李春艷，鐘 華，杜利霞，侯向陽(yáng)*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草高效生產(chǎn)模式創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801)

轉(zhuǎn)錄因子因其具有調(diào)控基因表達(dá)的作用，在過去被廣泛應(yīng)用于提高作物的農(nóng)藝性能[1]。MYB蛋白是數(shù)量最多，功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子之一[2]，它廣泛分布在真核生物中。MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征是含有1-4個(gè)高度保守的DNA結(jié)合功能域“R”，根據(jù)R的數(shù)量將MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分為四類1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB和4R-MYB[3]。每個(gè)重復(fù)R約有51～52氨基酸，其中包含3個(gè)以17～19個(gè)氨基酸殘基為間隔的色氨酸殘基，形成3個(gè)α螺旋，其中第2和第3個(gè)形成一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)的結(jié)構(gòu)，第3個(gè)螺旋能直接結(jié)合DNA被稱為“識(shí)別螺旋”。R2R3-MYB在植物中數(shù)量最多，幾乎占MYB家族的50%以上，同時(shí)大量研究證明這類蛋白參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等多種生物過程[4]。如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中編碼R2R3-MYB類蛋白的GL1和WER基因，分別在其早期皮毛和根部特異性表達(dá)，突變體表現(xiàn)為皮毛和根毛缺失和減少，這說明這兩個(gè)基因參與了擬南芥皮毛和根毛的形成[5-6]。擬南芥在干旱條件下，AtMYB2蛋白在ABA誘導(dǎo)下，與脫水應(yīng)答基因RD22作用，促其表達(dá)增強(qiáng)，這說明AtMYB2蛋白在干旱脅迫下通過ABA途徑誘導(dǎo)基因表達(dá)中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活因子的作用[7]。將AtMYB44基因轉(zhuǎn)入大豆中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性顯著增強(qiáng)[8]。

白羊草(Bothriochloaischaemum)為禾本科孔穎草屬多年生植物。具有固土保水、生命力強(qiáng)，耐旱、高產(chǎn)耐牧等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的鄉(xiāng)土草資源[9]。但對(duì)其研究主要集中在生產(chǎn)性能[10]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[11]、生理生態(tài)[12]及遺傳多樣性上[13]等方面，尚缺乏對(duì)其抗逆優(yōu)良性狀關(guān)鍵調(diào)控基因的挖掘與利用。因前期對(duì)干旱脅迫條件下白羊草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子MYB在白羊草響應(yīng)干旱脅迫的過程中具有重要的作用[14]，因此，本研究從前期白羊草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選出的一段對(duì)干旱脅迫響應(yīng)表達(dá)量變化顯著的MYB序列為基礎(chǔ)[15]，克隆得到其全長(zhǎng)，并命名為BiMYB52，為了更好地研究BiMYB52基因在抗逆中的作用，采用染色體步移技術(shù)從白羊草中擴(kuò)增出了BiMYB52啟動(dòng)子序列，根據(jù)啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果對(duì)白羊草進(jìn)行了相應(yīng)逆境脅迫，以期了解在不同逆境脅迫下的表達(dá)特性，為深入研究BiMYB52抗逆機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的種植與處理

將采集于山西省太谷縣(采集地海拔978 m,經(jīng)緯度分別為112°34′E，37°21′N)的白羊草種子，經(jīng)過酒精浸泡30 s，0.1%升汞處理15 min消毒后，播種于蛭石和珍珠巖比例為3∶1的營(yíng)養(yǎng)缽中，出苗后培養(yǎng)約30 d，選取長(zhǎng)勢(shì)一致幼苗進(jìn)行不同的處理：放入4℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫培養(yǎng)；將白羊草幼苗根部分別置于250 mmol·L-1的氯化鈉(NaCl)、20% 聚乙二醇(PEG)和100 μmol·L-1脫落酸(Abscisic acid,ABA)的1/2 MS營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)；分別用200 μmol·L-1水楊酸(salicylic acid,SA)和100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate MeJA)噴幼苗葉片至飽和后套袋密封培養(yǎng)；每個(gè)處理5株，重復(fù)3次，分別取處理0，2，4，8，12和24 h的葉片，-80℃保存待用。

