張 靜，劉秀軍，2，薛文博，王帥達(dá)

(1. 天津工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300387； 2. 天津工業(yè)大學(xué) 中空纖維膜材料與膜過程國家重點(diǎn)實驗室，天津 300387)

0 引 言

檢測土壤[1]、污水[2]、食品[3-4]、藥物[5-6]的pH值對工業(yè)、農(nóng)業(yè)等方面具有重要的意義。傳統(tǒng)方法無法對細(xì)胞內(nèi)部等特殊環(huán)境的pH值進(jìn)行檢測。pH熒光探針具有靈敏度高、響應(yīng)時間快以及連續(xù)動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)[7]，在化學(xué)傳感和生物探針等方面具有潛在的應(yīng)用價值，如細(xì)胞內(nèi)pH值檢測[8-12]。

熒光素具有優(yōu)良的生物相容性、摩爾吸收率和熒光量子場強(qiáng)，是生物化學(xué)研究中最常見的熒光團(tuán)之一[13]。將熒光素鈉和二氧化硅復(fù)合，熒光素鈉分子內(nèi)運(yùn)動受到剛性無機(jī)材料的限制，阻塞非輻射弛豫通道，使放射性衰變填充到基態(tài)，從而提高染料的發(fā)光性能。例如Wang等[14]，將改性羅丹明B探針和熒光素異硫氰酸酯分別封裝在通過Pickering乳液制備的Janus微球中，這種Janus納米顆粒探針具有良好的線性(pH值為4～6)、高的光穩(wěn)定性、良好的可逆性和低的細(xì)胞毒性。Janus納米粒子探針的pKa值為6.86，在538和590 nm處的熒光強(qiáng)度與pH值有明顯的變化，可以用于對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的定量測量。

本文首先將熒光素鈉通過穩(wěn)定的羧基鍵共價連接到N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH792)上形成成熒光素鈉/KH792共軛體系，再利用st?ber法將熒光素鈉/KH792與正硅酸乙酯分解出的二氧化硅復(fù)合制備羧基修飾的熒光納米顆粒，對熒光納米顆粒的pH光學(xué)響應(yīng)進(jìn)行研究。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

熒光素鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；鹽酸，永飛化學(xué)試劑有限公司，分析純；N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH792)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，阿拉丁試劑有限公司，分析純；乙醚、乙醇、正硅酸乙酯(TEOS)、氨水，天津艾利安電子科技有限公司，分析純。

掃描電子顯微鏡(JSM-7610F型)，日本電子株式會社；Zeta電位和粒度分析儀(ZetaPALS型)，美國布魯克海文儀器公司；熒光分光光度計(F-7000型)，日本日立公司；傅里葉變換紅外光譜儀(NicoletiS50型)，美國里高尼公司；紫外-可見吸收分光光度計(U-3900/3900H型)，日本日立公司；高速離心機(jī)(TG16-WS型)，上海川一實驗儀器有限公司。

1.2 熒光共軛體系的制備

將熒光素鈉(1 mL，1×10-3mol/L)加入到鹽酸溶液(1 mL，3 mol/L)中，使其混合充分，酸化0.5 h以上。將酸化后的熒光素鈉加入到含有KH792(2 mL)的DMF溶液中，在干燥的氮?dú)鈿夥障麓帕嚢?2 h，并用薄層色譜(TLC)，直到純熒光分子的斑點(diǎn)完全消失。最后，將未反應(yīng)的KH792通過乙醚稀釋分離出來，生成游離粉末。

1.3 熒光納米顆粒的制備

采用st?ber的方法合成羧基修飾的熒光納米顆粒，在三口燒瓶里邊加入100 mL乙醇、TEOS(100 μL)、20 mL水和2 mL熒光素鈉/KH792共軛體系，攪拌均勻，再加入NH3·H2O(60 μL)，40 ℃下反應(yīng)12 h。最后，6 000 r/min離心10 min，將熒光納米顆粒從反應(yīng)混合物中分離出來，用乙醇和水各洗滌2次。

1.4 熒光納米顆粒的光學(xué)響應(yīng)測試

用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)出不同pH值的溶液，取50 μL熒光納米顆粒(1×10-5mol/L)溶液，加入到3 mL不同pH值的溶劑中，等待5 min，充分混合，用于紫外吸收和熒光發(fā)射光譜的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光納米顆粒的表征

利用粒度分析儀和掃描電子顯微鏡(SEM)對熒光納米顆粒的大小及形貌進(jìn)行分析。如圖1所示，熒光納米顆粒的平均粒徑為150 nm左右，且熒光納米顆粒的形狀接近于球狀，大小均勻。

圖1 熒光納米顆粒的(a)粒度分析結(jié)果；(b)掃描電鏡圖Fig.1 (a) Particle size distribution of fluorescent nanoparticles; (b) SEM images of fluorescent nanoparticles

利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對熒光納米顆粒進(jìn)行分析，如圖2所示。與純二氧化硅相比，將熒光分子負(fù)載到二氧化硅形成的熒光納米顆粒的紅外光譜在1 640 cm-1處出現(xiàn)了一個新的峰，這是由于熒光納米顆粒表面C=O鍵的拉伸振動，1 400 cm-1為苯環(huán)共軛體系的伸縮振動，3 500～3 050 cm-1對應(yīng)伯胺的不對稱和對稱伸縮振動。表明熒光納米顆粒表面改性羧基的存在，二氧化硅與熒光素鈉有效復(fù)合。

