祁鶴興，王海春，蘆光新*，李宗仁，田 豐，賀晨邦，徐成體，鄒海濤，雷生妍，李紅芳，唐海鵬

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省草原總站，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；4.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

青貯玉米(ZeaMaysL.)作為一種營養(yǎng)均衡，適口性好的優(yōu)質(zhì)飼料在全球畜牧業(yè)發(fā)達國家廣泛種植[1-3]。近十幾年來，隨著玉米全膜雙壟栽培技術(shù)在青海省的示范推廣，青貯玉米栽培區(qū)域已擴大至高海拔和干旱地區(qū)。青貯玉米依其產(chǎn)量、品質(zhì)和價值的優(yōu)勢發(fā)展速度快，潛力大，是青海省農(nóng)業(yè)特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[4]。但是多種葉斑病的發(fā)生，影響青貯玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[5]。

玉米田間病害種類多，病因復(fù)雜，僅引起玉米病害的真菌就多達147余種，可造成葉部、莖部、穗部和根部等病害[6]。蠕形菌通常指形狀似蠕蟲，具有多個橫隔膜的一類真菌，包括平臍蠕孢屬(Bipolaris)、凸臍蠕孢屬(Exserohilum)、內(nèi)臍蠕孢屬(Drechslera)和彎孢屬(Curvularia)等多屬真菌，大多數(shù)的蠕形菌都可侵染植物造成病害[7]。多種蠕形菌可侵染玉米，造成葉斑病害，如大斑凸臍蠕孢(E.turcicum)[8-9]、玉蜀黍平臍蠕孢(B.maydis)[10-11]、新月彎孢(C.lunate)[12-13]和麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)[14-15]等。

近十幾年來，我國抗大、小斑病玉米品種的選育推廣工作進展順利，但是這也導(dǎo)致一些原來生產(chǎn)上的次要病害逐年嚴重，新病害逐年出現(xiàn)，造成新的產(chǎn)量損失。如鏈格孢葉斑病日趨嚴重，在云南省[16]、黑龍江省[17]、甘肅省[18]和青海省[5]等地都有報道，對玉米品質(zhì)和產(chǎn)量造成危害。青貯玉米由于受到蠕形菌的侵染，不僅損害青貯玉米的品質(zhì)和產(chǎn)量，病原菌所產(chǎn)生的各種毒素[8,10,12,14]還可能對青海省畜牧業(yè)造成影響，如影響肉羊肉牛品質(zhì)，影響奶牛產(chǎn)奶質(zhì)量等。玉米在青貯過程中，病原真菌可能對有益乳酸菌、酵母和其他霉菌產(chǎn)生影響[19-24]。研究者們從歐洲牛場采集158份青貯玉米飼料，對其中所含毒素進行檢測，發(fā)現(xiàn)70%的樣本都有毒素檢出，87%的樣本含有5種以上的毒素[25]。因此明確引起青貯玉米葉斑病的蠕形菌種類及其致病性對于后續(xù)開展病害防治，青貯飼料的解毒等至關(guān)重要。

本課題組于2018—2021年在青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)民和縣、大通縣、樂都區(qū)和貴德縣青貯玉米種植區(qū)進行病害調(diào)查時采集不同類型葉斑病樣本，進行蠕形菌病原菌的分離、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并進行致病性分析。旨在為后續(xù)病害分布、綜合防治及病原菌毒素研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

于2018—2021年在青海省西寧市、海東市和海南藏族自治州7個青貯玉米種植地(表1)采用五點取樣法采集疑似病原菌病葉，共采集樣本61份。8個青貯玉米主栽品種(‘鐵研53’‘晉單60’‘金黃828’‘益農(nóng)2020’‘中單2’‘豫玉22’‘金穗3’和‘甘玉23’)種子由青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供。

表1 蠕形菌病原菌采集地點

1.2 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和2%水瓊脂培養(yǎng)基(2%WA)配制參照方中達[26]的方法。

