張家瑞，剡文亮，宋 潔，龐 路，田江亞，何 軍，李智星，魏 勇*

（ 1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆 烏魯木齊 830063 ； 2.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830063 ）

隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)逐步實(shí)現(xiàn)規(guī)?；同F(xiàn)代化，奶牛受到自身免疫能力下降、飼養(yǎng)環(huán)境不良、天氣驟然變化、日糧營養(yǎng)攝入失衡以及致病菌侵入等諸多因素影響均可能引起奶牛乳房炎，對養(yǎng)牛業(yè)造成一定經(jīng)濟(jì)損失[1]。對于奶牛臨床型乳房炎，獸醫(yī)可通過觀察奶牛乳頭狀況和乳汁的顏色、氣味、黏稠度以及有無絮片、凝塊等臨床癥狀進(jìn)行診斷。有研究發(fā)現(xiàn)，能夠引起奶牛乳房炎的常見致病菌有二十多種，其中包括許多易產(chǎn)生耐藥性的菌株；無法較準(zhǔn)確獲知主要致病菌，會(huì)對后續(xù)針對性的臨床治療和處置方案制定造成巨大障礙[2]?；茧[性乳房炎的奶牛一般不會(huì)表現(xiàn)明顯的臨床體征變化，但牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量會(huì)受到嚴(yán)重影響。為快速、準(zhǔn)確地篩選出可能患有隱性乳房炎的牛，需結(jié)合多種快速檢測方法進(jìn)行判定才更具科學(xué)性和實(shí)用性。

近年來，運(yùn)用快檢方法和致病菌分離鑒定法對當(dāng)?shù)氐哪膛Ｈ榉垦谆疾∏闆r和主要致病菌種類的研究逐漸受到重視。羅金印等[3]應(yīng)用蘭州乳房炎檢測法（MT）診斷法進(jìn)行蘭州地區(qū)奶牛乳房炎流行病學(xué)調(diào)查及病原菌的分離鑒定。胡海燕等[4]先采用美國加州乳房炎（CMT）方法篩選出天津某牧場患乳房炎病奶牛，再通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對乳房炎奶樣、患病牛畜舍及奶廳樣品進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，了解了牧場奶牛乳房炎奶樣及環(huán)境中細(xì)菌的種類和流行性。奶牛乳房炎的快速診斷和主要致病菌的鑒定會(huì)提高牧場奶牛乳房炎的治愈率，降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的概率。本試驗(yàn)采用CMT和體細(xì)胞數(shù)檢測（SCC）對隱性型乳房炎進(jìn)行快速診斷，臨床外觀法診斷臨床型乳房炎并進(jìn)行主要致病菌分離鑒定，以期為該場奶牛乳房炎后續(xù)治療和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腦心浸出液肉湯（BHI）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂基均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，伊紅美藍(lán)瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，30%過氧化氫溶液購自西安化學(xué)試劑廠，革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，CMT檢測試劑購自生泰爾（內(nèi)蒙古）科技有限公司。

Ⅲ型體細(xì)胞檢測儀購自華誠睿光（中國）生物科技有限公司、電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海鴻都電子科技有限公司、超凈工作臺(tái)購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

1.2 樣品來源

該某規(guī)?；膛鼋刂怪?022年7月存欄量為1 771頭，其中泌乳牛728頭、干奶牛118頭、青年牛698頭、犢牛227頭。泌乳?；撅曫B(yǎng)于封閉式圈舍，犢牛飼養(yǎng)于犢牛島和半開放式牛棚，其他牛群飼養(yǎng)于開放式牛棚。

本試驗(yàn)對該規(guī)?；膛龅?28頭荷斯坦泌乳牛進(jìn)行臨床觀察，從每頭患臨床乳房炎奶牛的患病乳區(qū)采集乳樣15 mL，共采集臨床型乳房炎牛乳汁12份。從每頭CMT陽性奶牛的患病乳區(qū)采集乳樣15 mL，共采集隱性乳房炎牛乳汁39份。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 臨床型乳房炎診斷

該牛場擠奶廳采用全自動(dòng)套杯式擠奶機(jī)，棄頭三把奶時(shí)檢查乳汁是否存在顏色、性狀等的變化，若出現(xiàn)氣味惡臭、清水樣、絮片和凝塊等典型的乳房炎癥狀則可診斷為臨床型乳房炎。

