侯保健， 胡菊萍， 嚴兆丹， 蔡莉， 張令暉

（湖北省第三人民醫(yī)院，湖北武漢 430030）

糖尿病性骨質(zhì)疏松（diabetic osteoporosis，DOP）是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥，以骨結(jié)構(gòu)破壞、骨量降低及骨脆性增加為主要特征，已成為老年患者致殘致死的主要原因[1-2]。中醫(yī)藥在抗骨質(zhì)疏松方面的作用日益顯著。DOP歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”的范疇，以腎精虛損、血瘀阻絡(luò)為主要病機。丹蛭降糖膠囊具有益氣、養(yǎng)陰、活血的功效，臨床可有效改善DOP患者骨代謝[3-5]。本研究旨在建立DOP大鼠模型，進一步觀察丹蛭降糖膠囊對DOP大鼠的治療作用及機制，以期為臨床應(yīng)用丹蛭降糖膠囊治療DOP提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 54只SPF級成年雌性SD大鼠，4～5周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0031。所有實驗動物于開始實驗前，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周。動物實驗的實施嚴格遵照《實驗動物護理和使用指南》進行。

1.2 藥物、試劑與儀器 丹蛭降糖膠囊（購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：Z20090006）；鹽酸吡格列酮片（江蘇德源藥業(yè)股份有限公司，批號：H20110048）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；血清雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）放射免疫檢測試劑盒（北京原子高科股份有限公司）；胰島素、骨鈣素（OC）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）；胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）抗體、Wnt1抗體、β-catenin抗體[艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）公司]；蘇木素-伊紅（HE）檢測試劑盒（上海莼試生物公司）；AU5400自動生化分析儀（美國Beckman公司）；光學(xué)顯微鏡、CKX53熒光顯微鏡（日本OLympus公司）；蛋白電泳儀（北京六一儀器）。

1.3 DOP動物模型建立 首先構(gòu)建2型糖尿病模型[6]：用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠6周，空腹飼養(yǎng)6 h后每日單次腹腔注射60 mg/kg STZ，連續(xù)注射3次后，當(dāng)隨機血糖＞16.7 mmol/L時判斷2型糖尿病模型建立成功。假手術(shù)組大鼠采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。再構(gòu)建DOP模型[7]：糖尿病模型大鼠腹腔注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位固定在手術(shù)臺上，常規(guī)剃毛并消毒后，在大鼠背部正中線做3 cm縱向切口，在切口旁2 cm，髂棘上1 cm處鈍性分離肌肉，眼科彎鑷深入找到卵巢，切除雙側(cè)卵巢，逐層縫合皮膚，切口部位滴青霉素抗炎。采用PRODIGY全自動雙能X線骨密度測量儀測量骨密度（BMC），當(dāng)峰值減少≥2.5個標(biāo)準差時判斷為建模成功。假手術(shù)組大鼠僅找到卵巢，不結(jié)扎，只切除卵巢附近小塊脂肪，其他步驟同上。

1.4 分組與干預(yù)方法 將54只大鼠按隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組，模型組，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組，每組9只。除假手術(shù)組外，其余各組均建立DOP大鼠模型。建模過程中大鼠感染死亡3只，最終模型組7只、中藥低劑量組9只、中藥中劑量組8只、中藥高劑量組9只及吡格列酮組9只。成功建模1 d后，大鼠給藥劑量按照成人與大鼠體表面積法[8]進行換算，中藥低、中、高劑量組大鼠灌胃丹蛭降糖膠囊0.54、1.08、2.16 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于成人給藥劑量的1/2、1、2倍），吡格列酮組灌胃鹽酸吡格列酮10 mg·kg-1·d-1，模型組和正常組大鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)8周。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）水平檢測 末次灌胃后，采集大鼠尾部靜脈血，應(yīng)用血糖儀監(jiān)測大鼠空腹血糖（FBG），采用放射免疫法檢測血清E2、FSH及LH含量。

1.5.2 胰島功能檢測 應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖（FPG）及空腹胰島素（FINS）水平，運用穩(wěn)態(tài)模式評估法測定胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）及胰島素敏感指數(shù)（ISI）。