1.3 病原菌的分離、純化與保存

病原菌的分離純化方法結(jié)合單孢分離法和組織分離法進行[5,27]。分離到的單孢菌株采用濾紙片保存法[28]，置于-20℃冰箱長期保存。

1.4 病原菌的分類鑒定

1.4.1菌株形態(tài)學(xué)鑒定 菌落形態(tài)觀察：將分離純化得到的單孢菌株接種于PDA平板，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用直徑0.5 cm的打孔器取菌餅放置在PDA平板中。每株菌株3個重復(fù)，每皿培養(yǎng)基的厚度保持一致。放置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)。

分生孢子形態(tài)觀察：使用接種針挑取分生孢子制成臨時玻片，在40×光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。菌株形態(tài)學(xué)鑒定參照戴芳瀾[29]。

1.4.2菌株基因組DNA的提取 采用CATB法提取基因組DNA[5,27]，最后用25 μL TE/RNase溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 rDNA-ITS擴增引物為ITS1和ITS4[27]，GADPH基因擴增引物為gpd-1和gpd-2[29-31]。

25 μL PCR反應(yīng)體系：12.5 μL 2×PCR Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司)；各1.0 μL上下游引物(25 pmol·L-1)；模板DNA(30 μg·L-1)1.0 μL；雙蒸水補足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃，5 min；95℃，1 min，55℃，1 min，72℃，2 min，30個循環(huán)；72℃，10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物純化后由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進行雙向測序。

參照祁鶴興等[5]和馬桂花等[26]的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。142株菌株GENBANK登錄號為OP412828-OP412970，OP476513-OP476654。

1.5 病原菌致病性測定

病原菌分生孢子制備參照祁鶴興等[5]的方法。在直徑為12 cm塑料花盆中加入營養(yǎng)土種植青貯玉米。采用離體劃傷接種法和噴霧接種法測定病原菌致病性。

離體劃傷接種法：剪取4～6葉期青貯玉米心葉中下部，用于接種8種青貯玉米，‘鐵研53’‘晉單60’‘金黃828’‘益農(nóng)2020’‘中單2’‘豫玉22’‘金穗3’和‘甘玉23’。每株菌重復(fù)接種3片葉片。每片葉片均勻劃傷2處，在劃傷處接種10 μL孢子懸浮液，以接種無菌水為對照。25℃黑暗保濕培養(yǎng)24 h，之后25℃光照培養(yǎng)6 d，觀察青貯玉米葉片的發(fā)病情況。

噴霧接種法：使用生長期為2周的青貯玉米品種‘鐵研53’用于菌株孢子懸浮液噴霧接種。每盆接種10 mL濃度為(1×105)個·mL-1的孢子懸浮液。接種后的植株放置在25℃黑暗環(huán)境下保濕培養(yǎng)1 d，之后25℃持續(xù)光照條件下培養(yǎng)6 d。每株菌株重復(fù)接種3盆植株，接種試驗重復(fù)3次。葉片產(chǎn)生病斑后，在病健交界處剪取小塊葉片置于水瓊脂表面培養(yǎng)36 h，之后在顯微鏡下觀察是否有病原菌分生孢子產(chǎn)生，以此來判斷病斑是否是由對應(yīng)病原菌侵染所造成。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯玉米蠕形菌病原菌的組成及形態(tài)學(xué)特征

對從青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)7個采樣地采集到的青貯玉米病葉進行病原菌的分離和純化，共分離得到142株病原菌。2018和2019年，從民和縣采集的病葉上各分離得到6株；2020年從樂都區(qū)分離得到3株；2020和2021年從大通縣分別分離得到51株和26株；2021年從貴德縣分離得到50株。通過菌株形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，142株菌株分別屬于3屬，平臍蠕孢屬真菌125株，凸臍蠕孢屬真菌9株，彎孢屬真菌8株。其中麥根腐平臍蠕孢和玉米生平臍蠕孢(B.zeicola)分離個數(shù)最多，分別為77株和48株，分離頻率分別為54.2%和33.8%；其次，分離得到9株大斑病菌，分離頻率為6.3%，新月彎孢、疣狀彎孢(C.verruculosa)和穗狀彎孢(C.spicifera)的分離個數(shù)分別為3株、2株和3株，分離頻率分別為2.1%，1.4%和2.1%(表2)。

