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        定心方抑制PI3K/Akt 通路減輕脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究

        2023-02-09 09:09:32萬強(qiáng)胥玉林丁桃鄭翠翠涂夢(mèng)婷趙瞳魯啟文江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南昌330006江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌330004
        江西中醫(yī)藥 2023年1期
        關(guān)鍵詞:血清水平

        ★ 萬強(qiáng) 胥玉林 丁桃 鄭翠翠 涂夢(mèng)婷 趙瞳 魯啟文(.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006;.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004)

        動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種由氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)沉積于血管內(nèi)壁而引起機(jī)體發(fā)生的一種慢性炎癥性疾病,可嚴(yán)重危害人類健康[1]。巨噬細(xì)胞是破裂AS 斑塊的主要細(xì)胞組成部分,其炎癥反應(yīng)可促進(jìn)AS 的形成[2]。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin-2,LCN2)是由脂肪細(xì)胞分泌的與炎癥密切相關(guān)的新型脂肪細(xì)胞因子,其高表達(dá)可通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)AS 的發(fā)生[3]。定心方(dingxin recipe,DXR)是由丹參、赤芍、苦參等10 余味藥物組成的中醫(yī)心血管疾病經(jīng)驗(yàn)方,既往研究證實(shí)DXR 對(duì)AS 療效確切,但DXR 能否通過減輕LCN2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮抗AS 效應(yīng),目前尚不明確。本研究采用RAW264.7 巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,并通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002 及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抑 制 劑Triciribine,觀 察DXR 含藥血清對(duì)LCN2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用,并探討其可能機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 藥物 DXR 組成:苦參20 g,黃連18 g,黨參18 g,酸棗仁20 g,茯苓15 g,丹參15 g,葛根15 g,瓜蔞12 g,三七12 g,赤芍12 g,紅花10 g,靈芝10 g。以上藥材購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房,并經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥品種鑒定確認(rèn)。

        1.1.2 細(xì)胞株 RAW264.7 巨噬細(xì)胞(南昌鼎國(guó)生物有限公司,批號(hào)C1046)。

        1.1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司,批號(hào)2106);胎牛血清(杭州四季青公司,批號(hào)12147);重組LCN2 細(xì) 胞 因子(美國(guó)ProSpec 公司,批號(hào)ENZ-297);PI3K 及Akt 抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司,批號(hào)分別為2922、3896);LY294002 及Triciribine(美國(guó)Sigma 公司,批號(hào)分別為34915、28732);白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超敏C 反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)試劑盒(美國(guó)eBioscience 公司,批號(hào)分別為80021086、80282079、80354308)。

        1.1.4 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);透射電鏡(日本電子公司);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek 公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 DXR 含藥血清的制備 3 月齡SD 雄性大鼠灌胃DXR 藥液18.60 g/(kg·d),連續(xù)灌胃7 d,腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉,腹主動(dòng)脈采血,4℃靜置4 h,離心機(jī)中以3 000 r/min 離心10 min,取上清液即為血清,水浴滅活30 min 后濾膜抽濾除菌,DXR 含藥血清置入4 ℃冰箱保存。

        1.2.2 細(xì)胞分組及處理 RAW264.7 巨噬細(xì)胞加含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,置于含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為6組:(1)空白對(duì)照組:加空白血清;(2)LCN2 組:以10 μmol/L 的LCN2作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞48 h;(3)空白血清組:以空白血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h,再加10 μmol/L的LCN2 刺激48 h;(4)DXR 含藥血清組:以5% DXR 含藥血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h,再加10 μmol/L的LCN2 刺激48 h;(5)LY294002 組:以5% DXR含藥血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h 后再以10 μmol/L 的Y294002 預(yù)處理巨噬細(xì)胞30 min,加10 μmol/L 的LCN2 刺 激48 h;(6)Triciribine 組:以5% DXR含藥血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h 后再以20 μmol/L 的Triciribine 預(yù)處理巨噬細(xì)胞30 min,加10 μmol/L 的CN2 刺激48 h。

        1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)巨噬細(xì)胞活力 RAW264.7巨噬細(xì)胞以1×105/ 孔種于96 孔培養(yǎng)板中,加100 μL 培養(yǎng)基,每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔,24 h 后棄上清液,加10 μL CCK-8 液,酶標(biāo)儀檢測(cè)各復(fù)孔450 nm 處吸光度(A)值。

        1.2.4 ELISA 法檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平,具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.2.5 Western blot 檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá) 收集RAW264.7 巨噬細(xì)胞,離心后加入細(xì)胞裂解液,BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度,進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。IL-6、TNF-α、hs-CRP 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。ECL 顯色、曝光、Image J 分析條帶灰度值,β-actin 為內(nèi)參蛋白。

        1.2.6 透射電鏡檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量 收集RAW264.7 巨噬細(xì)胞,離心后鋨酸緩沖液固定、環(huán)氧樹脂包埋后制作成切片,染色后于透射電鏡觀察RAW264.7 巨噬細(xì)胞的自噬小體數(shù)量變化。