1.5.3 骨代謝指標(biāo)檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測血清骨鈣素（OC），應(yīng)用貝克曼全自動生化免疫分析儀檢測血清血鈣（Ca）、血磷（P）和堿性磷酸酶（ALP）濃度。

1.5.4 股骨組織提取及HE染色法觀察病理形態(tài) 采用頸部脫臼方法處死大鼠，取股骨入10%甲醛溶液中固定，縱向切片，放入脫鈣劑中脫鈣，石蠟包埋，制成切片4μm，低溫保存留待后續(xù)實驗。按常規(guī)HE染色方法操作，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織病理形態(tài)。

1.5.5 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測胰腺組織胰島β細胞凋亡 取胰腺石蠟切片脫蠟至水，加入2 020μg/mL蛋白酶K溶液23℃孵育30 min，加入3%H2O2孵育15 min，擦片后加入50μL TUNEL反應(yīng)液37℃孵育60 min。上述每步驟后PBS沖洗5 min，反復(fù)3次。再加入50μL轉(zhuǎn)化劑-POD，使用抗熒光淬滅封片液封片。熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，凋亡細胞呈熒光綠色，每張切片選擇5個非重疊視野，計算胰島β細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測股骨組織IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表達 取股骨組織，裂解離心獲得上清液，進行蛋白定量。上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入一抗稀釋液IGF-1R（1∶500）、Wnt1（1∶500）、β-catenin（1∶500）4℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜后避光環(huán)境下滴加顯影液孵育60 s。最后采用Image-lab圖像分析系統(tǒng)進行分析。

1.6 統(tǒng)計方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法進行。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平比較 表1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清E2水平降低，F(xiàn)SH、LH水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組E2水平升高，F(xiàn)SH、LH水平降低（P＜0.05）；中藥高劑量組上述各指標(biāo)與吡格列酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，DOP模型大鼠性激素代謝紊亂，而丹蛭降糖膠囊干預(yù)后可調(diào)節(jié)DOP大鼠性激素代謝紊亂現(xiàn)象。

表1 各組大鼠血清雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）水平比較Table 1 Comparison of serum estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH）and luteinizing hormone（LH）levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血清雌二醇（E2）、促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）水平比較Table 1 Comparison of serum estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH）and luteinizing hormone（LH）levels among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與吡格列酮組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組吡格列酮組F值P值鼠數(shù)/只979899 E2/（pg·mL-1）24.03±6.71 15.33±3.03①18.05±5.70①②③19.14±5.03①②③22.55±5.30①②22.65±4.95①②3.193 0.015 FSH/（mIU·mL-1）3.25±0.94 5.77±1.30①4.31±0.88①②③4.20±0.93①②③4.08±0.71①②4.10±0.60①②6.408 0.001 LH/（mIU·mL-1）4.18±1.17 7.40±2.02①5.91±0.55①②③5.60±0.41①②③5.21±0.39①②5.08±0.48①②9.792＜0.001

2.2 各組大鼠胰島功能比較 表2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組FINS、FPG及HOMA-IR值升高，ISI值降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組FINS、FPG及HOMA-IR值降低，ISI值升高（P＜0.05）；中藥高劑量組上述各項指標(biāo)與吡格列酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，DOP模型大鼠胰島功能減退，而丹蛭降糖膠囊可改善DOP大鼠胰島功能、降低血糖。

表2 各組大鼠胰島功能比較Table 2 Comparison of islet function among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠胰島功能比較Table 2 Comparison of islet function among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與吡格列酮組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組吡格列酮組F值P值鼠數(shù)/只979899 FINS/（mIU·mL-1）18.56±5.68 32.55±4.58①29.30±4.15①②③28.47±4.03①②③24.17±3.97①②23.89±3.81①②10.480＜0.001 FPG/（mmol·L-1）5.58±1.10 24.36±4.50①19.66±3.90①②③18.74±4.15①②③12.14±3.23①②12.01±2.89①②32.400＜0.001 HOMA-IR 3.02±0.40 17.69±2.15①15.20±1.66①②③14.96±1.59①②③10.20±2.80①②10.14±2.63①②55.190＜0.001 ISI-3.11±0.25-6.54±0.61①-5.17±0.44①②③-4.96±0.50①②③-3.84±0.38①②-3.58±0.44①②66.310＜0.001