圖2 SiO2和熒光納米顆粒的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of SiO2 and fluorescent nanoparticles

2.2 熒光納米顆粒在不同pH的紫外吸收光譜

熒光納米顆粒對pH值的不同響應(yīng)特性，如圖3(a)所示。pH值在1～3范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，430 nm處的吸收強(qiáng)度由1.4降低到0.4。pH值在5～11范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，吸收帶從424 nm逐漸移到484 nm，吸光強(qiáng)度也逐漸增加，這是由于內(nèi)酯部分在強(qiáng)堿性條件下水解，水解產(chǎn)物促使吸收強(qiáng)度增強(qiáng)了。然而當(dāng)pH值大于11后，吸收強(qiáng)度變化趨緩。當(dāng)溶液pH值從5到11時，在485 nm處吸收強(qiáng)度與pH具有良好線性關(guān)系，如圖3(b)所示。

圖3 (a)熒光納米顆粒在不同pH條件下的紫外吸收光譜；(b)熒光納米顆粒在485 nm處的紫外吸收強(qiáng)度與pH的關(guān)系Fig.3 (a) UV absorption spectra of fluorescent nanoparticles at different pH; (b) relationship between UV absorption intensity of fluorescent nanoparticles at 485 nm and pH

2.3 熒光納米顆粒在不同pH的熒光光譜

如圖4所示，隨著pH值逐漸升高，納米材料在520 nm處的熒光強(qiáng)度也逐漸增加，這是由于熒光納米顆粒對pH值具有很高的敏感性。當(dāng)pH值從4增加到5時，納米材料的熒光強(qiáng)度增長較為緩慢，而pH值從5上升到7時，熒光強(qiáng)度迅速增加，等到pH值大于7以后，熒光強(qiáng)度增長再次趨于緩慢。

圖4 (a)不同pH(pH=4，5，6，7，8，9)條件下熒光納米顆粒的熒光光譜；(b)520 nm處的熒光強(qiáng)度與pH關(guān)系圖Fig.4 (a) Fluorescence spectra of fluorescent nanoparticles at different pH (pH= 4,5,6,7,8,9); (b) the relationship between fluorescence intensity and pH at 520 nm

因為熒光納米顆粒表面存在羥基，而溶液的pH值會影響羧基的質(zhì)子化狀態(tài)[15]，從而影響納米顆粒在溶液中的穩(wěn)定性。在堿性條件下，熒光納米顆粒所攜帶的羧基被去質(zhì)子化，并在納米顆粒表面形成一個帶負(fù)電荷的殼層，這種效應(yīng)可以通過納米顆粒之間的靜電斥力保持溶液的穩(wěn)定性。因此，在堿性條件下熒光強(qiáng)度高。在酸性條件下，羧酸基團(tuán)質(zhì)子化，納米顆粒之間的靜電斥力降低，形成聚集，熒光強(qiáng)度隨之降低[16]。

如圖5所示為熒光納米顆粒和熒光素鈉在520 nm處熒光強(qiáng)度折線圖比較，不同pH值下熒光納米顆粒的熒光強(qiáng)度明顯高于熒光素鈉，在中性條件下復(fù)合材料對pH值的變化更為敏感，熒光納米顆粒具有可水解內(nèi)酯結(jié)構(gòu)基團(tuán)，對pH敏感性能的變化可能是由于內(nèi)酯水解造成的。

圖5 熒光納米顆粒和熒光素鈉在522 nm處熒光強(qiáng)度與pH關(guān)系對比圖Fig.5 Relationship between pH and fluorescence intensity of fluorescent nanoparticles and sodium fluorescein at 522 nm

2.4 抗干擾和穩(wěn)定性測試

圖6 (a)熒光納米顆粒在pH為5(豎線填充)和pH為10(無填充)的水溶液中分別存在不同離子時的熒光響應(yīng)。0-空白組，在pH=5和pH=10條件下，熒光納米顆粒的熒光強(qiáng)度與時間關(guān)系圖Fig.6 (a) Fluorescence response of fluorescent nanoparticles in the presence of different ions in aqueous solutions at pH 5 (vertical line filling) and pH 10 (no filling). 0-blank group, 1-K+, 2-Mg2+, 3-Na+, 4-Cl-, (b) relationship between fluorescence intensity and time of fluorescent nanoparticles at pH=5 and pH=10

3 結(jié)論

結(jié)合pH探針的特點(diǎn)和聚集誘導(dǎo)淬滅分子的作用機(jī)理，將熒光素鈉與二氧化硅以硅烷偶聯(lián)劑的方式結(jié)合到一起，制備了pH響應(yīng)熒光納米顆粒。對熒光納米顆粒的pH響應(yīng)進(jìn)行了研究，在pH值為1～3時，紫外吸收強(qiáng)度隨pH增加逐漸降低，在pH值為5～11時，紫外吸光強(qiáng)度隨pH增加逐漸增加；且在pH值為4～9之間，熒光強(qiáng)度與pH值之間具有較好的響應(yīng)關(guān)系。pH值為5和10的緩沖溶液中，熒光納米顆粒對pH值的響應(yīng)幾乎不受其他離子的影響。因此，該材料可望在化學(xué)傳感器和生物探針等方面得以應(yīng)用。