余美玲 張晨晨 魏文靜 趙雨川 卓文基 鄭磊

對(duì)氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid，PAS)是目前用于治療耐多藥結(jié)核病的二線抗結(jié)核藥物[1]。盡管PAS用于結(jié)核病治療已超過(guò)70年，但對(duì)其作用機(jī)制尚未完全了解[2]。目前，普遍認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)對(duì)PAS耐藥主要與某些基因突變有關(guān)，包括thyA、folC和ribD等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，thyA基因編碼胸苷酸合成酶，其缺失可導(dǎo)致MTB對(duì)PAS的耐藥性[4]，thyA基因的突變也存在于對(duì)PAS耐藥的MTB臨床分離株中[5]。作為對(duì)氨基苯甲酸(para-amino benzoic acid，PABA)的類(lèi)似物，PAS與PABA競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶 (DHPS)，從而干擾葉酸合成[6-8]。此外，也有研究顯示，編碼二氫葉酸合成酶的folC基因的各種錯(cuò)義突變和ribD的過(guò)表達(dá)可使MTB對(duì)PAS產(chǎn)生耐藥性[9]。然而，folC突變僅在34.8%的MTB臨床耐藥分離株中被檢測(cè)到，而thyA和ribD突變分別在26.0%和5.8%的MTB臨床分離株中被檢測(cè)到[5, 7]。

目前，MTB耐藥研究多采用臨床分離的藥物敏感和耐藥菌株進(jìn)行對(duì)比分析[10-11]，難以消除不同菌株的背景差異，無(wú)法得知MTB耐藥進(jìn)化軌跡，亦無(wú)法準(zhǔn)確獲得MTB耐藥變化的始動(dòng)因素及引起耐多藥的關(guān)鍵因素和共同因素。筆者采用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的改良羅氏固體培養(yǎng)法及藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)方法，制備不同藥物濃度梯度的PAS培養(yǎng)基，通過(guò)連續(xù)傳代和持續(xù)誘導(dǎo)的方式，將MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv成功誘導(dǎo)成標(biāo)準(zhǔn)耐PAS菌株(WHO推薦的耐藥濃度)及高水平耐藥菌株，收集并保存每一代誘導(dǎo)菌株，建立動(dòng)態(tài)耐藥菌株遺傳進(jìn)化模型。用微孔板法檢測(cè)上述誘導(dǎo)菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)及交叉耐藥情況，篩選耐藥水平相似的臨床分離株。通過(guò)對(duì)PAS耐藥的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)MTB菌株和臨床分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，研究PAS潛在的作用和MTB對(duì)PAS的耐藥新機(jī)制。另外，基于臨床用藥實(shí)際情況，構(gòu)建連續(xù)、動(dòng)態(tài)的耐PAS的MTB菌株模型，以期為MTB對(duì)PAS耐藥研究和臨床實(shí)踐提供理想的生物模型。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株：本研究所用MTB臨床分離株來(lái)自廣東省結(jié)核病控制中心生物樣本信息庫(kù)，菌株的PAS藥敏信息齊全；MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為本實(shí)驗(yàn)室保存。本實(shí)驗(yàn)室為省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室，設(shè)有MTB菌株暫存庫(kù)，按相關(guān)要求存儲(chǔ)菌株；已在當(dāng)?shù)匦l(wèi)生健康委員會(huì)備案涉及病原微生物為MTB的二級(jí)病原微生物實(shí)驗(yàn)室[備案編號(hào)為：BSL-2(2020)44010600068]。少量活菌操作時(shí)在加強(qiáng)型二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行三級(jí)防護(hù)。

2.試劑與培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)所用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基、Middlebrook 7H10培養(yǎng)基和OADC增菌劑均購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司，PAS購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司。MTB藥敏試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)BC8001)。