1.2 白羊草BiMYB52基因的克隆與生物信息學(xué)分析

用Trizol法提取白羊草幼葉總RNA后，采用RevertAidTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的類MYB序列，設(shè)計(jì)引物BiMYB52-F和BiMYB52-R(見表1)，以cDNA為模板，根據(jù)TA/Blunt-Zero Cloning Kit基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的超快速克隆試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板 1 μL(<200 ng)，2×Pfu Master Mix 10 μL，引物BiMYB52-F和BiMYB52-R各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s·kb-1，30 cycles；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物置于1% 瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，按照百泰克凝膠回收試劑盒的說明書，進(jìn)行目的片段的回收，然后將目的片段與T載體連接，緊接著將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含卡納抗生素進(jìn)行篩選，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。

用DNAstar 7.0分析BiMYB52基因的核酸及氨基酸序列，用ScanProsite對(duì)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。從NCBI上下載同源性較高的其他植物R2R3-MYB蛋白序列，用DNAMAN6.0對(duì)同源物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；利用MEGA5.0 軟件鄰位歸并發(fā)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 BiMYB52啟動(dòng)子克隆與分析

根據(jù)已經(jīng)克隆到的白羊草BiMYB52基因序列，分別設(shè)計(jì)SP1，SP2，SP3引物(見表1)，以白羊草DNA為模板，采用染色步移法進(jìn)行BiMYB52 基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增。根據(jù)Genome Walking Kit的說明進(jìn)行3步擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后與T載體鏈接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆送上海英俊公司測(cè)序。

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對(duì)克隆得到的BiMYB52基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.4 不同逆境脅迫下白羊草BiMYB52基因的表達(dá)特異性

用Trizol提取上述(1.1)各處理的RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄Thermo Fisher公司cDNA Synthesis Kit說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，以白羊草BiMYB52的序列設(shè)計(jì)定量引物P1和P2(見表1)，以cDNA為模板，參照Thermo Fisher公司的SYBRTMGreen PCR試劑盒說明書，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：2 μL cDNA模板，0.8 μL引物P1和0.8 μL P2，10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 5 s、60℃ 20 s，35～40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，以18S rRNA為內(nèi)參基因[16]，利用2-ΔΔCt法[17]計(jì)算BiMYB52基因在不同處理下的表達(dá)量。

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)含有Nco I和Xba I酶切位點(diǎn)的引物P5和P6(表1)，擴(kuò)增BiMYB52的啟動(dòng)子序列，得到帶有酶切位點(diǎn)的目的基因片段；用Nco I和Xba I雙酶切該基因片段和pCAMBIA1301質(zhì)粒載體，經(jīng)T4 DNA連接酶連接，得到插入目的基因的pCAMBIA1301-BiMYB52植物表達(dá)載體。將構(gòu)建pCAMBIA1301-BiMYB52表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR驗(yàn)證，挑選陽(yáng)性克隆送生物公司測(cè)序，將測(cè)序正確的pCAMBIA1301重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，在含有潮霉素的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因抗性植株，采用引物HPT-F和HPT-R通過RT-PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性苗。再經(jīng)過自交和篩選后得到T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)中的引物序列

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性分析

將野生型擬南芥種子和已鑒定出的BiMYB52-1，BiMYB52-2和BiMYB52-3轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，用75%的酒精消毒1 min，再用9%的次氯酸鈉消毒10 min，最后用滅菌的雙蒸水清洗，然后置于1/2MS固體培養(yǎng)基上。4℃冰箱中放置48 h進(jìn)行春化，之后放置于光照培養(yǎng)箱中，溫度22℃，光強(qiáng)10 000 Lx,相對(duì)濕度50%～60%，光照16 h和黑暗8 h交替進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d幼苗，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗轉(zhuǎn)至裝有蛭石的花盆中培養(yǎng)。將生長(zhǎng)至30 d的幼苗進(jìn)行干旱處理。干旱處理采用不澆水處理14 d，恢復(fù)處理采用與對(duì)照相同的培養(yǎng)方式進(jìn)行復(fù)水，復(fù)水5 d后計(jì)算存活率。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。生理指標(biāo)的檢測(cè)采用南京建成公司的試劑盒測(cè)定，丙二醛MDA含量的測(cè)定采用試劑盒A003-1，脯氨酸Pro含量的測(cè)定采用試劑盒A107。