表2 蠕形菌病原菌分離個數(shù)及分離頻率

青貯玉米蠕形菌病原菌的形態(tài)特征差別明顯(圖1)。麥根腐平臍蠕孢：菌落偶有缺裂，大多數(shù)為圓形，氣生菌絲灰綠色至黑褐色，呈絨氈狀。分生孢子暗褐色，橢圓形或長橢圓形，中間寬，兩端漸狹鈍圓，大多直或略彎，3～12個隔膜，臍點不明顯，大小49.1～91.3×15.1～24.8 μm(平均：61.6×19.6 μm)。

圖1 病原菌菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)

玉米生平臍蠕孢：氣生菌絲發(fā)達，淺綠色至黑綠色。具有中央寬、兩端漸窄、形狀為長橢圓形的分生孢子；分生孢子少數(shù)略有彎曲，4～10個隔膜，大小為53.9～92.8 μm×11.22～23.35 μm(平均：78.0×14.2 μm)。

大斑病菌：菌落淺綠色至褐色，氣生菌絲絨氈狀，較繁茂。分生孢子梭形，淺褐色至深褐色，有的略向一方彎曲，頂細胞長橢圓形，基細胞尖錐形，臍點明顯，2～10個隔膜，大小為60.8～124.3 μm×14.1～23.5 μm(平均：88.1×17.6 μm)。

新月彎孢：氣生菌絲放射狀擴展，呈墨綠色，絲絨狀。分生孢子新月狀，暗褐色，具3個隔膜，兩端細胞稍小，顏色較淺，中間2個細胞膨大，第3個細胞膨大最明顯。大小為17.4～24.8 μm×7.4～12.9 μm(平均：19.8×9.4 μm)。

疣狀彎孢：菌落墨綠色，邊緣偏白，絲絨狀，老熟后呈黑色。分生孢子淺褐色，多彎曲，具3個隔膜，中間2個細胞比兩端細胞更大、顏色更深，大小為19.6～26.5 μm×7.4～10.6 μm(平均：22.5×11.3 μm)。

穗狀彎孢：菌落淺綠褐色，絨墊狀，老熟后呈黑色。分生孢子橢圓形或長圓形，頂細胞和基細胞圓形，淺棕褐色，多具3個橫隔，大小19.8～28.2 μm×8.1～11.6 μm(平均：23.9×9.7 μm)。

2.2 麥根腐平臍蠕孢葉斑病和圓斑病田間癥狀

麥根腐平臍蠕孢引起麥根腐平臍蠕孢葉斑病，該病典型病斑呈灰白色至黃色，圓形或橢圓形，壞死斑先從微小開始發(fā)展，擴展到大的壞死斑，并帶有黃色褪綠的暈圈(圖2)，該葉斑病在大通縣普遍發(fā)生，發(fā)病率為10%～30%，嚴重度為3—5級。玉米生平臍蠕孢引起玉米圓斑病，典型病斑呈狹長狀，中間淺灰色至褐色，周緣暗色，具有黃色暈圈(圖2)。玉米圓斑病典型癥狀只在貴德縣觀察到，發(fā)病率為15%，嚴重度為3—5級。民和縣和大通縣雖分別分離得到5株和1株玉米生平臍蠕孢，但是在田間沒有觀察到典型癥狀。

