黃湘平，吳玲，譚超超

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種常見的急腹癥，以持續(xù)性上腹部劇烈疼痛為典型臨床癥狀，可伴有腹脹、惡心、嘔吐等。近些年，AP的發(fā)病率逐年上升，每十萬(wàn)人中約有34人發(fā)病[1]。引起AP的因素有很多，常見的因素主要為膽石癥和飲酒，其他因素包括：內(nèi)鏡逆行胰膽管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）、藥物、高三酰甘油血癥、感染、創(chuàng)傷等。目前發(fā)現(xiàn)的AP的發(fā)病機(jī)制有胰蛋白酶原激活、Ca2+超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、自噬受損，其中胰蛋白酶原激活被認(rèn)為是AP的一個(gè)非常重要的發(fā)病機(jī)制。胰酶的異常激活能夠消化胰腺及其周圍器官，產(chǎn)生局部胰腺炎性反應(yīng)，病情進(jìn)一步進(jìn)展可能導(dǎo)致多器官功能衰竭[2]。根據(jù)2012年修訂版亞特蘭大分類（RAC）標(biāo)準(zhǔn)，AP可分為輕癥急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）、中重癥急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）和重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）[3]。MAP 不伴有器官功能衰竭和局部或全身并發(fā)癥，通常在2周之內(nèi)恢復(fù)，病死率極低；SAP常伴有持續(xù)性器官衰竭，病死率極高，可超過(guò)30%[4]。大多數(shù)AP患者屬于MAP，具有自限性，通常在1周內(nèi)痊愈。有研究表明，約15%的AP患者首次入院時(shí)表現(xiàn)為MSAP或SAP[5]，伴有胰腺或胰周組織壞死或器官衰竭，或兩者兼而有之，病死率達(dá)20%～40%[6]，對(duì)于可能進(jìn)展為SAP的AP患者，早期識(shí)別和診斷并采取及時(shí)有效的治療措施對(duì)改善患者預(yù)后和降低患者病死率均具有重要意義。實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)如C反應(yīng)蛋白、尿素氮、血細(xì)胞比容與AP嚴(yán)重程度存在一定相關(guān)性，但是其準(zhǔn)確性欠佳，臨床上采用的多種評(píng)分系統(tǒng)如急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)價(jià)Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）、急性胰腺炎嚴(yán)重程度床邊指數(shù)評(píng)分也存在一定的不足[7]。代謝組學(xué)旨在對(duì)參與疾病代謝的小分子物質(zhì)進(jìn)行研究，其價(jià)值在于從傳統(tǒng)的尋找疾病診斷和預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物進(jìn)展為尋找異常的代謝通路。代謝組學(xué)能夠?qū)ο鄬?duì)分子質(zhì)量＜1 000的內(nèi)源性代謝物進(jìn)行全面測(cè)量，是了解生理和病理反應(yīng)中已知的代謝通路和生物功能改變的一種有效方法[8]。本研究擬采用代謝組學(xué)篩選出MAP和SAP的差異代謝物，尋找異常代謝通路，探索區(qū)別MAP和SAP的潛在生物標(biāo)志物，為SAP的早期診斷、治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年8月至2021年3月于湖南省人民醫(yī)院住院治療的MAP患者40例（MAP組）、SAP患者28例（SAP組）為研究對(duì)象。AP診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）上腹部持續(xù)性疼痛；（2）血清淀粉酶和/或脂肪酶濃度≥參考值上限的3倍；（3）腹部影像學(xué)檢查結(jié)果顯示符合AP影像學(xué)改變。上述3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中符合2項(xiàng)即可診斷為AP[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合RAC標(biāo)準(zhǔn)中MAP和SAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）無(wú)其他嚴(yán)重的代謝性和免疫性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有風(fēng)濕免疫性疾病、腫瘤、肝臟和腎臟疾病等能夠?qū)е乱认傺椎募膊　?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 甲醇（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；乙腈（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；蒸餾水（屈臣氏集團(tuán)）；EP管（湖州中銳精密科技有限公司）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；液相質(zhì)譜分析儀（美國(guó)Bruker公司）；G-560E型漩渦振動(dòng)器（美國(guó) Thermo Scientific公司）；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；醫(yī)用冰箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 樣本采集與處理

1.3.1 樣本采集 采集所有患者入院時(shí)靜脈血，離心取血清。

1.3.2 樣本處理 取患者血清 100 μl，加入 10 μl內(nèi)標(biāo)（0.3 mg/ml的L-2-氯苯丙氨酸，甲醇配制），渦旋震蕩10 s；加入300 μl蛋白沉淀劑甲醇-乙腈（2∶1，V/V），渦旋震蕩1 min；在冰水浴中超聲提取10～15 min；于 -20 ℃冰箱中靜置 30 min；于 4 ℃條件以13 000 r/min 速率離心 15 min，取 200 μl上清液，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）進(jìn)行分析。

