潘彥宏，詹錚，姜?jiǎng)欧?/p>

南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

次髎位于足太陽(yáng)膀胱經(jīng)，臨近胞宮，而任督二脈、沖脈皆起于胞宮，因上述經(jīng)脈走行范圍廣泛及穴位的遠(yuǎn)治作用，次髎穴在臨床上的應(yīng)用范圍隨之增加。研究發(fā)現(xiàn)，針刺次髎穴不僅可以治療腰骶部運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病和盆腔器官相關(guān)疾病[1]，亦可治療局灶性疾病[2]、全身性炎癥疾病[3]，并降低內(nèi)臟高敏狀態(tài)[4]。

骶神經(jīng)刺激(sacral nerve stimulation，SNS)可通過(guò)“脊髓-中樞”環(huán)路激活膽堿能通路改善急性結(jié)腸炎癥狀[5]，而電針次髎穴可作為SNS的臨床轉(zhuǎn)化方法。本課題組研究證明，電針“次髎”能夠降低脂多糖所致全身重度炎癥模型大鼠的血清炎癥因子水平，提高致死性?xún)?nèi)毒素血癥模型大鼠生存率[6]。從選擇軀干部位的相似性到上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，兩種刺激方法存在高度的一致性，都需要頸迷走神經(jīng)及中樞膽堿能受體參與。故而推測(cè)，電針次髎亦可通過(guò)膽堿能通路發(fā)揮全身性抗炎效應(yīng)。針刺八髎區(qū)域穴位可不經(jīng)過(guò)迷走傳入途徑，而是經(jīng)由“脊髓-中樞”環(huán)路直接作用于腦部迷走神經(jīng)復(fù)合體(dorsal vagal complex，DVC)，從而引發(fā)相應(yīng)的效應(yīng)。迷走神經(jīng)被認(rèn)為是腦和免疫系統(tǒng)之間的雙向連接器，其中樞端涉及腦干部位的DVC核團(tuán)[7]。已有研究證明，骶神經(jīng)刺激可增強(qiáng)孤束核c-fos陽(yáng)性表達(dá)及外周迷走神經(jīng)活性，本課題組實(shí)驗(yàn)亦證明迷走神經(jīng)與盆神經(jīng)參與次髎穴的抗炎效應(yīng)，然而針刺次髎對(duì)孤束核與外周迷走神經(jīng)的具體影響未見(jiàn)報(bào)道。

大量實(shí)驗(yàn)證明，交感環(huán)路在機(jī)體抗炎中發(fā)揮重要作用[8-10]，內(nèi)臟大神經(jīng)介導(dǎo)軀體所調(diào)控的全身性炎癥反應(yīng)[11-12]。Martelli等[13]研究發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)在炎癥反射中比迷走神經(jīng)更強(qiáng)大，而針刺次髎對(duì)于交感神經(jīng)系統(tǒng)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究觀察針刺次髎對(duì)于孤束核、迷走神經(jīng)、藍(lán)斑核放電的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物健康成年雄性SD大鼠48只，30只體質(zhì)量300～320 g，18只體質(zhì)量230～250 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(浙)2019-0001。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h/12 h明暗周期交替飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理審查，倫理批號(hào)：012021001085。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循“3R”原則，遵照科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》規(guī)定，進(jìn)行充分麻醉。

1.2 藥物與試劑烏拉坦(又稱(chēng)氨基甲酸乙酯，化學(xué)純，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：20201030)；滂胺天藍(lán)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：2610-05-1、L8880)；無(wú)水乙酸鈉、石蠟油(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20200111、20200228)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 ELISA測(cè)定試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司，批號(hào)：LZ-T6870、LZ-H6036、LZ-H7216)。