1.3.2 CMT檢測及結(jié)果判定

擠奶前進(jìn)行乳區(qū)藥浴，隨后用經(jīng)過消毒的熱毛巾擦拭待檢乳頭，擦拭完一頭牛后立刻更換毛巾再擦拭下一頭。待檢乳頭隨后經(jīng)碘伏溶液藥浴35 s后，棄頭三把奶，檢測員將檢測盤水平放置于對應(yīng)待檢乳頭下，將乳汁分別擠在對應(yīng)的檢測盤內(nèi)。棄去多余乳汁，使各檢測盤內(nèi)的乳汁量基本一致，向每個(gè)檢測杯中加入與乳汁等量的CMT檢測液，水平搖勻兩種液體，按照CMT試劑判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行隱性乳房炎判定。

CMT檢測結(jié)果判定：乳汁和CMT檢測液混合后，無明顯變化且不出現(xiàn)沉淀，或少許沉淀但不久即消失判為陰性（-）；出現(xiàn)少量凝膠沉淀判為弱陽性（+）；出現(xiàn)大量凝膠塊呈凹凸附著于盤底判為陽性（++）；出現(xiàn)整塊凝膠塊，無法回轉(zhuǎn)攪動(dòng)附著于盤底判為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3.3 SCC檢測及結(jié)果判定

采用15 mL乳樣收集管收集CMT檢測結(jié)果為“+”以上的乳區(qū)乳汁樣品，送至牛場化驗(yàn)室，按照Ⅲ型體細(xì)胞檢測儀操作說明書進(jìn)行乳樣SCC診斷檢測。

SCC檢測結(jié)果判定：根據(jù)國際乳業(yè)聯(lián)合會(huì)（IDF）牛乳體細(xì)胞數(shù)推薦分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的具體規(guī)定，牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)在50萬個(gè)/mL以上的牛可判斷為隱性乳房炎[5]。

1.3.4 細(xì)菌分離鑒定

無菌采集患臨床型奶牛乳房炎的乳汁樣品，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用無菌槍頭吸取100 μL乳汁滴加并涂布至BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24 h，觀察培養(yǎng)基中菌落形態(tài)、顏色和大小，逐一挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化。細(xì)菌被純化至只能觀察到單一形態(tài)的菌落時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，100倍油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

根據(jù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌分別無菌挑取BHI培養(yǎng)基中的單個(gè)菌落劃線于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24 h后，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征按照奶牛乳房炎細(xì)菌分離鑒定程序[6]進(jìn)行初步鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件、SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)待檢奶牛胎次與奶牛隱性乳房炎頭陽性率的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛場臨床型乳房炎和隱性乳房炎患病率（見表1、表2）

由表1可知，本試驗(yàn)對728頭泌乳奶牛進(jìn)行乳房炎患病率調(diào)查，發(fā)現(xiàn)12頭奶牛的12個(gè)乳區(qū)患臨床型乳房炎，該規(guī)模化奶牛場的臨床型乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為1.65%（12/728）和0.41%（12/2 896），瞎乳頭率為0.55%（16/2 912）。

表1 奶牛場奶牛臨床型乳房炎患病情況Tab.1 Prevalence of clinical mastitis in dairy cows

由表2可知，運(yùn)用CMT法從剩余未表現(xiàn)出臨床乳房炎癥狀的716頭奶牛中檢測出隱性乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為5.45%（39/716）和1.46%（42/2 884）。為避免肉眼觀察造成的失誤，將39頭奶牛的42個(gè)乳區(qū)的乳樣進(jìn)行SCC法檢測，結(jié)果均為隱性乳房炎。

表2 奶牛場奶牛隱性乳房炎患病情況Tab.2 Prevalence of latent mastitis in dairy cows

2.2 不同胎次的奶牛隱性奶牛乳房炎的患病情況（見表3）

由表3可知，該規(guī)?；膛霾煌ゴ伍g的奶?；茧[性乳房炎的頭陽性率存在明顯差異，其中4胎泌乳牛隱性乳房炎的患病頭數(shù)明顯高于其他胎次的泌乳牛，6胎及以上泌乳牛的頭陽性率明顯高于其他胎次。