圖2 青貯玉米麥根腐平臍蠕孢葉斑病和圓斑病田間癥狀

2.3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

分別以43株病原菌代表菌株和14株參考菌株的rDNA-ITS序列和GADPH基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3和圖4)。分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的2個系統(tǒng)發(fā)育樹具有相似的拓補結(jié)構(gòu)，57株菌株被分為6個發(fā)育分枝。菌株CJZ-5，DTR-84，LD-206，MH1846-B，ST-1，LD-36和MH1859-B等20株菌株與麥根腐平臍蠕孢(B.sorokiniana)在同一發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近。菌株GDX-8，MH-4-1，GDX-21，GDX-63和MH1848-A等10株菌株與玉米生平臍蠕孢(B.zeicola)在同一發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近。菌株GDX-65，GDX-24和CJZ-8等5株菌株與大斑病菌(E.turcicum)在同一發(fā)育分支上，親緣關(guān)系最近。菌株DT-114和DT-114-1與疣狀彎孢(C.verruculosa)聚為一個分支，親緣關(guān)系最近。菌株MH-41，MH1832-A和MH-4-1-1與穗狀彎孢(C.spicifera)聚為一個發(fā)育分支，親緣關(guān)系最近。菌株CJZ-11，LD-204-1和DT-68與新月彎孢(C.lunata)聚為一個分支，親緣關(guān)系最近。

圖3 基于43株代表病原菌rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 基于43株代表病原菌GADPH基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌致病性分析

為分析6種病原菌對8個青海省青貯玉米主栽品種的致病性，首先采用劃傷接種法進行接種。結(jié)果表明77株麥根腐平臍蠕孢和48株玉米生平臍蠕孢對8個品種都有致病性(圖5)。大斑病菌、穗狀彎孢、新月彎孢和疣狀彎孢對8個品種的致病性存在差異(圖5，表3)。大斑病菌中，菌株CJZ-8對‘豫玉22’和‘金穗5’不致病，對‘鐵研53’‘晉單60’‘金黃828’‘益農(nóng)2020’‘中單2’和‘甘玉23’致病，其余8株菌株能侵染的品種在2-5個之間，菌株GDX-66和GDX-81只能侵染‘金黃828’和‘益農(nóng)2020’。穗狀彎孢MH1832-A能侵染8個青貯玉米品種，其余2株菌株MH-41和MH-4-1-1能侵染4個品種。新月彎孢LD-204-1能侵染8個青貯玉米品種，其余2株菌株DT-68和CJZ-11能侵染6個品種。2株疣狀彎孢具有相同的致病性，都能侵染‘鐵研53’‘金黃828’‘金穗5’和‘甘玉23’，不能侵染其余4個品種。

圖5 青貯玉米來源6種病原菌劃傷接種8個青貯玉米品種

表3 青貯玉米4種病原菌接種結(jié)果統(tǒng)計

6種病原菌代表菌株噴霧接種‘鐵研53’，發(fā)現(xiàn)下部老葉易感病，接種7 d后多數(shù)老葉腐爛發(fā)霉。且穗狀彎孢、新月彎孢和疣狀彎孢接種后葉尖也易出現(xiàn)腐爛發(fā)霉現(xiàn)象。玉米生平臍蠕孢和大斑病菌形成長條型典型病斑，病斑極易呈片狀；麥根腐平臍蠕孢形成的病斑較小，但病斑也易連成片狀。穗狀彎孢形成小梭形病斑，新月彎孢形成圓形或橢圓形小病斑，疣狀彎孢形成橢圓形或不規(guī)則小病斑(圖6)。接種發(fā)病葉片經(jīng)保濕培養(yǎng) 36 h后，用10×光學(xué)顯微鏡能觀察到分生孢子梗和分生孢子，從發(fā)病病斑分離得到的菌株與野生型菌株菌落形態(tài)一致(圖7)。

