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        2017—2019年福建省結核分枝桿菌分離株基因型特征及其耐藥性分析

        2023-02-10 03:56:24魏淑貞趙永林建林淑芳戴志松
        中國防癆雜志 2023年1期
        關鍵詞:分型耐藥性結核病

        魏淑貞 趙永 林建 林淑芳 戴志松

        結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)基因分型常用于結核病分子流行病學研究,在結核病疫情處置中常用其進行溯源分析,并判斷是否發(fā)生聚集性疫情。間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)是鑒定北京基因型與非北京基因型的金標準,是MTB基因分型主要的方法之一。近年來,國內(nèi)研發(fā)的基于熔解曲線法的新型間隔區(qū)寡核苷酸分型(Melted curve Spoligotyping,McSpoligotyping),相對于傳統(tǒng)的Spoligotyping具有操作簡便、快速、準確等優(yōu)勢[1]。筆者運用該方法對福建省2017—2019年來源于耐藥監(jiān)測點的477株MTB臨床分離株進行快速基因分型,以掌握福建省當前MTB流行情況,了解MTB各基因型與耐藥性的關系。

        材料和方法

        1.菌株來源:選取2017—2019年福建省結核病耐藥監(jiān)測點的477株MTB臨床分離株,其中,2017年6株、2018年256株、2019年215株;福州市54株、廈門市33株、寧德市27株、莆田市100株、泉州市143株、龍巖市78株、三明市24株、南平市18株。MTB標準株H37Rv由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供。

        2.菌種初步鑒定與藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”):采用對硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)生長實驗法,按照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》進行菌種初步鑒定,PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基中含藥濃度分別為500 μg/ml和5 μg/ml。采用傳統(tǒng)固體比例法對9種抗結核藥物進行藥敏試驗,含藥培養(yǎng)基中各藥物濃度分別為:異煙肼(isoniazid,INH)0.2 μg/ml,利福平(rifampin,RFP)40 μg/ml,鏈霉素(streptomycin,Sm)4 μg/ml,乙胺丁醇(ethambutol,EMB)2 μg/ml,卡那霉素(kanamycin,Km)30 μg/ml,氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)4 μg/ml,卷曲霉素(capreomycin,Cm)40 μg/ml,丙硫異煙胺(prothionamide,Pto)40 μg/ml,對氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid,PAS)1 μg/ml。若耐藥百分比≥1%,則認為受試菌對該藥耐藥;反之,則認為受試菌對該藥敏感。耐藥百分比=含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)×100%。

        3.DNA提取:刮取生長2~3周的MTB一菌環(huán)置于裝有200 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)緩沖液的1.5 ml離心管中,蓋好蓋子;90 ℃熱裂解20 min后平衡至室溫。采用核酸提取試劑條(廈門致善生物科技股份有限公司)在Lab-Aid 824 核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司)按照說明書的操作步驟進行提取。收集提取好的DNA于高壓滅菌后的EP管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        4.McSpoligotyping 分型:每份樣品需要擴增3個體系,即McSpoligotyping PCRMixA、MixB、MixC。3個體系的PCR反應液按每份樣品需19.75 μl MixA/B/C與0.25 μl酶混合,振蕩混勻數(shù)秒瞬時離心后,以每管20 μl分裝到PCR反應管中。向每個PCR反應管加入5 μl的樣品DNA,并以MTB標準株H37Rv的DNA和去離子水作為陽性和陰性對照。再行擴增及熔解曲線分析。擴增條件:50 ℃ 5 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,57 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,50個循環(huán)。熔解曲線分析:95 ℃ 1 min,35 ℃ 1 min,35~90 ℃以0.04 ℃/s的速率升溫,此時采集4個通道FAM、HEX、ROX和CY5的熒光信號。

        5.結果判讀:實驗運行結束后,分析軟件自動給出一串43位的二進制碼。判讀結果的規(guī)則如下:(1)優(yōu)先判讀HEX通道的內(nèi)控熔解峰(44~48 ℃),若內(nèi)控熔解峰缺失則判定該樣品無效。(2)若對應的熔點范圍內(nèi)有熔解峰,則相應的間隔區(qū)存在,表示為“n”;若無熔解峰,則相應的間隔區(qū)缺失,表示為“o”。樣品分型結果按43個間隔區(qū)(SP1、SP2、SP3…SP43)的順序以“n”和“o”形式表示。