1.3 儀器HANS-200型電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)；(10)22100821型一次性無(wú)菌針灸針(規(guī)格：0.35 mm×25 mm，北京中研太合醫(yī)療器械有限公司)；TDL4-T型低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，離心半徑：8.0 cm)；RT-6100型酶標(biāo)儀(美國(guó)Rayto公司)；JB-1028型腦立體定位儀(美國(guó)David Kopf Instruments公司)；PC-100型微電極操作控制器(日本Narishige公司)；1700型細(xì)胞外電生理記錄放大器(美國(guó)A-M systmmes公司)；Mi-cro3-1401型生理信號(hào)采集分析系統(tǒng)(英國(guó)CED公司)；H-KWDY-Ⅲ型溫控儀(南京市泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)；ALC-CED6型電動(dòng)顱骨鉆(上海奧爾科特生物科技有限公司)；WD-1型玻璃微電極拉制儀(成都儀器廠)；B120-90-10型玻璃微電極(規(guī)格：100 mm×1.2 mm，南京市泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠)。

2 方法

2.1 分組、造模與干預(yù)方法動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為實(shí)驗(yàn)一組和實(shí)驗(yàn)二組，其中實(shí)驗(yàn)一組為體質(zhì)量230～250 g的18只大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組與次髎組，每組6只。術(shù)前動(dòng)物禁食12 h，不禁水，大鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)20%烏拉坦(1.0 g·kg-1)進(jìn)行麻醉后，正常組大鼠根據(jù)體質(zhì)量以0.67 mL·kg-1的劑量腹腔注射9 ng·L-1氯化鈉溶液，模型組與次髎組則以1 mL·kg-1的劑量腹腔注射LPS(6 mg·kg-1)制備全身重度炎癥模型[14]。造模完成后，參照文獻(xiàn)[15-16]對(duì)大鼠次髎穴進(jìn)行定位，大鼠S2相當(dāng)于人類(lèi)的中髎和次髎穴，位于第2、第3骶骨棘突間隙正中旁開(kāi)約5 mm。電針次髎時(shí)，電流強(qiáng)度以大鼠雙下肢內(nèi)收內(nèi)旋、尾巴震動(dòng)為準(zhǔn)[17-18]，頻率 30 Hz，波寬(0.2±0.06)ms，于造模前后各電針 30 min。實(shí)驗(yàn)二組為體質(zhì)量300～320 g的30只大鼠，隨機(jī)分為孤束核組、藍(lán)斑組與迷走神經(jīng)組，每組10只，無(wú)需造模，直接進(jìn)行左側(cè)次髎穴直刺干預(yù)，進(jìn)針深度為15 mm，施以手法(捻轉(zhuǎn)120°、頻率80次·min-1)刺激30 s。

