★ 萬強(qiáng) 胥玉林 丁桃 鄭翠翠 涂夢(mèng)婷 趙瞳 魯啟文（.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種由氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）沉積于血管內(nèi)壁而引起機(jī)體發(fā)生的一種慢性炎癥性疾病，可嚴(yán)重危害人類健康［1］。巨噬細(xì)胞是破裂AS 斑塊的主要細(xì)胞組成部分，其炎癥反應(yīng)可促進(jìn)AS 的形成［2］。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2（lipocalin-2，LCN2）是由脂肪細(xì)胞分泌的與炎癥密切相關(guān)的新型脂肪細(xì)胞因子，其高表達(dá)可通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)促進(jìn)AS 的發(fā)生［3］。定心方（dingxin recipe，DXR）是由丹參、赤芍、苦參等10 余味藥物組成的中醫(yī)心血管疾病經(jīng)驗(yàn)方，既往研究證實(shí)DXR 對(duì)AS 療效確切，但DXR 能否通過減輕LCN2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮抗AS 效應(yīng)，目前尚不明確。本研究采用RAW264.7 巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，并通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制劑LY294002 及蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抑 制 劑Triciribine，觀 察DXR 含藥血清對(duì)LCN2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 DXR 組成：苦參20 g，黃連18 g，黨參18 g，酸棗仁20 g，茯苓15 g，丹參15 g，葛根15 g，瓜蔞12 g，三七12 g，赤芍12 g，紅花10 g，靈芝10 g。以上藥材購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥品種鑒定確認(rèn)。

1.1.2 細(xì)胞株 RAW264.7 巨噬細(xì)胞（南昌鼎國(guó)生物有限公司，批號(hào)C1046）。

1.1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司，批號(hào)2106）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)12147）；重組LCN2 細(xì) 胞 因子（美國(guó)ProSpec 公司，批號(hào)ENZ-297）；PI3K 及Akt 抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)分別為2922、3896）；LY294002 及Triciribine（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)分別為34915、28732）；白細(xì)胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、超敏C 反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）試劑盒（美國(guó)eBioscience 公司，批號(hào)分別為80021086、80282079、80354308）。

1.1.4 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；透射電鏡（日本電子公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 DXR 含藥血清的制備 3 月齡SD 雄性大鼠灌胃DXR 藥液18.60 g/（kg·d），連續(xù)灌胃7 d，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4℃靜置4 h，離心機(jī)中以3 000 r/min 離心10 min，取上清液即為血清，水浴滅活30 min 后濾膜抽濾除菌，DXR 含藥血清置入4 ℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 RAW264.7 巨噬細(xì)胞加含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為6組：（1）空白對(duì)照組：加空白血清；（2）LCN2 組：以10 μmol/L 的LCN2作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞48 h；（3）空白血清組：以空白血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h，再加10 μmol/L的LCN2 刺激48 h；（4）DXR 含藥血清組：以5% DXR 含藥血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h，再加10 μmol/L的LCN2 刺激48 h；（5）LY294002 組：以5% DXR含藥血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h 后再以10 μmol/L 的Y294002 預(yù)處理巨噬細(xì)胞30 min，加10 μmol/L 的LCN2 刺 激48 h；（6）Triciribine 組：以5% DXR含藥血清預(yù)處理巨噬細(xì)胞1 h 后再以20 μmol/L 的Triciribine 預(yù)處理巨噬細(xì)胞30 min，加10 μmol/L 的CN2 刺激48 h。

1.2.3 CCK-8 法檢測(cè)巨噬細(xì)胞活力 RAW264.7巨噬細(xì)胞以1×105/ 孔種于96 孔培養(yǎng)板中，加100 μL 培養(yǎng)基，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，24 h 后棄上清液，加10 μL CCK-8 液，酶標(biāo)儀檢測(cè)各復(fù)孔450 nm 處吸光度（A）值。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá) 收集RAW264.7 巨噬細(xì)胞，離心后加入細(xì)胞裂解液，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。IL-6、TNF-α、hs-CRP 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。ECL 顯色、曝光、Image J 分析條帶灰度值，β-actin 為內(nèi)參蛋白。

1.2.6 透射電鏡檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量 收集RAW264.7 巨噬細(xì)胞，離心后鋨酸緩沖液固定、環(huán)氧樹脂包埋后制作成切片，染色后于透射電鏡觀察RAW264.7 巨噬細(xì)胞的自噬小體數(shù)量變化。

1.2.7 免疫熒光標(biāo)記巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá) 收集RAW264.7 巨噬細(xì)胞，4%甲醛固定，加LC3-II 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶200）室溫孵育2 h。熒光顯微鏡下觀察RAW264.7 巨噬細(xì)胞LC3-II 陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 分析數(shù)據(jù)，以±s）表示。用單因素方差one-way ANOVA 方差分析，方差齊時(shí)以LSD 法比較組間多重?cái)?shù)據(jù)，方差不齊時(shí)以Dunnett’s T3 法比較組間多重?cái)?shù)據(jù)，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