改良羅氏固體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制，配方基礎(chǔ)成分(g/600 ml)：磷酸二氫鉀2.4 g、硫酸鎂0.24 g、檸檬酸鎂0.6 g、L-谷氨酸鈉7.2 g、孔雀綠0.4 g、馬鈴薯淀粉30.0 g?；A(chǔ)成分購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。配制方法：稱(chēng)取基礎(chǔ)成分49.84 g，并吸取甘油12 ml，加熱攪拌溶解于600 ml蒸餾水中，煮沸5～10 min，121 ℃高壓滅菌15 min取出。待冷卻至55 ℃左右時(shí)，以無(wú)菌操作方法加入無(wú)菌攪勻的全蛋液1000 ml，混勻(避免產(chǎn)生氣泡)，分裝18 mm×180 mm 試管，每管7 ml，置于成長(zhǎng)斜面，用85～90 ℃流動(dòng)蒸汽加熱1～1.5 h后，取出放冷備用。含PAS的羅氏固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上，配制時(shí)分別加入不同濃度的PAS。WHO推薦的MTB對(duì)PAS耐藥臨界濃度為1.0 mg/L[12]。

二、研究方法

1.體外誘導(dǎo)耐PAS的MTB菌株：采用WHO推薦的改良羅氏固體藥敏試驗(yàn)，參照MTB傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基中PAS濃度，配制一系列的藥物濃度梯度，依次將各藥物稀釋1倍，稀釋4個(gè)梯度，即得到不同的藥物濃度20、2-1、2-2、2-3、2-4。挑取H37Rv單克隆菌株接種于中性羅氏培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，該菌株視為原始初代菌株P(guān)0代。隨后將該菌株分別接種在不同濃度的PAS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)4周，其間記錄各濃度培養(yǎng)基上菌株的生長(zhǎng)狀況；4周后挑選生長(zhǎng)狀態(tài)較好的一組進(jìn)行下一輪傳代，所有藥物濃度梯度提高1倍。依此類(lèi)推，篩選出每一代生長(zhǎng)良好的菌株，連續(xù)傳代，直至篩選的陽(yáng)性克隆株的MIC值達(dá)到WHO推薦的PAS耐藥臨界濃度(1.0 mg/L)。另外，為進(jìn)一步探索MTB獲得高水平PAS耐藥的機(jī)制，繼續(xù)給予上述誘導(dǎo)成功的標(biāo)準(zhǔn)菌株21、22、23倍藥物濃度壓力刺激，保留每一代陽(yáng)性菌株，從而建立每種藥物連續(xù)誘導(dǎo)的MTB耐藥動(dòng)態(tài)變化模型株，有助于分析MTB藥物壓力下的遺傳進(jìn)化和耐藥機(jī)制。

2.篩選耐藥水平相似的臨床分離株：從本中心的生物樣本庫(kù)中篩選耐藥水平相似的PAS耐藥臨床分離株和PAS敏感臨床分離株，并用液體微孔板法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)復(fù)核。

3.MTB菌株藥敏試驗(yàn)：用液體微孔板法檢測(cè)本研究所用MTB菌株對(duì)14種抗結(jié)核藥物[異煙肼(INH)0.025～4 mg/L、鏈霉素(Sm)0.25～40 mg/L、乙胺丁醇(EMB)0.31～20 mg/L、氧氟沙星(Ofx)0.25～16 mg/L、莫西沙星(Mfx)0.06～4 mg/L、阿米卡星(Am)0.25～16 mg/L、卡那霉素(Km)0.62～20 mg/L、卷曲霉素(Cm)0.5～16 mg/L、丙硫異煙胺(Pto)0.62～20 mg/L、PAS 0.5～16 mg/L、利福平(RFP)0.25～8 mg/L、利福布汀(Rfb)0.12～4 mg/L、左氧氟沙星(Lfx)0.25～16 mg/L和吡嗪酰胺(PZA)50～900 mg/L]的MIC及交叉耐藥情況。

