沈婷婷， 朱哿瑞， 王 帆， 孫 鑫， 黃 愷， 彭 淵， 陶艷艷， 劉成海,

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院·肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明確肝損傷因素所致的，以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變?yōu)樘卣鞯呐R床綜合征。其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。谷胱甘肽是細(xì)胞中合成最豐富的低分子量抗氧化劑，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷和外源親電子試劑的毒性，以及維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)主要存在于肝臟內(nèi)[3]，是一組與肝臟解毒功能有關(guān)的酶，參與細(xì)胞損傷、缺氧、中毒、衰老等過程[4]。據(jù)編碼基因的不同將GST分為三個(gè)亞家族[5]，其中線粒體GST在肥胖癥、糖尿病等能量和脂類代謝中起到非常重要的作用[6]。本研究通過高脂飲食建立小鼠NAFLD模型，采用RNA-Seq技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析探討GST在NAFLD中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性C57BL/6J小鼠，14只，SPF級(jí)，體質(zhì)量23～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可號(hào)：SCXK(滬)2020-0009；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(滬)2020-009。溫度21～25 ℃，濕度55%～65%，12 h明暗光照循環(huán)。

1.1.2 試劑 60 kcal%脂肪的高脂飼料(貨號(hào):112252)，購于戴茨生物科技(無錫)有限公司。ALT試劑盒(批號(hào)：20130110)、AST試劑盒(批號(hào)：20130411)、TG、蘇木素-伊紅染液(貨號(hào)：D006-1-3)，均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑(批號(hào)：F919KB3054)、總RNA提取試劑盒(批號(hào)：B518811)，購于生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RR047)、擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào)：RR820)，購于日本Takara株式會(huì)社。

1.1.3 儀器 熒光倒置顯微鏡，日本Olympus株式會(huì)社(型號(hào)：Olympus IX70)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Life Technonogy公司(型號(hào)：ABI Vii A7)；超微量分光光度計(jì)，美國Thermo Scientific公司(型號(hào)：NanoDrop 2000)；生物分析儀，美國Agilent Technologies公司(型號(hào)：Agilent 2100 Bioanalyzer)；高通量測(cè)序儀，美國Illumina公司(型號(hào)：Illumina HiSeq X Ten)。

1.2 分組與造模 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽樣分為對(duì)照組(n=6)和模型組(n=8)。小鼠自由飲水，對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)普通飼料、模型組喂養(yǎng)高脂飼料(熱量比：碳水化合物20%，脂肪60%，蛋白質(zhì)20%)，連續(xù)7周。造模結(jié)束后，小鼠禁食16 h，3 %戊巴比妥鈉麻醉、固定，打開腹腔，下腔靜脈取血，4 ℃、3000 r/min離心15 min，血清置于-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定ALT、AST、TG。肝右葉切割1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小置于4%甲醛固定液中，用于HE染色。另取肝組織各100 mg存于TRIzol中，用于提取RNA。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清ALT、AST、TG測(cè)定 按試劑盒說明書測(cè)定小鼠血清中ALT、AST活性及TG水平。

1.3.2 肝臟病理情況 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察小鼠肝組織病理。小鼠肝組織經(jīng)4%中性甲醛緩沖液固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水、石蠟包埋、4 μm切片、HE染色、光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。脂肪肝分級(jí)依據(jù)肝細(xì)胞脂肪變性占據(jù)所獲肝組織標(biāo)本量范圍，分為F0～4：F0<5%肝細(xì)胞脂肪變；F1：5%～30%肝細(xì)胞脂肪變；F2：31%～50%肝細(xì)胞脂肪變；F3：51%～75%肝細(xì)胞脂肪變；F4：75%以上肝細(xì)胞脂肪變[1,7]。油紅染色方法：肝臟冰凍切片(8 μm厚度)用于脂質(zhì)染色。切片用甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水洗滌；油紅O染液染色15 min，60%異丙醇分色3～5 s，去多余染液，蒸餾水洗；Mayer蘇木精復(fù)染；自來水洗(藍(lán)化)1～3 min；蒸餾水洗；甘油明膠封片。

