，12，15擴(kuò)增位點(diǎn)和P886第1，3，5，9，10，11擴(kuò)增位點(diǎn)為特征的指紋圖譜。以資源所在地區(qū)為居群進(jìn)行群體遺傳變異和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，群體分化系數(shù)為0.139 3，達(dá)到極顯著水平(P< 0.001)，其中河南-安徽-江蘇-上海資源可劃為北方資源群，四川-廣西-湖南-江西資源為西南方資源群，遺傳結(jié)構(gòu)特征在福建發(fā)生融合。