        1.2.7 免疫熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá) 收集RAW264.7 巨噬細(xì)胞,4%甲醛固定,加LC3-II 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶200)室溫孵育2 h。熒光顯微鏡下觀察RAW264.7 巨噬細(xì)胞LC3-II 陽(yáng)性表達(dá)。

        1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 分析數(shù)據(jù),以±s)表示。用單因素方差one-way ANOVA 方差分析,方差齊時(shí)以LSD 法比較組間多重?cái)?shù)據(jù),方差不齊時(shí)以Dunnett’s T3 法比較組間多重?cái)?shù)據(jù),以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

        與空白對(duì)照組比較,LCN2 可顯著降低RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力(P<0.01);與LCN2 組比較,DXR 含藥血清可顯著減輕由LCN2 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的下降(P<0.05);與DXR 含藥血清組比較,LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步減輕巨噬細(xì)胞活力的下降(P<0.05)。見表1。

        表1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果,n=3) %

        表1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果,n=3) %

        注:與空白對(duì)照組比較,**P<0.01;與LCN2組比較,#P<0.05;與DXR含藥血清組比較,▲P<0.05。

        2.2 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平的影響

        與空白對(duì)照組比較,LCN2 可顯著增加RAW264.7 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平(P<0.01);與LCN2 組比較,DXR 含藥血清可顯著降低巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平(P<0.01);與DXR 含藥血清組比較,LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平(P<0.05)。見表2。

        表2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的測(cè)定結(jié)果s,n=3)

        表2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的測(cè)定結(jié)果s,n=3)

        注:與空白對(duì)照組比較,**P<0.01;與LCN2組比較,##P<0.01;與DXR含藥血清組比較,▲P<0.05。

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        2.3 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)的影響

        與空白對(duì)照組比較,LCN2 可顯著增加RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)(P<0.05);與LCN2 組比較,DXR 含藥血清可顯著降低巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)(P<0.05);與DXR 含藥血清組比較,LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)(P<0.05) 。見圖1。

        圖1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

        2.4 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量的影響

        與空白對(duì)照組比較,LCN2 可顯著減少RAW264.7 巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量(P<0.05);與LCN2 組比較,DXR 含藥血清可顯著增加巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量(P<0.05);與DXR 含藥血清組比較,LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步增加巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量(P<0.05) 。見圖2。

        圖2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量的測(cè)定結(jié)果

        2.5 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)的影響

        與空白對(duì)照組比較,LCN2 可顯著降低RAW264.7巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)(P<0.05);與LCN2 組比較,DXR 含藥血清可顯著增加巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)(P<0.05);與DXR 含藥血清組比較,LY294002及Triciribine 可進(jìn)一步增加巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)(P<0.05) 。見圖3。

        圖3 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞LC3-II表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

        3 討論

        LCN2 是由脂肪細(xì)胞分泌的與炎癥密切相關(guān)的一種新型脂肪細(xì)胞因子,在炎癥過程中,LCN2 可以通過結(jié)合白三烯B4 形成促炎介質(zhì)[3-4]。LCN2 還能和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)結(jié)合形成復(fù)合物,防止MMP-9 被金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)特 異 性下調(diào)表達(dá),增加基質(zhì)降解和纖維帽破裂[5]。本研究結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,以10 μmol/L LCN2作 用RAW264.7 巨噬 細(xì)胞48 h 后,可 顯 著 降 低RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力,顯著增加巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平,并顯著增加巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)。研究結(jié)果證實(shí)LCN2可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

        巨噬細(xì)胞自噬水平下降,機(jī)體游離膽固醇水平降低,載脂蛋白A1 運(yùn)脂減少,外周血中高密度脂蛋白(high density lipoprotein,LDL)負(fù)反饋性下降,可降低脂質(zhì)斑塊穩(wěn)定性,促進(jìn)AS斑塊破裂[6]。LC3-II 的含量反映了自噬體的數(shù)量,其含量和發(fā)生的自噬水平成正比,是目前最廣泛用以檢測(cè)自噬激活的分子標(biāo)記物[7]。本研究結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,以10 μmol/L 的LCN2 作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞48 h 后,可顯著減少RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量,并顯著降低巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)。研究結(jié)果證實(shí)LCN2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生與巨噬細(xì)胞自噬水平的下降有關(guān)。

        PI3K/Akt 信號(hào)通路在細(xì)胞自噬中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路,可激活巨噬細(xì)胞自噬水平,減輕炎癥反應(yīng),從而抑制AS 進(jìn)展[8]。DXR 是由丹參、赤芍、苦參等10 余味藥物組成的中醫(yī)心血管疾病經(jīng)驗(yàn)方,既往研究證實(shí)DXR 對(duì)AS 療效確切。本研究結(jié)果表明,與LCN2 組比較,DXR 含藥血清可顯著減輕由LCN2 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的下降,顯著降低巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平及巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá),顯著增加巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量及巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)。與DXR 含藥血清組比較,LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步加強(qiáng)DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞的功效。研究結(jié)果證實(shí),DXR 含藥血清可顯著減輕LCN2 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),其機(jī)制與抑制PI3K/Akt 通路增加巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)。本研究結(jié)果為DXR 防治AS 提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),其抗AS 分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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