1.3.3 肝組織RNA提取 TRIzol提取肝組織總RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)評(píng)估RNA的純度和含量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeq X Ten 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生150 bp的雙端數(shù)據(jù)。建庫測(cè)序及數(shù)據(jù)分析部分由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.3.4 參考基因組比對(duì) 利用hisat2(2.2.1.0)軟件將Clean Reads與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測(cè)序樣品特有的序列特征信息。

1.3.5 蛋白編碼基因表達(dá)水平分析 用已知的參考基因序列以及注釋文件作為數(shù)據(jù)庫，采取序列相似性比對(duì)的方法鑒定出各蛋白編碼基因在各樣本中的表達(dá)豐度。使用htseq-count(0.9.1)軟件獲取每個(gè)樣本中比對(duì)到蛋白編碼基因上的reads數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算蛋白編碼基因的表達(dá)量FPKM(Fragment Per Kilo Bases per Million reads)值。

1.3.6 差異表達(dá)基因篩選 基于基因表達(dá)水平分析獲得的reads數(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，利用DESeq(v1.18.0)軟件對(duì)各個(gè)樣本基因的reads數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(采用basemean值來估算表達(dá)量)，計(jì)算差異倍數(shù)，并采用負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，最終根據(jù)差異倍數(shù)及差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果來篩選差異蛋白編碼基因，篩選差異的條件為P<0.05且差異倍數(shù)(fold change, FC)≥2[8]。

1.3.7 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析 得到差異基因后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。方法：將全部蛋白編碼基因作為背景列表，差異蛋白編碼基因列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用超幾何分布檢驗(yàn)，計(jì)算P值，Benjamini & Hochberg多重檢驗(yàn)糾正后，對(duì)于correctedP-value<0.05的GO條目定義為差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。將差異表達(dá)基因應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其參與的信號(hào)通路。以correctedP-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選在差異表達(dá)基因中顯著富集的信號(hào)通路。

1.3.8 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證 切取全部小鼠肝組織50 mg，加入500 μL TRIzol試劑及100 μL氯仿抽提總RNA，應(yīng)用Prime ScriptTMRT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增以檢測(cè)各組肝組織中mRNA的表達(dá)水平。擴(kuò)增引物由AZENTA(https://www.azenta.com)公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-△△CT法表示各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列表

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食建立NAFLD的小鼠模型 高脂飼料喂養(yǎng)前，對(duì)照組和模型組小鼠體質(zhì)量無明顯差異[(21.73±0.45)g vs (21.93±0.67)g，t=-0.598，P=0.561)]；高脂飲食喂養(yǎng)7周后，與對(duì)照組相比，模型小鼠體質(zhì)量增加，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(26.63±2.52)g vs (31.10±3.57)g，t=-2.601，P=0.230]。對(duì)照組和模型組ALT、AST差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(32.17±4.31)U/L vs (50.25±30.08)U/L，t=-1.447，P=0.173；(85.50±38.52)U/L vs (146.13±88.52)U/L，t=-1.558，P=0.145)]。與對(duì)照組相比，模型組血清TG明顯高于對(duì)照[(2.02±0.50)mmol/L vs (1.00±0.29)mmol/L，t=-4.45，P=0.001]。HE染色結(jié)果提示：對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整、無脂肪變性；模型組可見肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性和氣球樣變。油紅染色顯示：對(duì)照組肝細(xì)胞未見明顯脂滴；模型組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)橘紅色脂滴數(shù)量增多，大小不一(圖1)；模型組肝細(xì)胞脂肪變分級(jí)明顯高于對(duì)照組(1.88±0.64 vs 1.00±0.00，t=-3.86，P=0.006)(圖2)。