2.2 神經(jīng)元放電細(xì)胞外記錄實(shí)驗(yàn)二組大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，以體積分?jǐn)?shù)20%烏拉坦(1 g·kg-1)腹腔注射進(jìn)行麻醉。孤束核組、藍(lán)班組：大鼠俯臥位，用耳棒將大鼠雙耳固定在腦立體定位儀上，于頭正中線切開(kāi)皮膚，分離皮下組織、骨膜，暴露顱骨，調(diào)整前后囟高度使其保持在同一條水平線上。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用加熱毯將動(dòng)物體溫維持在37～39 ℃。按照Paxinos G和Watson C圖譜[19]定位左側(cè)孤束核(坐標(biāo)：AP=11.0～11.4 mm，RL=1.0 mm，H=5.6 mm)及左側(cè)藍(lán)斑(坐標(biāo)：AP=11.6 mm，RL=1.0 mm，H=5.6 mm)，牙科鉆除去對(duì)應(yīng)定點(diǎn)部位的顱頂骨，在顯微鏡下小心去除硬腦膜，用38 ℃石蠟油覆蓋，保護(hù)腦組織。采用充置含1%滂胺天藍(lán)的 0.5 mol·L-1醋酸鈉電解液的玻璃微電極(尖端0.5～2 μm，阻抗：10～20 mΩ)通過(guò)微電極操作器控制到達(dá)目標(biāo)核團(tuán)，探查神經(jīng)元放電，進(jìn)行細(xì)胞外記錄[20]。當(dāng)神經(jīng)元自發(fā)放電信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，上下調(diào)整推進(jìn)器位置至信噪比較大時(shí)停止推進(jìn)，電極尖端停留在放電神經(jīng)元處，觀察其穩(wěn)定放電后開(kāi)始記錄。所記錄放電信號(hào)經(jīng)前置放大器放大，輸入生理信號(hào)采集系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，使用Spike 2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄與分析。根據(jù)上述大鼠腦立體定位圖譜所定位置，孤束核組采用微電極垂直進(jìn)入腦部，而記錄藍(lán)斑時(shí)，玻璃微電極針尖向大鼠頭面方向沿矢狀面傾斜15°(避開(kāi)橫竇)進(jìn)入腦部，其余實(shí)驗(yàn)步驟與孤束核組一致。迷走神經(jīng)組：從大鼠頸前胸鎖乳突肌做切口，逐層剪開(kāi)皮膚、肌肉，暴露頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，迷走神經(jīng)主干位于頸椎中段，用玻璃分針輕柔地分離頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，充分暴露迷走神經(jīng)后，滴入 34～38 ℃的溫?zé)崾炗徒∩窠?jīng)。將自制的引導(dǎo)電極從分離出的迷走神經(jīng)穿過(guò)，參考電極置于切口處的皮下。神經(jīng)放電產(chǎn)生的電信號(hào)經(jīng)引導(dǎo)電極和參考電極傳入前置放大器，放大后經(jīng)過(guò)過(guò)濾被生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)采集轉(zhuǎn)變成圖像顯示在電腦上。放電信號(hào)穩(wěn)定后，首先記錄正常放電30 s作為基線對(duì)照，隨后針刺穴位給予刺激30 s，同時(shí)觀察并記錄孤束核神經(jīng)元、藍(lán)斑神經(jīng)元與迷走神經(jīng)電活動(dòng)30 s，記錄結(jié)束后取針。完整記錄一個(gè)循環(huán)(基線-針刺-取針)保存為該穴位組的樣本數(shù)據(jù)。

2.3 組織學(xué)定位神經(jīng)元放電細(xì)胞外記錄結(jié)束后，采用數(shù)顯直流穩(wěn)壓電源刺激器向玻璃微電極通 20 μA 負(fù)向直流電20～30 min，將玻璃微電極內(nèi)的滂胺天藍(lán)醋酸鈉溶液導(dǎo)入腦組織以標(biāo)記位置。隨后取腦組織并固定于40 ng·L-1多聚甲醛溶液中 72 h，保存于 4 ℃ 冰箱中。取出后置于20%蔗糖溶液中4 ℃浸泡12 h，再置于30%蔗糖溶液中4 ℃浸泡12 h后進(jìn)行梯度脫水。脫水后用冰凍切片機(jī)制備50～60 μm 厚的腦切片，觀察染色，檢查記錄點(diǎn)位置。完整記錄一個(gè)循環(huán)數(shù)據(jù)并且位置準(zhǔn)確者，方可納入最終統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2.4 ELISA檢測(cè)血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一組大鼠血清炎性因子含量。實(shí)驗(yàn)一組大鼠在造模3 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3mL，靜置30 min，2 000 r·min-1離心 20 min 后取上清液存于-80 ℃冰箱。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的濃度，據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本的實(shí)際含量。

3 結(jié)果

3.1 針刺次髎穴對(duì)全身重度炎癥模型大鼠血清炎性因子的影響與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加；與模型組比較，次髎組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見(jiàn)圖1。

注：與正常組比較，***P<0.000 1；與模型組比較，###P<0.000 1

3.2 針刺次髎穴對(duì)孤束核神經(jīng)元放電頻率的影響實(shí)驗(yàn)共觀察記錄到20個(gè)神經(jīng)元，與本組針刺前比較，針刺后大鼠孤束核神經(jīng)元放電頻率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果表明，針刺次髎穴可提高孤束核神經(jīng)元自發(fā)放電的頻率。見(jiàn)圖2、圖3。