4.MTB基因組DNA提取及測(cè)序：取400 μl上述滅活的誘導(dǎo)菌株、臨床分離株及作為對(duì)照組的H37Rv菌株的菌液進(jìn)行超聲分散。運(yùn)用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)法提取MTB全基因組，并用 NanoDrop 測(cè)定濃度,然后用0.8%～1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品質(zhì)量。使用Agilent 5400對(duì)DNA純度、濃度、完整性進(jìn)行檢測(cè)。DNA樣品檢測(cè)合格后，使用Covaris超聲波破碎儀隨機(jī)打斷，再經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)。插入片段大小符合預(yù)期后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。文庫(kù)檢測(cè)合格后，按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求將不同文庫(kù)pooling至flowcell，cBOT成簇后使用美國(guó)Illumina公司高通量測(cè)序平臺(tái)NovaSeq 6000進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳Sequence Read Archive (SRA)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject編號(hào)為PRJNA883518和PRJNA883540。

三、數(shù)據(jù)分析

1.MTB突變分析：(1)低質(zhì)量序列過(guò)濾、接頭(adapter)序列去除：測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)會(huì)存在一定比例的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，為了保證后續(xù)信息分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，采用Fastq(0.20.0)質(zhì)控軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。(2)參考序列比對(duì)：從各樣品質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)出發(fā)，將有效數(shù)據(jù)比對(duì)到MTB參考基因組H37Rv(NC_000962.3)進(jìn)行測(cè)序深度和覆蓋度的統(tǒng)計(jì)(BWA 0.7.17)。(3)變異檢測(cè)：通過(guò)與參考基因組H37Rv進(jìn)行比對(duì)結(jié)果(Bam文件)，鑒定突變位點(diǎn)(Freebayes 1.3.2)，進(jìn)行變異檢測(cè)，對(duì)突變進(jìn)行注釋(同義、錯(cuò)義、無(wú)意、移碼突變等)，獲得目標(biāo)基因組對(duì)于參考基因組的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及插入缺失(insertion-deletion，InDel)等一系列變異信息(SnpEff 4.3t)。

2.耐藥分析：從突變分析中生成的Bam文件提取各耐藥位點(diǎn)的序列比對(duì)信息，分析各耐藥位點(diǎn)的突變，根據(jù)耐藥位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://github.com/jodyphelan/tbdb)中突變和耐藥關(guān)系，預(yù)測(cè)耐藥表型。

結(jié) 果

一、誘導(dǎo)耐PAS的MTB菌株

采用WHO推薦的改良羅氏固體藥敏試驗(yàn)，在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生不同耐藥水平的PAS耐藥菌株，期間保留每一代陽(yáng)性菌株，建立耐PAS的MTB耐藥動(dòng)態(tài)變化模型(圖1)。誘導(dǎo)過(guò)程中，在第三代，MTB菌株(P3)對(duì)PAS出現(xiàn)耐藥性，但菌株生長(zhǎng)狀態(tài)較差，連續(xù)培養(yǎng)至第七代(P7)，菌落形態(tài)與無(wú)藥對(duì)照組相似。然后繼續(xù)培養(yǎng)三代，穩(wěn)定耐藥性狀，至此獲得PAS臨界耐藥的MTB菌株。為進(jìn)一步探索MTB獲得高水平PAS耐藥的機(jī)制，繼續(xù)給予上述誘導(dǎo)成功的標(biāo)準(zhǔn)菌株2、4、8倍藥物濃度壓力，并分別獲得對(duì)應(yīng)的耐PAS菌株(P15、P20和P26)。

注 MTB：結(jié)核分枝桿菌；PAS：對(duì)氨基水楊酸；MIC：最低抑菌濃度圖1 體外誘導(dǎo)對(duì)氨基水楊酸耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株示意圖

二、MTB藥敏試驗(yàn)驗(yàn)證耐藥表型

用液體微孔板法檢測(cè)上述誘導(dǎo)菌株對(duì)14種抗結(jié)核藥物的MIC及交叉耐藥情況。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)至第三代時(shí)即出現(xiàn)PAS耐藥，除P1和P2代菌株外，其他代次均出現(xiàn)PAS單一耐藥，且耐藥水平由低到高依次遞增，證明菌株耐藥模型誘導(dǎo)成功(表1)。