圖1 兩組小鼠組織病理學(xué)結(jié)果

圖2 兩組血清TG水平及肝組織脂肪變分級(jí)比較

2.2 組織表達(dá)差異基因分析 將P<0.05且基因表達(dá)量差異倍數(shù)≥2.0的基因定義為差異表達(dá)基因。與對(duì)照組相比，模型組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異表達(dá)基因共1367個(gè)，其中上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)分別為608個(gè)和759個(gè)。GO分析顯示：脂質(zhì)分解代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝過程、糖異生等呈顯著富集，與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)。差異表達(dá)基因GO富集分析前60(篩選3種分類中對(duì)應(yīng)差異基因數(shù)目大于2的GO條目，按每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的qvalue 由大到小排序的各20條)條形圖展示見圖3。KEGG分析顯示：PPAR信號(hào)通路、膽固醇代謝、脂肪酸代謝等呈顯著富集，與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。差異表達(dá)基因KEGG富集前30氣泡圖見圖4。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分析

圖4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

2.3 GST基因功能分析 高脂飲食誘導(dǎo)17個(gè)GST基因的差異表達(dá)：GSTa2、GSTa4、GSTp1、GSTp-ps、GSTo1、GSTa1、GSTt3、GSTk1、GSTm1、GSTm4、GSTp2、GSTa3、GSTz1、GSTt1、GSTt2、GSTm2、GSTm3。GO富集分析顯示：GST基因同時(shí)參與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、膽固醇代謝過程等多個(gè)生物學(xué)過程，與線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞器內(nèi)膜、呼吸體等細(xì)胞分組相關(guān)，分子功能涉及轉(zhuǎn)移酶活性、單加氧酶活性、氧化還原酶活性等。KEGG富集分析顯示：GST基因參與藥物代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)異生素的代謝、谷胱甘肽代謝等。GO富集分析顯示：谷胱甘肽代謝過程呈顯著富集，KEGG通路分析顯示谷胱甘肽代謝通路顯著富集，差異基因見表2。上述結(jié)果提示GST可能在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝模型中發(fā)揮重要作用。

2.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證 從17個(gè)GST差異基因中選擇差異最明顯的前10個(gè)GST基因(表2)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用熒光定量PCR驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果的可靠性，差異表達(dá)基因驗(yàn)證結(jié)果見圖5，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異基因變化趨勢(shì)一致，其中GSTa2、GSTa3、GSTa4、GSTm1、GSTm2、GSTm3、GSTm4、GSTp1、GSTo1表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，GSTk1表達(dá)上調(diào)，從而進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。

圖5 RT-PCR驗(yàn)證小鼠肝組織中差異表達(dá)基因mRNA的表達(dá)

表2 GST差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析

3 討論

GST曾被稱為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，是一組Ⅱ期解毒酶，能催化還原型谷胱甘肽與多種內(nèi)源性/外源性親電子化合物結(jié)合。GST基因的遺傳多態(tài)性可參與NAFLD、不同病因的肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[9-10]。因此，研究GST基因在NAFLD中的表達(dá)及其作用具有一定意義。

非酒精性肝脂肪變是NAFLD疾病譜之一[1]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)7周，誘導(dǎo)NAFLD模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量與肝功能無明顯變化，HE染色和油紅染色可見肝細(xì)胞呈現(xiàn)小泡性脂肪變，脂肪變積分為1.88±0.64，提示NAFLD模型建立。

本研究采用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型與正常小鼠差異基因，共篩選出1367個(gè)特異性差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因數(shù)608個(gè)、下調(diào)基因數(shù)759個(gè)。生物信息學(xué)通路分析顯示這些差異基因參與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、膽固醇代謝過程等多個(gè)生物學(xué)過程，與線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞器內(nèi)膜、呼吸體等細(xì)胞分組相關(guān)，分子功能涉及轉(zhuǎn)移酶活性、單加氧酶活性、氧化還原酶活性等，與既往的研究一致。GO富集分析顯示谷胱甘肽代謝過程富集，KEGG通路分析顯示谷胱甘肽代謝通路富集。