        6.數(shù)據(jù)整理:McSpoligotyping檢測結果提交至SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT2/),得到每個菌株的SIT編號和所屬基因家族,再上傳至國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus(https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)進行比對分析。

        7.統(tǒng)計學處理:采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以“構成比/百分率(%)”描述,組間差異的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。運用BioNumericsSoftware 5.10 對分型結果進行聚類分析,生成最小生成樹圖。

        結 果

        1.McSpoligotyping分型結果:北京基因型有245株,占51.4%;T家族有44株(含2株T,28株T1,7株T2,T3和T4各3株,1株T5),占9.2%;H家族有35株(含13株H,1株H1,21株H3),占7.3%;EAI家族有11株(含10株EAI2-Manila,1株 EAI5),占2.3%;LAM3、Manu2和X1家族各有1株,分別占0.2%;所屬家族未定義或不明確的有139株,占29.1%。477株菌株的分離地均是北京基因型所占的比例最高,為主要流行型,見表1。

        2.聚類分析與主要流行基因型:共檢出204種基因型別,發(fā)現(xiàn)其中有146個新的型別(在SpolDB 4.0中無對應的SIT編號),所有基因型主要歸為7個家族(北京、T、H、LAM、EAI、Manu、X)和未定義家族。聚類分析結果見圖1??煞譃?37個獨立基因型和34個基因簇,每個簇包含2株及以上,其中,最大的一個簇為北京基因型(含216株),成簇的菌株共有340株,菌株成簇率為71.28%(340/477)。各基因型家族主要流行型為北京家族的SIT1(44.9%,214/477)、T家族的SIT53(2.5%,12/477)、H家族的SIT742(1.9%,9/477)、EAI家族的SIT19(1.5%,7/477)。

        注 圈的大小代表菌株數(shù)量的多少圖1 福建省477株結核分枝桿菌臨床分離株基因型聚類分析

        3.MTB基因型與耐藥性的關系:對477株臨床分離菌株進行一線抗結核藥物耐藥性檢測,結果顯示,不同基因家族的菌株對EMB、Sm耐藥率之間的差異均無統(tǒng)計學意義;對INH、RFP 耐藥率之間的差異均有統(tǒng)計學意義。進行二線抗結核藥物耐藥性檢測結果顯示,不同基因家族菌株對Km、Cm和Pto耐藥率之間的差異均無統(tǒng)計學意義;對Ofx和PAS耐藥率之間的差異均有統(tǒng)計學意義,H家族基因型菌株對Ofx耐藥率高于其他基因家族菌株,未定義家族菌株對PAS耐藥率高于其他基因家族菌株。具體見表2。

        表2 不同抗結核藥物敏感性在各基因家族結核分枝桿菌臨床分離株的分布情況 [株(構成比,%)]

        討 論

        Spoligotyping分型是結核病分子流行病學研究重要的分析手段。傳統(tǒng)的檢測方法是基于普通的PCR方法進行間隔區(qū)序列的擴增,擴增產(chǎn)物與固定在雜交膜上的43條探針雜交,其底物經(jīng)過鏈親和素堿性磷酸酶酶促分解為發(fā)光物質,再通過化學發(fā)光增強劑的作用后,在暗室里經(jīng)X光曝光一定時間,然后顯影和定影,根據(jù)X光膠片上的雜交信號有無,由人工判讀相應的間隔區(qū)是否存在,再以43位二進制數(shù)字上傳到國際數(shù)據(jù)庫分析其樣本對應的基因型。傳統(tǒng)的方法操作繁瑣,耗時長(約6~8 h),需人工判讀結果。McSpoligotyping分型操作簡便,僅需3 h完成檢測,結果自動化判讀,且PCR產(chǎn)物后處理無需開蓋操作[1-4]。據(jù)文獻報道,McSpoligotyping與傳統(tǒng)的Spoligotyping方法檢測結果一致性高達97.71%[1],與全基因組測序的一致性達94.18%[2]。由此可見,McSpoligotyping可替代傳統(tǒng)的Spoligotyping方法用于結核病的基因分型研究。