2.3 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較 表3結(jié)果顯示：各組間Ca、P含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組OC、ALP含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組OC、ALP含量降低（P＜0.05）；中藥高劑量組OC、ALP含量與吡格列酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，DOP模型大鼠骨形成功能減退，而丹蛭降糖膠囊可改善DOP大鼠骨形成功能，起到骨保護作用。

表3 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較Table 3 Comparison of bone metabolic indexes among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較Table 3 Comparison of bone metabolic indexes among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與吡格列酮組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組吡格列酮組F值P值鼠數(shù)/只979899 OC/（ng·mL-1）2.11±0.49 4.26±0.77①3.11±0.41①②③3.14±0.40①②③2.66±0.25①②2.58±0.27①②21.160＜0.001 Ca/（mmol·L-1）2.37±0.18 2.60±0.12 2.58±0.16 2.49±0.13 2.39±0.12 2.41±0.15 1.120 0.311 P/（mmol·L-1）1.60±0.14 1.75±0.08 1.69±0.10 1.67±0.08 1.62±0.16 1.60±0.15 1.783 0.135 ALP/（mmol·L-1）92.54±10.25 185.44±15.63①152.47±12.55①②③149.80±13.36①②③133.07±10.22①②131.60±9.44①②53.950＜0.001

2.4 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)比較 圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠骨小梁粗壯、飽滿及形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，結(jié)構(gòu)排列較緊密；模型組骨髓腔較大，骨小梁數(shù)目較少且結(jié)構(gòu)稀疏，存在骨小梁斷裂；與模型組比較，中藥低、中劑量組骨髓腔相對較小，骨小梁寬度增大，但未呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布；中藥高劑量組及吡格列酮組骨組織病理形態(tài)較模型組明顯改善，可見骨小梁體積變寬，骨小梁間隙減小且形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則。

圖1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histopathological morphology of the femur tissue among various groups of rats（HE staining，×200）

2.5 各組大鼠胰腺組織胰島β細胞凋亡率比較圖2結(jié)果顯示：假手術(shù)組，模型組，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組胰腺組織中胰島β細胞凋亡率分別為（0.00±0.00）%、（18.05±1.21）%、（11.98±0.63）%、（10.47±0.80）%、（3.69±0.28）%及（4.02±0.33）%，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組胰島β細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組胰島β細胞凋亡率降低（P＜0.05）；中藥高劑量組胰島β細胞凋亡率與吡格列酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠胰腺組織胰島β細胞凋亡比較（TUNEL法）Figure 2 Comparison of apoptosis of pancreaticβ-cells in pancreatic tissue among various groups of rats（TUNEL method）

2.6 各組大鼠股骨組織IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表達比較 表4、圖3結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組IGF-1R蛋白表達水平升高，Wnt1、β-catenin蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及吡格列酮組IGF-1R蛋白表達水平降低，Wnt1、β-catenin蛋白表達水平升高（P＜0.05）；中藥高劑量組上述各指標(biāo)與吡格列酮組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠股骨組織IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白Western Blot電泳條帶圖Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of IGF-1R，Wnt1 andβ-catenin proteins in femoral tissues in various groups of rats

表4 各組大鼠股骨組織IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expressions of IGF-1R，Wnt1 andβ-catenin in femoral tissues among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠股骨組織IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expressions of IGF-1R，Wnt1 andβ-catenin in femoral tissues among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與吡格列酮組比較

組別假手術(shù)組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組吡格列酮組F值P值鼠數(shù)/只979899 IGF-1R蛋白相對表達量0.32±0.05 1.20±0.22①0.71±0.12①②③0.65±0.18①②③0.46±0.10①②0.49±0.09①②40.940＜0.001 Wnt1蛋白相對表達量1.80±0.10 0.32±0.0①0.76±0.08①②③0.78±0.07①②③1.08±0.10①②1.02±0.07①②308.900＜0.001 β-catenin蛋白相對表達量1.13±0.20 0.41±0.05①0.73±0.11①②③0.78±0.09①②③0.96±0.13①②0.92±0.12①②28.940＜0.001