注：A：左圖為腦組織切片圖(前囟Bregma-11 mm)，藍(lán)染處為NTS記錄點(diǎn)，右圖紅色區(qū)域?yàn)榻M織圖示冠狀切面NTS所在位置(前囟Bregma-11.04 mm)；B：左圖為腦組織切片圖(Bregma-9.8 mm)，藍(lán)染處為L(zhǎng)C記錄點(diǎn)，右圖紅色區(qū)域?yàn)榻M織圖示冠狀切面LC所在位置(Bregma-9.84 mm)

注：A：針刺次髎穴后孤束核神經(jīng)元放電示意圖；B：神經(jīng)元放電頻率量化圖，與針刺前比較，**P<0.001

3.3 針刺次髎穴對(duì)藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率的影響實(shí)驗(yàn)共觀察記錄到14個(gè)神經(jīng)元，與本組針刺前比較，針刺后大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果表明，針刺次髎穴可提高藍(lán)斑神經(jīng)元自發(fā)放電頻率。見(jiàn)圖4。

注：A：針刺次髎穴后藍(lán)斑神經(jīng)元放電示意圖；B：神經(jīng)元放電頻率量化圖，與針刺前比較，##P<0.01

3.4 針刺次髎穴對(duì)迷走神經(jīng)放電頻率的影響與本組針刺前比較，針刺后大鼠迷走神經(jīng)放電頻率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明，針刺次髎穴可提高迷走神經(jīng)自發(fā)放電的頻率。見(jiàn)圖5。

注：A：針刺次髎穴后迷走神經(jīng)放電示意圖；B：神經(jīng)元放電頻率量化圖，與針刺前比較，#P<0.05

4 討論

課題組前期研究已證明頸迷走神經(jīng)可參與電針次髎的抗炎效應(yīng)[6]。本次研究結(jié)果指示，針刺次髎可明顯激活NTS，促進(jìn)外周迷走神經(jīng)放電，與前期研究結(jié)果一致。另外，已證實(shí)SNS可顯著提高心率變異性中HF的比值、外周迷走神經(jīng)活性及腸壁中ChAT+陽(yáng)性表達(dá)，故本次研究為針刺次髎作為SNS的臨床轉(zhuǎn)化方法增添了基礎(chǔ)證據(jù)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)針刺次髎穴可激活藍(lán)斑神經(jīng)元，此前未見(jiàn)有文章報(bào)道。

針刺次髎穴或可激活脊髓上中樞、啟動(dòng)自主神經(jīng)通路，實(shí)現(xiàn)次髎的抗炎效應(yīng)。頸迷走神經(jīng)刺激、經(jīng)耳迷走神經(jīng)刺激與電針足三里分別通過(guò)直接激活迷走神經(jīng)與軀體-自主神經(jīng)反射啟動(dòng)迷走環(huán)路，將信息傳達(dá)腦干部位的DVC核團(tuán)，發(fā)揮膽堿能抗炎效應(yīng)[21-23]，降低脂多糖致全身重度炎癥模型大鼠的死亡率與致炎因子。不同的是，電針次髎降低脂多糖致全身重度炎癥模型大鼠死亡率的效果不僅僅是頸迷走神經(jīng)與盆神經(jīng)的參與作用，或仍存在交感神經(jīng)系統(tǒng)的參與作用。在電針深刺次髎治療膀胱過(guò)度活動(dòng)中，不僅激活了副交感屬性的盆神經(jīng)，也激活了胸腰髓交感神經(jīng)中樞發(fā)出的腹下神經(jīng)(交感屬性)[24]。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺次髎穴或可通過(guò)抑制外周和中央傷害部位中的環(huán)氧化酶合成，產(chǎn)生抗炎作用[25-26]。針刺次髎穴還可降低慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者中前列腺素E2的高表達(dá)，前列腺素E2可介導(dǎo)炎癥和疼痛感知，與交感神經(jīng)興奮性成反饋性調(diào)節(jié)[27]。因此，針刺次髎穴不僅可提高外周迷走神經(jīng)活性，還可增強(qiáng)交感神經(jīng)興奮性從而促進(jìn)軀體全身性抗炎效應(yīng)。