三、全基因組重測(cè)序分析MTB對(duì)PAS耐藥的遺傳進(jìn)化軌跡

對(duì)上述誘導(dǎo)菌株進(jìn)行全基因組重測(cè)序分析，比較耐藥菌株與野生型菌株的基因組差異，通過(guò)耐藥性相關(guān)遺傳單元特異性分析、突變熱點(diǎn)區(qū)分析、補(bǔ)償性突變分析獲得與耐藥相關(guān)的基因組序列位點(diǎn)，如基因內(nèi)突變、基因間突變等，篩選與耐藥相關(guān)的基因；通過(guò)對(duì)所有代次菌株測(cè)序，發(fā)現(xiàn)PAS耐藥可能與3個(gè)位點(diǎn)突變直接相關(guān)，分別是plcC(Q462R)、folC(S150R)和1個(gè)thyA上游位點(diǎn)(3074495G→A)。需要注意的是，誘導(dǎo)過(guò)程中，在第三代MTB菌株(P3)獲得PAS耐藥(MIC為4 mg/L)時(shí)，plcC和tlyA上游基因發(fā)生突變。至第六代時(shí)， MTB菌株(P6)對(duì)PAS的MIC上升到8 mg/L，plcC、folC和tlyA上游基因均發(fā)生突變。之后至P26，基因組均未在此基礎(chǔ)上發(fā)生其他突變，但是耐藥水平明顯提高(表2)。

表2 對(duì)實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序所得的與PAS耐藥相關(guān)的基因突變

四、全基因組測(cè)序分析耐PAS的MTB臨床分離株的基因突變

為進(jìn)一步分析基因突變與MTB耐PAS的關(guān)系，篩選耐藥水平相似的PAS耐藥臨床分離株和PAS敏感的臨床分離株，并用液體微孔板法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)復(fù)核。將所篩選到的MTB菌株分為3類(lèi)：(1)PAS敏感菌株(617株)；(2)INH和RFP均敏感、PAS耐藥的MTB菌株(30株)；(3)INH、RFP和PAS均耐藥菌株(72株)。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)以上菌株的患者均未使用過(guò)PAS進(jìn)行抗結(jié)核治療。對(duì)該719株臨床MTB菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并從突變分析中生成的Bam文件提取各耐藥位點(diǎn)的序列比對(duì)信息，分析各耐藥位點(diǎn)的突變，結(jié)合耐藥位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，分析突變和耐藥的關(guān)系。在617株P(guān)AS敏感的MTB菌株中，只發(fā)現(xiàn)1株folC基因發(fā)生突變(E40G)，6株thyA基因發(fā)生突變(H75N)。在30株INH和RFP均敏感、PAS耐藥的MTB菌株中，folC和thyA均未發(fā)生突變。在72株INH、RFP和PAS均耐藥的菌株中，3株folC基因突變，3株thyA突變，2株thyX基因間突變(c.-16 C→T)。鑒于菌株來(lái)源的患者并未接受過(guò)PAS治療，表明這些臨床株中的folC、thyA和thyX突變并非由PAS引起。

討 論

MTB耐藥機(jī)制研究雖然是一個(gè)老課題，但是，目前的研究幾乎都是利用臨床分離的敏感菌株和耐藥菌株進(jìn)行研究。由于菌株的遺傳背景不同，各菌株的進(jìn)化水平有差異，因此，難以獲知MTB在體外耐藥變化的系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程，進(jìn)而無(wú)法全面、準(zhǔn)確地分析其耐藥機(jī)制。本研究中，為了克服背景基因差異的干擾，筆者采用體外藥物濃度梯度誘導(dǎo)法將MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv逐步誘導(dǎo)成不同耐藥水平的耐PAS菌株，建立起PAS耐藥菌株模型。所有的耐藥菌株均篩選自同一標(biāo)準(zhǔn)菌株，基于相同的遺傳背景，耐藥菌株新積累的遺傳變異很可能與其獲得的耐藥性相關(guān)，大大降低了假陽(yáng)性突變。而且，與高濃度藥物誘導(dǎo)的方法不同，該方法可以更好地模擬藥物在體內(nèi)的積累。