表3 不同胎次的奶牛隱性奶牛乳房炎的患病情況Tab.3 Prevalence of recessive mastitis in cows with different parity

2.3 細(xì)菌分離鑒定試驗(yàn)結(jié)果（見圖1）

由圖1（a）~圖1（c）可知，挑取BHI瓊脂中經(jīng)分離純化出的單一菌落，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察到呈圓形或橢圓形，單個(gè)菌體較大，多成簇、成對或單個(gè)存在的革蘭氏陽性菌。單個(gè)菌體稍小，多為鏈狀排列，鏈的長短不一，長者可多達(dá)十幾乃至近百個(gè)菌體相連；短者為成對出現(xiàn)的革蘭氏陽性菌和兩端圓，中等大，單個(gè)或兩個(gè)菌體相連出現(xiàn)的革蘭氏陰性短桿菌。

由圖1（d）可知，甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基上的菌落生長良好，呈黃玉米色且不透明，菌落下的瓊脂也呈黃玉米色。由圖1（e）可知，哥倫比亞血瓊脂上的菌落灰白色不透明，出現(xiàn)β溶血。由圖1（f）可知，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落生長旺盛，菌落呈粉紅色，不透明，菌落下的瓊脂也呈粉紅色。由圖1（g）可知，伊紅美藍(lán)瓊脂中觀察到帶有金屬光澤的單個(gè)菌落。由圖1（h）可知，圓圈中3%過氧化氫溶液中出現(xiàn)氣泡，方框中3%過氧化氫溶液中無氣泡。

圖1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 Results of bacterial isolation and identification

3 討論

如今，奶牛乳房炎仍然是阻礙養(yǎng)牛業(yè)良性發(fā)展的因素之一?？焖?、準(zhǔn)確地篩選出可能患有隱性乳房炎的牛及較準(zhǔn)確地獲知引起奶牛乳房炎的主要致病菌，以減少制定后續(xù)針對患乳房炎牛的臨床治療和處置方案的障礙，從而降低其對牛奶質(zhì)量和產(chǎn)量方面造成的經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)[7]。

3.1 該牛場奶牛乳房炎的患病率較低但仍需改善

本試驗(yàn)通過采用CMT和SCC對隱性型乳房炎進(jìn)行診斷，臨床外觀法診斷臨床型乳房炎。結(jié)果顯示，該規(guī)?；膛龅呐R床型乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為1.65%（12/728）和0.41%（12/2 896）；隱性乳房炎頭陽性率及乳區(qū)陽性率分別為5.45%（39/716）和1.46%（42/2 884）；瞎乳頭率為0.55%（16/2 912）。

宋家騏等[8]對兗州區(qū)某規(guī)模牛場進(jìn)行隱性乳房炎和臨床型乳房炎實(shí)地調(diào)查，奶牛隱性乳房炎的陽性率為23.7%，臨床型乳房炎發(fā)病率為4.3%。劉鴿等[9]采用SCC法對石河子某奶牛場奶牛隱性乳房炎的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，頭陽性率高達(dá)39.81%（164/412），乳區(qū)陽性率為26.95%（436/1 618）。雖然本研究中牛場奶牛乳房炎的患病率低于上述調(diào)查結(jié)果，但該牛場的奶牛乳房炎患病情況和國內(nèi)一流奶牛養(yǎng)殖企業(yè)的養(yǎng)殖水平仍存在一定距離，還需具體分析復(fù)雜的患病原因，方可有效改善泌乳牛的健康情況。

3.2 不同胎次的奶?；茧[性乳房炎的主要風(fēng)險(xiǎn)因素不同

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該牛場不同胎次間的奶?；茧[性乳房炎的頭陽性率均差異顯著，其中6胎及以上的泌乳牛的隱性乳房炎的患病頭數(shù)均顯著高于其他胎次的泌乳牛。劉鴿[10]對新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；膛龅?12頭澳系荷斯坦泌乳牛進(jìn)行的乳房炎患病情況調(diào)查，使用LMT法和SCC法統(tǒng)計(jì)分析出奶牛的生產(chǎn)胎次和奶牛乳房炎患病率呈正相關(guān)，奶牛乳房炎患病率與年齡增長基本呈正相關(guān)，與本研究得出的結(jié)果相似。