1.7 數(shù)據(jù)梳理

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析，Duncan’s法對(duì)平均值進(jìn)行比較和Excel軟件進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白羊草BiMYB52基因的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的435 bp MYB轉(zhuǎn)錄因子片段，利用TA/Blunt-Zero Cloning Kit技術(shù)，擴(kuò)增得到1個(gè)長(zhǎng)度為1 149 bp的序列(圖2A)，其陽(yáng)性克隆菌落鑒定圖為2B。Blast比對(duì)結(jié)果顯示該序列與高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)、糜子(Panicumhallii)等物種的MYB基因高度同源，初步認(rèn)為獲得的序列是一個(gè)MYB類蛋白序列。

2.2 白羊草BiMYB52基因的生物信息學(xué)分析

BiMYB52基因含有一長(zhǎng)度為714 bp的ORF(開放閱讀框)，編碼237個(gè)氨基酸，其蛋白分子量為26.98 kDa，理論等電點(diǎn)為7.09。該蛋白的N端含有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域R2和R3(圖2)，R2和R3 N端保守基序分別為[W]-x(19)-[W]-x(19)-[W]和[W]-x(18)-[W]，說明這次克隆的蛋白屬于MYB家族的R2R3亞族。利用GenBank上的BlastP搜索到不同物種的9個(gè)R2R3-MYB蛋白序列，并進(jìn)行了比對(duì)分析，由圖3可見，該基因N端存在兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，與其他R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的同源區(qū)都集中在這一區(qū)域，C端同源性極低。

圖1 白羊草BiMYB52基因的克隆及陽(yáng)性菌落鑒定結(jié)果

圖2 R2R3-MYB蛋白N-端DNA-binding結(jié)構(gòu)域

圖3 BiMYB52氨基酸序列與其他植物R2R3-MYB蛋白的多序列比對(duì)

該基因編碼蛋白與其他物種的R2R3-MYB蛋白的同源性相對(duì)較高，與高粱同源性達(dá)到94.56%，與芒草(Miscanthuslutarioriparius)同源性達(dá)到93.7%、與谷子(Setariaitalica)、糜子、玉米、柳枝稷(Panicumvirgatum)等同源性達(dá)88.33%～92.86%。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，BiMYB52與高粱SbMYB52聚為一類，與玉米ZmMYB52，芒草MlMYB52的親緣關(guān)系較近，與野生型二粒小麥(Triticumdicoccoides)TdMYB52、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdMYB52、水稻(Oryzasativa)OsMYB52、谷子SiMYB52等也聚為一類，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。由于該系統(tǒng)樹上，功能相關(guān)的MYB大都聚到一起，故將其命名為BiMYB52。

圖4 基于氨基酸序列構(gòu)建的BiMYB52系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 BiMYB52啟動(dòng)子的克隆與序列分析

以白羊草DNA為模板，根據(jù)白羊草中克隆到的BiMYB52基因開放閱讀框序列，設(shè)計(jì)特異性引物SP1,SP2,SP3(表1)，采用步移法得到2 127 bp啟動(dòng)子序列(圖5)。利用Plant-CARE對(duì)克隆得到的BiMYB52基因啟子序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，序列中除含有TATA-box(17個(gè))和CAAT-box(7個(gè))一般啟動(dòng)子所具有的特征元件[18]，還含有能響應(yīng)ABA調(diào)控的5個(gè)順式作用元件ABRE，2個(gè)與脅迫和水楊酸SA響應(yīng)的順式作用元件W-box，5個(gè)與缺水、抗脫落酸、抗凍均有響應(yīng)的結(jié)構(gòu)MBS，1個(gè)與干旱、高鹽、低溫誘導(dǎo)相關(guān)的結(jié)構(gòu)DRE，1個(gè)參與脫落酸應(yīng)答的元件DPBFCOREDCDC3，1個(gè)與胚乳表達(dá)相關(guān)的結(jié)構(gòu)Skn-1-motif，10個(gè)光響應(yīng)元件ATCT-motif，5個(gè)與SA響應(yīng)相關(guān)的元件GCCCORE，1個(gè)與光響應(yīng)和MeJA響應(yīng)相關(guān)的G-box。具體結(jié)構(gòu)和數(shù)量見表2。