全基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于抗結(jié)核藥物作用機(jī)制的研究中[13-16]。通過(guò)對(duì)本研究中的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐PAS的MTB菌株進(jìn)行基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)由PAS單一因素影響產(chǎn)生的基因突變非常少，包括plcC(Q462R)、folC(S150R)和1個(gè)thyA上游位點(diǎn)(3074495G→A)，其中2個(gè)在PAS耐藥相關(guān)基因中已有報(bào)道。有研究者采用高濃度PAS誘導(dǎo)的方法，也產(chǎn)生了許多folC突變的耐藥MTB，其中，Ser150的突變也被包括在內(nèi)[6, 17]。已知folC可通過(guò)形成二氫葉酸(H2Pte-Glu)類(lèi)似物羥基二氫葉酸(H2PtePAS-Glu)來(lái)活化PAS。晶體結(jié)構(gòu)顯示，folC突變(S150R)所在的四螺旋束(α1-α2/α4-α5)在與羥基二氫蝶酸(H2PtePAS；H2Pte的類(lèi)似物)的相互作用中起重要作用，表明該突變體可能影響H2PtePAS谷氨酰胺化的效率。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在分離的臨床耐PAS的MTB菌株中存在34.8%(72/208)的folC突變，并且5個(gè)特定殘基(第40、43、49、150和153位)占臨床分離株中folC突變體的94.4%(68/72)。本研究在臨床耐PAS的MTB菌株中也觀察到幾種不同的folC突變(E40G和I43T)，但是并未檢測(cè)到S150R突變。另外，在617株P(guān)AS敏感的MTB菌株中，也發(fā)現(xiàn)1株folC基因發(fā)生突變(E40G)，6株thyA基因發(fā)生突變(H75N)。而在30株INH和RFP均敏感、PAS耐藥的MTB菌株中，folC和thyA均未發(fā)生突變。72株INH、RFP和PAS均耐藥的菌株中，3株folC基因突變，3株thyA突變，2株thyX基因間突變(c.-16C>T)。需要注意的是，本研究中臨床菌株來(lái)源的患者從未接受過(guò)PAS抗結(jié)核治療，表明這些臨床株中的folC、thyA和thyX突變并非由PAS引起。已有研究顯示，PAS耐藥與大多數(shù)抗結(jié)核藥物(Sm、INH、RFP、EMB、Lfx和Am)的耐藥及結(jié)核病的治療史和臨床類(lèi)型(耐多藥或者廣泛耐藥)明顯相關(guān)[5, 18]。

還有一點(diǎn)值得思考，在實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的耐PAS菌株中，plcC和tlyA上游基因發(fā)生突變后菌株獲得低水平PAS耐藥(MIC為4 mg/L)；plcC、folC和tlyA上游基因均發(fā)生突變后，菌株耐藥水平升至8 mg/L；之后至P26，基因組均未在此基礎(chǔ)上發(fā)生其他突變，但是耐藥水平明顯提高，提示thyA上游位點(diǎn)與PAS低水平耐藥相關(guān)；累積的folC突變與PAS中度耐藥相關(guān)；除基因突變外，可能存在其他與對(duì)PAS高水平耐藥發(fā)生相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。這具有一定的臨床意義，說(shuō)明可通過(guò)優(yōu)化藥物劑量[19]等方法來(lái)預(yù)防和控制更高水平的PAS耐藥發(fā)生。

綜上所述，本研究通過(guò)體外藥物濃度梯度誘導(dǎo)法構(gòu)建了動(dòng)態(tài)連續(xù)的PAS耐藥MTB菌株模型，并通過(guò)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)3個(gè)與PAS耐藥直接相關(guān)的突變位點(diǎn)，間接證明除基因突變因素以外，尚存在其他與PAS高水平耐藥發(fā)生相關(guān)的調(diào)控機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。對(duì)PAS敏感和耐藥的MTB臨床分離株測(cè)序發(fā)現(xiàn)，某些folC、thyA和thyX突變并非由PAS引起。另外，對(duì)全基因組測(cè)序所得的與PAS耐藥相關(guān)的基因突變也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)余美玲：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、文章撰寫(xiě)；張晨晨：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)；魏文靜、趙雨川和卓文基：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、文章撰寫(xiě)；鄭磊：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、文章撰寫(xiě)、工作支持(指導(dǎo))