圖6 青貯玉米6種病原菌噴霧接種鐵研53

圖7 青貯玉米6種病原菌致病性驗證

3 討論

青海省作為我國五大牧區(qū)之一，畜牧業(yè)是最具特色的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)之一。然而，青海省由于天然草場環(huán)境惡化導(dǎo)致牧草缺乏，家畜面臨著“夏肥冬瘦”的問題[32]；冬季為藏系綿羊產(chǎn)羔期，但是冬季牧草缺乏導(dǎo)致羔羊死亡現(xiàn)象時有發(fā)生[33]。因此，飼料及其品質(zhì)已成為影響青海省畜牧業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。青海省近十幾年來大力發(fā)展青貯玉米產(chǎn)業(yè)，對于緩解天然草場退化和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展都起到了積極作用。

平臍蠕孢屬、彎孢屬和凸臍蠕孢屬多種真菌能侵染玉米，造成產(chǎn)量和品質(zhì)損失。本研究發(fā)現(xiàn)麥根腐平臍蠕孢、玉米生平臍蠕孢、大斑病菌、新月彎孢、穗狀彎孢和疣狀彎孢可以侵染青貯玉米，造成葉斑病。麥根腐平臍蠕孢[14-15]、玉米生平臍蠕孢[34-35]、大斑病菌[8-9]、新月彎孢[12-13]引起的葉斑病在國內(nèi)外都嚴重影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)。2016年郭玉杰等報道穗狀彎孢可以引起玉米葉斑病，病斑呈梭形[36]。我們在民和采集的樣本上分離得到3株穗狀彎孢，在田間沒有觀察到典型癥狀，可能與其他病原菌復(fù)合侵染有關(guān)。但是噴霧接種的病斑呈現(xiàn)短條狀的梭形，與郭玉杰等[36]的報道一致。疣狀彎孢引起的玉米葉斑病在國內(nèi)外尚未見報道。

麥根腐平臍蠕孢葉斑病在大通縣3個采樣地都有觀察到，2019—2020年在湟中縣和湟源縣沒有觀察到該病害，但是2021年在這2個縣進行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)該病害已有發(fā)生。因此推測麥根腐平臍蠕孢葉斑病在青海地區(qū)有擴大的趨勢，這可能與近幾年的氣溫異常有關(guān)。玉米生平臍蠕孢在貴德縣、民和縣和大通縣采樣地分離得到，但是該病原菌引起的圓斑病典型癥狀只在2021年貴德縣觀察得到。玉米生平臍蠕孢存在生理小種分化現(xiàn)象，可以分為1—3號小種。我們根據(jù)該病害田間癥狀及室內(nèi)噴霧接種癥狀特點分析，分離得到的玉米生平臍蠕孢為1號小種，該小種寄主專化性強，多產(chǎn)生卵圓形病斑，發(fā)病嚴重時病斑易連成一片[34,37-39]。玉米圓斑病是一種世界性流行病害，美國、瑞士、尼日利亞、德國和日本等國家均有發(fā)生，在我國陜西、云南、吉林、浙江、河北、遼寧、黑龍江、北京和內(nèi)蒙古等省市自治區(qū)也屬于常發(fā)病害[37]。

6種病原菌，共計142株菌株劃傷接種8個青貯玉米品種后發(fā)現(xiàn)，77株麥根腐平臍蠕孢和48株玉米生平臍蠕孢都可侵染8個玉米品種，由此推測這8個青貯玉米品種對麥根腐平臍蠕孢和玉米生平臍蠕孢沒有抗性。大斑病菌、穗狀彎孢、新月彎孢和疣狀彎孢分離得到的個數(shù)較少，但是在青海省其他青貯玉米種植區(qū)侵染情況如何尚未可知。后續(xù)我們將對這6種病原菌引起病害的綜合防治方法及在青海全省內(nèi)的分布情況進行研究。

4 結(jié)論

從青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)青貯玉米葉斑病葉分離得到麥根腐平臍蠕孢、玉米生平臍蠕孢、大斑病菌、新月彎孢、疣狀彎孢和穗狀彎孢6種病原菌。麥根腐平臍蠕孢和玉米生平臍蠕孢分離個數(shù)最多，且8個青貯玉米品種對這2種病原菌沒有抗性。本文首次報道疣狀彎孢可以侵染玉米，造成葉斑病。