與空白對(duì)照組比較，LCN2 可顯著降低RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力（P<0.01）；與LCN2 組比較，DXR 含藥血清可顯著減輕由LCN2 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活力的下降（P<0.05）；與DXR 含藥血清組比較，LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步減輕巨噬細(xì)胞活力的下降（P<0.05）。見表1。

表1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果，n=3） %

表1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果，n=3） %

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與LCN2組比較，#P<0.05；與DXR含藥血清組比較，▲P<0.05。

2.2 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平的影響

與空白對(duì)照組比較，LCN2 可顯著增加RAW264.7 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平（P<0.01）；與LCN2 組比較，DXR 含藥血清可顯著降低巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平（P<0.01）；與DXR 含藥血清組比較，LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平（P<0.05）。見表2。

表2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的測(cè)定結(jié)果s，n=3）

表2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP水平的測(cè)定結(jié)果s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與LCN2組比較，##P<0.01；與DXR含藥血清組比較，▲P<0.05。

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2.3 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LCN2 可顯著增加RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)（P<0.05）；與LCN2 組比較，DXR 含藥血清可顯著降低巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)（P<0.05）；與DXR 含藥血清組比較，LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)（P<0.05） 。見圖1。

圖1 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

2.4 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量的影響

與空白對(duì)照組比較，LCN2 可顯著減少RAW264.7 巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量（P<0.05）；與LCN2 組比較，DXR 含藥血清可顯著增加巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量（P<0.05）；與DXR 含藥血清組比較，LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步增加巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量（P<0.05） 。見圖2。

圖2 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量的測(cè)定結(jié)果

2.5 DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LCN2 可顯著降低RAW264.7巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)（P<0.05）；與LCN2 組比較，DXR 含藥血清可顯著增加巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)（P<0.05）；與DXR 含藥血清組比較，LY294002及Triciribine 可進(jìn)一步增加巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)（P<0.05） 。見圖3。

圖3 各組RAW264.7巨噬細(xì)胞LC3-II表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

3 討論

LCN2 是由脂肪細(xì)胞分泌的與炎癥密切相關(guān)的一種新型脂肪細(xì)胞因子，在炎癥過程中，LCN2 可以通過結(jié)合白三烯B4 形成促炎介質(zhì)［3-4］。LCN2 還能和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）結(jié)合形成復(fù)合物，防止MMP-9 被金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitors of metalloproteinases-1，TIMP-1）特 異 性下調(diào)表達(dá)，增加基質(zhì)降解和纖維帽破裂［5］。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，以10 μmol/L LCN2作 用RAW264.7 巨噬 細(xì)胞48 h 后，可 顯 著 降 低RAW264.7 巨噬細(xì)胞活力，顯著增加巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平，并顯著增加巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)。研究結(jié)果證實(shí)LCN2可顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞自噬水平下降，機(jī)體游離膽固醇水平降低，載脂蛋白A1 運(yùn)脂減少，外周血中高密度脂蛋白（high density lipoprotein，LDL）負(fù)反饋性下降，可降低脂質(zhì)斑塊穩(wěn)定性，促進(jìn)AS斑塊破裂［6］。LC3-II 的含量反映了自噬體的數(shù)量，其含量和發(fā)生的自噬水平成正比，是目前最廣泛用以檢測(cè)自噬激活的分子標(biāo)記物［7］。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，以10 μmol/L 的LCN2 作用RAW264.7 巨噬細(xì)胞48 h 后，可顯著減少RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量，并顯著降低巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)。研究結(jié)果證實(shí)LCN2 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生與巨噬細(xì)胞自噬水平的下降有關(guān)。

PI3K/Akt 信號(hào)通路在細(xì)胞自噬中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，可激活巨噬細(xì)胞自噬水平，減輕炎癥反應(yīng)，從而抑制AS 進(jìn)展［8］。DXR 是由丹參、赤芍、苦參等10 余味藥物組成的中醫(yī)心血管疾病經(jīng)驗(yàn)方，既往研究證實(shí)DXR 對(duì)AS 療效確切。本研究結(jié)果表明，與LCN2 組比較，DXR 含藥血清可顯著減輕由LCN2 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的下降，顯著降低巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α、hs-CRP 水平及巨噬細(xì)胞IL-6、TNF-α、hs-CRP 蛋白表達(dá)，顯著增加巨噬細(xì)胞自噬小體數(shù)量及巨噬細(xì)胞LC3-II 表達(dá)。與DXR 含藥血清組比較，LY294002 及Triciribine 可進(jìn)一步加強(qiáng)DXR 含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞的功效。研究結(jié)果證實(shí)，DXR 含藥血清可顯著減輕LCN2 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制與抑制PI3K/Akt 通路增加巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)。本研究結(jié)果為DXR 防治AS 提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其抗AS 分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。