已知的人類GST基因家族由六個(gè)亞家族組成：α(GSTA-alpha)、μ(GSTM-miu)、ω(GSTO-omega)、π(GSTP-pi)、θ(GSTT-theta)和ξ(GSTZ-zeta)[11]。人GST基因約有29個(gè)亞型(https://www.genecards.org)。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型發(fā)現(xiàn)17個(gè)GST家族基因差異表達(dá)，占人GST家族基因的58.62%，提示GST相關(guān)基因可能參與NAFLD的進(jìn)展。選擇差異倍數(shù)最明顯的前10個(gè)GST相關(guān)基因，采用qRT-PCR驗(yàn)證小鼠肝組織中GST相關(guān)基因表達(dá)，最終結(jié)果提示其表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序差異分析的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。

GST在細(xì)胞解毒以及保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)源性與外源性氧化應(yīng)激損傷中起著至關(guān)重要的作用[9]。GSTp1 A313G基因多態(tài)性研究表明NAFLD患者G等位的攜帶頻率更高[12]，G等位基因是NAFLD 的危險(xiǎn)因素[13]，提示GSTp1基因多態(tài)性與NAFLD發(fā)生相關(guān)。與健康成年人相比，NAFLD患者的脂肪因子失衡，瘦素濃度升高，脂聯(lián)素水平降低[14]。Prysyazhnyuk等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，與基因型正常的NAFLD 患者相比，GSTm1無效基因型患者的瘦素血漿水平顯著升高。Lan等[2]發(fā)現(xiàn)NASH誘導(dǎo)肝細(xì)胞GSTm2下調(diào)，肝細(xì)胞GSTm2通過阻斷ASK1 N端二聚化和磷酸化阻止NASH進(jìn)展。GSTa4的缺失可加劇NAFLD的發(fā)生[16]，表現(xiàn)為肝臟脂肪變性、氧化應(yīng)激，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、TNFα、IL-6升高等。Nrf2是氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)GSTa2基因的激活，提高抗氧化應(yīng)激能力，與NAFLD發(fā)生密切相關(guān)[17]。然而，朱雅莉等[18]應(yīng)用iTRAQ技術(shù)定量分析NASH患者肝組織中的差異蛋白發(fā)現(xiàn)，GSTm4在NASH患者肝組織中上調(diào)，與本研究結(jié)果相反，故GSTm4與NASH的關(guān)系，需進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食導(dǎo)致GSTa3、GSTm3、GSTo1、GSTk1在NAFLD模型組中差異表達(dá)，盡管這些基因在NAFLD相關(guān)報(bào)道很少，但是GO和KEGG分析顯示這些GST基因參與抗氧化活性、氧化還原酶活性等多個(gè)與NALFD發(fā)生相關(guān)的過程，是進(jìn)一步研究的方向。

本研究采用高脂飲食建立模型，其肝臟脂肪變較輕，且炎癥改變不明顯，但仍發(fā)現(xiàn)GST基因表達(dá)差異，提示在NAFLD發(fā)生的早期已有GST基因改變。GST通過參與類固醇代謝過程、脂肪酸代謝過程、膽固醇代謝過程等多個(gè)生物學(xué)過程影響脂質(zhì)代謝，與NAFLD發(fā)病密切相關(guān)，后期將深入討論GST相關(guān)基因參與NAFLD的病理機(jī)制，以期為NAFLD治療提供依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年7月2日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PZSHUTCM210702004，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：沈婷婷負(fù)責(zé)生化檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析與撰寫論文；朱哿瑞、王帆負(fù)責(zé)動(dòng)物造模；孫鑫、黃愷負(fù)責(zé)動(dòng)物病理；彭淵負(fù)責(zé)生信分析；陶艷艷、劉成海負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。