圖5 白羊草BiMYB52啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 BiMYB52基因啟動(dòng)子順式作用元件種類和數(shù)量及功能分析

2.4 逆境脅迫下白羊草BiMYB52基因的表達(dá)分析

利用RT-qPCR對(duì)白羊草BiMYB52基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，多種逆境脅迫均能誘導(dǎo)白羊草BiMYB52基因的增強(qiáng)表達(dá)。在20% PEG脅迫誘導(dǎo)下，BiMYB52的表達(dá)量隨時(shí)間上調(diào)，8 h表達(dá)量達(dá)到高峰，為對(duì)照的26倍，然后又下降(圖6A)；NaCl脅迫下BiMYB52的表達(dá)量在8 h之前無明顯變化，8 h開始增加，12 h達(dá)到最大，此時(shí)表達(dá)量增加為對(duì)照的9倍，而后又迅速下降(圖6B)；冷脅迫下(4℃)BiMYB52的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高12 h達(dá)到峰值，后降低的趨勢(shì)(圖6C)；外源ABA也能明顯誘導(dǎo)BiMYB52的表達(dá)，也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，8 h時(shí)表達(dá)量最大，是對(duì)照的4倍(圖6D)；SA處理后，4 h出現(xiàn)第一高峰，隨后迅速下降(圖6E)；MeJA處理后2 h就出現(xiàn)第一次高峰，而后第二次高峰出現(xiàn)在12 h，此時(shí)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平低于2 h(圖6F)；這些結(jié)果表明，BiMYB52的表達(dá)受多種脅迫和激素影響。

圖6 BiMYB52在不同脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)量變化分析

2.5 表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

采用PCR法擴(kuò)增帶有Nco I和Xba I酶切位點(diǎn)的BiMYB52啟動(dòng)子基因序列(圖7A)，獲得大小約為2 167 bp目的片段，將該目的片段與經(jīng)過Nco I和Xba I雙酶切的pCAMBIA1301載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR驗(yàn)證，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖7B)，得到與預(yù)期大小一致的片段，證明含有目的基因的pCAMBIA1301-BiMYB52植物表達(dá)載體已經(jīng)構(gòu)建完成。用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，在含有潮霉素的培養(yǎng)基篩選得到5個(gè)株系(圖8)，以得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA為模板，采用引物HPT-F和HPT-R(表1)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測(cè)，獲得與預(yù)期598 bp大小一致的片段(圖8)。選取BiMYB52-1，BiMYB52-2和BiMYB52-3轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行干旱脅迫分析。

圖7 帶酶切位點(diǎn)BiMYB52啟動(dòng)子的擴(kuò)增和表達(dá)載體pCAMBIA1301-BiMYB52的PCR鑒定

圖8 轉(zhuǎn)BiMYB52基因擬南芥T1代株系PCR鑒定

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性分析

為方便我們把BiMYB52-1，BiMYB52-2和BiMYB52-3轉(zhuǎn)基因株系分別命名為OE1，OE2和OE3。由圖9所示，野生型和轉(zhuǎn)基因BiMYB52擬南芥在干旱脅迫前后的存活率無明顯差異，干旱脅迫復(fù)水后，轉(zhuǎn)基因擬南芥OE1，OE2和OE3存活率較高，分別為80.4%，86.5%和71.3%，而野生型擬南芥的存活率僅為31.3%。圖10和11表明，正常供水條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥丙二醛MDA和脯氨酸Pro含量無顯著差異，干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥OE1，OE2和OE3丙二醛MDA含量均顯著低于野生型(P<0.05)，而脯氨酸Pro含量均顯著高于野生型(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫條件下積累的丙二醛MDA較少，但脯氨酸Pro含量較多。