針刺次髎穴可調(diào)節(jié)機(jī)體的排尿、排便和性功能，證明針刺次髎穴的副交感調(diào)節(jié)屬性[28]。另一方面，由于骶叢副交感中樞是交感屬性[29-31]的討論引發(fā)了關(guān)于其自主神經(jīng)功能方向的爭(zhēng)議。有研究提示，傳入迷走興奮可引發(fā)交感屬性的內(nèi)臟大神經(jīng)抗炎通路的激活[32-33]，由此推測(cè)，針刺次髎穴對(duì)交感神經(jīng)系統(tǒng)的影響存在副交感神經(jīng)纖維的參與。對(duì)高位中樞損傷模型小鼠進(jìn)行盆腔輕刺激，如膀胱充盈，傳入腰骶脊髓可導(dǎo)致交感神經(jīng)節(jié)前纖維的高度興奮及病變水平以下的大量交感神經(jīng)放電，引發(fā)肌肉、內(nèi)臟和皮膚血管的收縮，致軀體炎癥過(guò)度而出現(xiàn)免疫抑制[34-35]，揭示了傳入膀胱充盈感覺(jué)的盆神經(jīng)纖維的激活可引發(fā)延髓水平的交感節(jié)前纖維興奮。針刺次髎可激活盆神經(jīng)與腹下神經(jīng)，腹下神經(jīng)(交感神經(jīng)屬性)主要傳導(dǎo)膀胱痛覺(jué)，而高位中樞損傷模型小鼠多因尿潴留與便秘而非盆腔疼痛引發(fā)免疫抑制與高血壓性自主神經(jīng)反射障礙，故推測(cè)針刺次髎是以副交感傳入纖維為入口引發(fā)軀體的副交感傳出與交感激活效應(yīng)。

次髎穴是體表刺激調(diào)節(jié)副交感神經(jīng)途徑的方式之一[36]，針刺通過(guò)軀體-自主神經(jīng)反射激活迷走神經(jīng)從而發(fā)揮全身性的抗炎作用。在此之前，電針治療脂多糖致全身重度炎癥模型大鼠多采用內(nèi)關(guān)、足三里與天樞等穴[37]，次髎穴的研究為其添加了新的內(nèi)容。結(jié)合本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，次髎穴的全身性抗炎效應(yīng)或?yàn)樵黾痈苯桓袀魅耄岣呒顾枭献灾魃窠?jīng)中樞興奮性而實(shí)現(xiàn)。針刺次髎穴后，孤束核神經(jīng)元與藍(lán)斑神經(jīng)元放電頻率的改變存在差異。因?qū)嶒?yàn)條件有限，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多在傍晚或夜間獲取。大鼠腦干部位的孤束核與藍(lán)斑分別代表腦部的副交感中樞與交感中樞，二者在麻醉狀態(tài)下存在生理性差異。根據(jù)經(jīng)典的“flip-flop switch”模型[38]，認(rèn)為促覺(jué)醒的單胺能細(xì)胞群可向下丘腦的睡眠調(diào)控中樞-腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preoptic area，VLPO)發(fā)送抑制性輸出，從而產(chǎn)生覺(jué)醒促進(jìn)作用，藍(lán)斑分泌的去甲腎上腺素參與其中的調(diào)節(jié)喚醒，且在麻醉狀態(tài)下藍(lán)斑神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率迅速降低。

實(shí)驗(yàn)二組大鼠因電刺激次髎時(shí)的電磁干擾，影響了儀器對(duì)神經(jīng)元放電的實(shí)時(shí)檢測(cè)，故而采用手針的刺激方式。手針的刺激在明顯弱于電針刺激(實(shí)驗(yàn)一所用參數(shù))的情況下，依舊得出明顯的實(shí)驗(yàn)成果，足以說(shuō)明次髎穴對(duì)于自主神經(jīng)系統(tǒng)的特異性調(diào)節(jié)作用。

綜上，次髎穴的中樞整合端位于腦干部位的自主神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)核團(tuán)，針刺次髎穴可通過(guò)促進(jìn)核團(tuán)神經(jīng)元放電頻率干預(yù)軀體自主神經(jīng)功能調(diào)節(jié)。