3 討論

糖尿病骨質(zhì)疏松（DOP）是慢性的糖尿病并發(fā)癥，發(fā)病機制復(fù)雜。大量的流行病學(xué)研究結(jié)果表明，1型糖尿病患者是低骨密度的，與沒有糖尿病的對照組比較有更高的骨折風(fēng)險[9]，這提示胰島素是骨的促合成因素。本研究結(jié)果顯示，丹蛭降糖膠囊可使DOP大鼠FINS、FPG及HOMA-IR值降低，ISI值升高，胰島β細胞凋亡率降低，表明丹蛭降糖膠囊可改善DOP大鼠胰島功能，抑制胰島β細胞凋亡，抑制胰島素抵抗，推測其可能是通過該機制抑制骨量丟失。

骨代謝異常是DOP患者主要的病理學(xué)特征。調(diào)節(jié)骨代謝對于改善DOP具有重要意義。堿性磷酸酶（ALP）是成骨細胞分泌的酶蛋白，是成骨細胞成熟的特異性標(biāo)志，是反映骨代謝的重要指標(biāo)[10]。骨鈣素（OC）是由成骨細胞合成和分泌的非膠原骨基質(zhì)蛋白，為骨轉(zhuǎn)化、骨形成標(biāo)志物[11]。本研究結(jié)果顯示，丹蛭降糖膠囊可使DOP大鼠血清ALP、OC水平降低，表明丹蛭降糖膠囊可增強DOP大鼠成骨細胞活性，促進骨形成，改善骨代謝。鈣（Ca）、磷（P）等指標(biāo)代表骨組織無機物的代謝狀態(tài)，本研究結(jié)果顯示，各組間Ca、P水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），推測該結(jié)果可能是無機物代謝速度較慢的原因。

胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）是胰島素樣生長因子1（IGF-1）的受體，參與糖代謝和骨代謝過程[12-13]。研究表明，沉默IGF-1R后，成骨細胞增殖受到抑制，而凋亡增加[13]。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控成骨細胞分化和骨基質(zhì)形成的關(guān)鍵途徑[14]。β-catenin高表達可以增加骨強度，改善骨量丟失[15]。研究表明，IGF-1R與Wnt/β-catenin信號通路存在交叉對話，IGF-1R可直接激活生長板軟骨細胞β-catenin，還能抑制Wnt/β-catenin信號通路拮抗劑Dkk1（配體Wnt上游分子），促進Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進β-catenin表達[16]。本研究結(jié)果顯示，DOP大鼠股骨組織中IGF-1R蛋白表達水平升高，Wnt1、β-catenin蛋白表達水平降低，丹蛭降糖膠囊干預(yù)后DOP大鼠股骨組織IGF-1R蛋白表達水平降低，Wnt1、βcatenin蛋白表達水平升高，表明丹蛭降糖膠囊可通過調(diào)節(jié)股骨組織IGF-1R、Wnt1、β-catenin蛋白表達水平促進骨形成。

雌激素E2可直接作用于成骨細胞雌激素受體提高成骨細胞活性，促性腺激素FSH、LH與骨密度呈負相關(guān)[17]。2型糖尿病并發(fā)骨質(zhì)疏松癥患者血清性激素E2水平降低，F(xiàn)SH和LH水平升高[18]。本研究結(jié)果顯示，丹蛭降糖膠囊可使E2水平升高，F(xiàn)SH和LH水平降低，表明丹蛭降糖膠囊干預(yù)后的DOP大鼠雌激素與促性腺激素代謝紊亂得到改善。

吡格列酮是具有代表性的噻唑烷二酮類藥物，臨床證實該藥物具有在改善胰島素抵抗及控制血糖的同時，可通過調(diào)控糖脂代謝紊亂而發(fā)揮骨保護作用[19]。故本研究選擇吡格列酮作為陽性對照藥物。本研究結(jié)果表明，高劑量的丹蛭降糖膠囊對各指標(biāo)的改善作用均與吡格列酮相當(dāng)。

綜上所述，丹蛭降糖膠囊可通過改善胰島功能，改善骨代謝，調(diào)節(jié)性激素代謝紊亂，抑制IGF-1R表達、激活Wnt1、β-catenin表達，發(fā)揮抗糖尿病性骨質(zhì)疏松作用。