圖9 干旱脅迫復(fù)水后的存活率

圖10 正常和干旱脅迫條件下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的丙二醛(MDA)含量

圖11 正常和干旱脅迫條件下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的脯氨酸含量

3 討論

植物中MYB蛋白首次發(fā)現(xiàn)是在玉米蛋白微粒中分離出的參與花青素合成ZmMYB基因[19]，后來隨著擬南芥MYB家族基因被逐漸鑒定出來，許多功能異同的MYB蛋白在多種植物中被分離和鑒定出來[20]。本研究利用前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的一段MYB序列，從白羊草中克隆出1個(gè)BiMYB52基因，其cDNA全長(zhǎng)1 149 bp，含714 bp的ORF，編碼237個(gè)氨基酸，其N端構(gòu)成了R2，R3兩個(gè)典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，形成2個(gè)HTH(螺旋轉(zhuǎn)角螺旋)結(jié)構(gòu)[3]，這種結(jié)構(gòu)有助于與DNA分子結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮功能[21-22]。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，BiMYB52與高粱SbMYB52(XP_002466556.1)的同源性最高，達(dá)到94.44%。

R2R3-MYB蛋白已經(jīng)被證明對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)至關(guān)重要。過去的許多研究已經(jīng)報(bào)道了一些R2R3-MYB蛋白與植物抗逆性相關(guān)的功能。例如，擬南芥AtMYB60是氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)因子，受干旱脅迫的影響，過表達(dá)該基因會(huì)抑制對(duì)水分的敏感性[23]，AtMYB96，AtMYB15和AtMYB2在干旱脅迫的誘導(dǎo)下，通過激活脫水應(yīng)答基因(如RD22)的轉(zhuǎn)錄來充當(dāng)耐旱的正調(diào)控因子[7,24]，除擬南芥外，還在蘋果[25]、水稻[26]、小麥[27]等植物中發(fā)現(xiàn)了R2R3-MYB基因在其對(duì)干旱響應(yīng)中起著重要作用。AtMYB20通過抑制PP2Cs表達(dá)來增強(qiáng)抗鹽性[28]，TaMYB56-B和LcMYB1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中能夠正調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和鹽反應(yīng)[29]。不同物種中的MYB蛋白能夠響應(yīng)冷、鹽和干旱脅迫響應(yīng)。如GmMYB92[30]和TaMYB56-B控制鹽和冷反應(yīng)，OsMYB4 調(diào)節(jié)干旱和寒冷反應(yīng)[31]。因此，MYB蛋白質(zhì)可能是植物對(duì)多種非生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)。眾所周知，ABA作為一種信號(hào)分子，在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。研究證明，擬南芥AtMYB60和AtMYB96參與調(diào)控依賴ABA的干旱脅迫反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)來提高植物抗旱能力[32-33]，Ding等報(bào)道了擬南芥基因AtMYB15的過量表達(dá)可以調(diào)高擬南芥對(duì)ABA的敏感性，并提高了植物的抗旱性[34]。本研究發(fā)現(xiàn)在外源激素ABA，SA，MeJA和干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫，均能誘導(dǎo)mRNA的積累，對(duì)轉(zhuǎn)基因BiMYB52擬南芥抗旱性的研究表明，干旱脅迫復(fù)水后，轉(zhuǎn)基因擬南芥存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生擬南芥；干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥MDA含量的減少，說明干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞膜透性減弱，這可以減緩干旱脅迫的植物傷害，脯氨酸含量的增加可提高植物的滲透調(diào)節(jié)能力，從而增加植物的耐旱性。說明BiMYB52基因可能通過體內(nèi)ABA，SA和MeJA多種激素信號(hào)途徑來參與白羊草抗旱性調(diào)控。這是因?yàn)锽iMYB52基因的啟動(dòng)子區(qū)域上含有ABREs元件(ACGT)，W-box，G-box和一些與干旱、鹽脅迫和低溫脅迫相關(guān)的順式作用元件。

4 結(jié)論

本研究以前期白羊草干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中所獲得一段類MYB序列，利用基于拓?fù)洚悩?gòu)酶快速擴(kuò)增法從白羊草中克隆到R2R3-MYB型的基因BiMYB52，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其N端具有較高的保守性。利用染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動(dòng)子，通過對(duì)啟動(dòng)子的分析對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)的脅迫處理，發(fā)現(xiàn)BiMYB52不僅受低溫、干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)，同時(shí)外源激素ABA，SA和MeJA也能誘導(dǎo)其表達(dá)量增加。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行干旱脅迫，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株干旱脅迫復(fù)水后存活率、丙二醛MDA和脯氨酸含量的測(cè)定表明轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性明顯優(yōu)于野生擬南芥。這位進(jìn)一步揭示白羊草BiMYB52基因在非生物脅迫中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。