初步分析出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是年齡偏大的奶牛乳房韌帶松弛，下墜的乳頭會(huì)增加擠奶工檢查乳汁性狀變化的難度，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)處于乳房炎初期的牛乳汁異常情況，導(dǎo)致患病奶牛不能及時(shí)得到治療，后續(xù)增加了發(fā)展成隱性乳房炎的概率，患牛還會(huì)變?yōu)椴粩嗯哦镜膫魅驹?，威脅同群其他健康牛[11]。此外，日常的生產(chǎn)中，年齡偏大的奶牛乳房受傷的概率會(huì)大大增加，加之年齡偏大的奶牛自身免疫力下降，感染乳房炎致病菌的機(jī)會(huì)增加。因此，在奶牛場的實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)有計(jì)劃地淘汰年齡偏大的奶牛，適時(shí)調(diào)整泌乳牛年齡結(jié)構(gòu)。

本研究中，頭胎牛的隱性乳房炎的頭陽性率稍低于4胎牛，分析原因可能是頭胎牛攻擊性強(qiáng)，對待擠奶員的刺激會(huì)有激烈的自衛(wèi)性反應(yīng)，擠奶員出于對個(gè)人安全的考慮會(huì)放棄對其進(jìn)行細(xì)致消毒。此外，若擠奶前消毒不規(guī)范，未做到在擦完前一頭奶牛后及時(shí)更換毛巾；擠奶員在擠完患病牛后不及時(shí)清洗雙手或更換橡膠手套，只在一批牛擠奶完畢后才進(jìn)行手套的消毒工作，不規(guī)范操作極易造成健康牛受到病原微生物侵害而患病[12]。

3.3 致病菌的感染依然是主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一

本試驗(yàn)從12份臨床型乳房炎乳汁樣本中初步分離鑒定出2株金黃色葡萄球菌、5株大腸桿菌和5株鏈球菌屬。本研究結(jié)果與羅金印[3]的蘭州地區(qū)無乳鏈球菌和大腸桿菌檢出率最高，金黃色葡萄球菌檢出率其次的結(jié)論基本一致。由于某些因素造成奶牛乳頭受損或奶牛機(jī)體發(fā)生比較嚴(yán)重的感染時(shí)，機(jī)體的防御平衡被打破，病原微生物趁機(jī)入侵；或原本寄居于乳房內(nèi)的條件性病原微生物開始活化，并大量增殖而使乳房致病[13]。

大多數(shù)奶牛場只重視隱性乳房炎對乳品質(zhì)檢測中體細(xì)胞數(shù)等指標(biāo)的影響，但對引發(fā)奶?；寂R床型乳房炎的主要致病菌的危害性認(rèn)識(shí)不足。金黃色葡萄球菌廣泛分布于日常環(huán)境中，具有很強(qiáng)的傳染性、對抵御環(huán)境和外部壓力的耐受能力強(qiáng)等特點(diǎn)，對抗生素的耐藥性十分明顯，是導(dǎo)致奶?；既榉垦椎闹饕虏【鶾14]。隨著細(xì)菌變異、耐藥菌株增多，奶牛乳房炎臨床治療和淘汰處置難度增加，需要對患牛進(jìn)行有針對性的治療，方可達(dá)到更好的治療效果，有效規(guī)避產(chǎn)生耐藥菌產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可在偏酸性的環(huán)境下進(jìn)行增殖。當(dāng)泌乳牛的飼料配方中出現(xiàn)蛋白質(zhì)含量偏高，脂肪含量偏低等營養(yǎng)失衡的情況時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致乳房內(nèi)出現(xiàn)偏酸性環(huán)境，大腸桿菌可大量定植[15]。只有當(dāng)奶牛自身免疫力降低時(shí)，鏈球菌才會(huì)引起奶?；既榉垦?，但單純由鏈球菌誘發(fā)的奶牛隱性型乳房炎仍然會(huì)使產(chǎn)奶量急劇下降。因此，若牛場未對泌乳牛進(jìn)行分段飼喂可能會(huì)增加大腸桿菌和鏈球菌等條件致病菌的侵入，進(jìn)而誘發(fā)奶牛乳房炎[16]。

4 結(jié)論

綜上所述，該奶牛場奶牛乳房炎患病率較低但仍需進(jìn)一步加強(qiáng)預(yù)防管理，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌屬可能是該牛場乳房炎主要致病菌。