        北京基因型是世界各地特別是東南亞地區(qū)MTB致病菌中流行最廣泛的基因型[5]。本研究結果顯示,福建省北京基因型MTB菌株的分離率為51.4%,低于青海、陜西、北京、江蘇等地區(qū)報道的73.71%~86.21%[6-9],與貴州省(49.1%)相持平[10],略低于海南的57.6%[11]、廣西的56.95%[12]、云南的55.72%[13],進一步反映了北京基因型MTB菌株在我國的分布呈現(xiàn)北高南低的特征。本研究結果進一步說明了北京基因型MTB菌株,特別是其中的SIT1型,是福建省MTB的主要流行株。

        本研究結果顯示,除了北京家族基因型,福建省流行排在前3位的MTB基因型家族為T家族、H家族、EAI家族,與福州[14]和廈門[15]地區(qū)的主要流行菌株情況基本一致。MTB基因型T家族和H家族是歐美地區(qū)主要的流行家族,EAI主要流行于亞洲地區(qū)的印度、菲律賓和越南等地區(qū)。本次研究中,T、H、EAI、LAM等不同基因家族的MTB菌株主要分離自泉州、莆田、寧德等沿海地區(qū),推測這些家族菌株之所以在省內(nèi)流行可能與福建省重要的地理位置及歷史文化有關。福建省是海上絲綢之路的發(fā)祥地,在中國不同歷史時期的海上絲綢之路扮演重要角色,與歐美和東南亞國家經(jīng)濟貿(mào)易頻繁,人口流動性大。除T、H、LAM、EAI、Manu、X家族外,本研究還發(fā)現(xiàn)了146個新的Spoligotype基因型,其中135個基因型的家族未定義,4個基因型的家族不明確,在本研究中歸屬于未定義家族。這反映了福建省MTB具有豐富的遺傳多樣性,有利于研究其基因家族的流行傳播和進化。今后的工作中應加強對MTB這些基因家族的監(jiān)測和研究。

        北京家族基因型MTB菌株是我國主要的流行株[5]。MTB菌株各基因型與其耐藥性之間的關系一直備受關注。本研究結果顯示,各基因家族MTB菌株與INH、RFP的耐藥性有關,而與EMB、Sm的耐藥性無關。這與國內(nèi)其他地區(qū)如廣東[16]和江蘇[9]報道的結果一致。本研究顯示,各基因型家族MTB菌株對Km、Cm和Pto的耐藥率之間的差異無統(tǒng)計學意義,H家族菌株對Ofx耐藥率高于其他基因家族菌株,與梁晨等[7]報道的非北京基因型MTB菌株對左氧氟沙星的耐藥率高于北京基因型菌株相類似,進一步提示了不同基因型家族MTB菌株對氟喹諾酮類藥物的耐藥性之間存在差異,對于耐藥結核病患者,及時檢測氟喹諾酮類藥物的耐藥性對患者臨床上合理有效用藥具有一定的指導意義。

        本研究存在以下不足:一是未將福建省2017—2019年全省監(jiān)測點的菌株全部納入分型,2017年的菌株納入數(shù)量很少,未能全面展示全省MTB的基因型,也未能分析3年內(nèi)MTB流行基因型的變化趨勢。二是研究的菌株對二線抗結核藥物耐藥的菌株數(shù)少,今后需進一步增加樣本量進行分析。三是McSpoligotyping的分辨力相對較低,未分析來源成簇菌株患者之間的流行病學關聯(lián)。

        志謝感謝中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所劉海燦博士對基因分型結果的復核與聚類分析。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

        作者貢獻魏淑貞:實驗設計與檢測、論文撰寫、資料分析;趙永和林建:實驗檢測與資料收集;林淑芳:行政/技術/材料支持、指導;戴志松:行政/資料支持、指導、研究經(jīng)費支持、論文修改指導

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