1.3.3 質(zhì)控品的制備 質(zhì)控用于評(píng)價(jià)進(jìn)樣前的儀器、色譜質(zhì)譜系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性，確保得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。68份樣本各吸取10 μl并置于EP管中，渦旋混勻10 s，從EP管中依次吸取100 μl分裝為6管（多余的液體棄掉），其余步驟按照1.3.2樣本處理的方法進(jìn)行處理。

1.4 LC-MS分析 以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）作為代謝物分離檢測(cè)平臺(tái)，研究MAP組與SAP組患者血清樣本的代謝物差異，在質(zhì)譜正、負(fù)離子模式下收集數(shù)據(jù)；高效液相色譜條件：AcclainmTMRSLC120-C18 色 譜 柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），柱溫保持在40 ℃，進(jìn)樣量3 μl。流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸/水（含2 mmol/L甲酸銨），流動(dòng)相B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈/水，梯度設(shè)置：2%B 持續(xù) 0～2 min，50%B 持續(xù) 2～12 min，90%B 持續(xù)10～30 min，98%B 繼續(xù)持續(xù) 30～60 min；流速維持在400 μl/min；質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（electrosprayion source，ESI±），采用正、負(fù)離子模式檢測(cè)，使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，流速為1.2 L/min，掃描質(zhì)荷比范圍為 20～1 000 m/z，干燥氣溫度為 200 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 通過(guò)Metaboscape 3.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、除噪、標(biāo)準(zhǔn)化、導(dǎo)出等預(yù)處理，再將數(shù)據(jù)上傳至人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB）進(jìn)行匹配，最后得到代謝物的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰值等信息。

1.5.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將通過(guò)預(yù)處理得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行分析，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，使分析的數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，以排除個(gè)體間差異和外界多重因素的影響，使各代謝物之間在數(shù)值上具有一定可比性；采用單變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法〔t檢驗(yàn)與差異倍數(shù)（FC，即在兩組間代謝物相對(duì)含量差異的倍數(shù)）相結(jié)合〕，以P＜0.05，F(xiàn)C＞1.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選MAP組與SAP組患者血清樣本的差異代謝物。通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行概述和離群值檢測(cè)；然后構(gòu)建偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）模型進(jìn)行分類，并通過(guò)K折交互驗(yàn)證和100次置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，了解模型的可靠性；通過(guò)PLS-DA得到變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP），以 VIP＞1.0 篩選潛在的差異代謝物；通過(guò)聚類分析評(píng)價(jià)不同代謝物的相關(guān)性及聚類程度；最終將得到的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，并結(jié)合受試者工作特征（ROC）曲線分析差異代謝物對(duì)MAP和SAP的鑒別診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)儀器的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，對(duì)本次實(shí)驗(yàn)6份質(zhì)控樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果提示6份質(zhì)控樣本的偏差均在2 SD范圍內(nèi)，說(shuō)明儀器的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性均好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠且能反映不同組別之間代謝組學(xué)上的差異。

2.2 單變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 采用火山圖顯示兩組患者血清樣本的差異代謝物。在正離子模式下，篩選出41種差異代謝物（圖1A，本文所有的圖來(lái)源于https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml）；在負(fù)離子模式下，篩選出30種差異代謝物（圖1B）。

圖1 MAP組與SAP組患者血清樣本差異代謝物的火山圖Figure 1 Volcano plot of differential metabolites in serum samples from patients in MAP group and SAP group

2.3 多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.3.1 主成分分析結(jié)果 在正、負(fù)離子模式下，兩組患者血清樣本的代謝物組內(nèi)差異比較小，而組間差異較明顯（圖2A、B），說(shuō)明代謝物信息特征能夠區(qū)分MAP和SAP患者血清樣本，即兩組代謝物輪廓存在明顯差異。

圖2 MAP與SAP正負(fù)離子得分散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter plots of MAP and SAP

2.3.2 PLS-DA結(jié)果 利用PLS-DA方法對(duì)兩組患者血清標(biāo)本的代謝物輪廓進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2C、D，正、負(fù)離子模式下，兩組代謝組學(xué)存在明顯差異。

2.3.3 模型擬合效果評(píng)價(jià) 對(duì)構(gòu)建好的模型進(jìn)行K折交互驗(yàn)證以評(píng)價(jià)模型擬合效果，以R2評(píng)價(jià)模型的解釋度，Q2評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)值，正離子模式下，R2、Q2分別為0.949、0.745；負(fù)離子模式下，R2、Q2分別為0.967、0.795，R2、Q2均＞0.5，說(shuō)明模型擬合效果好，再對(duì)模型進(jìn)行100次置換檢驗(yàn)，得到的P值均＜0.1，提示不存在過(guò)擬合的情況。

在成功構(gòu)建正、負(fù)離子模式下MAP與SAP患者血清樣本的代謝物模型下，進(jìn)一步根據(jù)VIP篩選潛在的差異代謝物，在VIP＞1.0的條件下，在正離子模式下篩選出差異代謝物31種，在負(fù)離子模式下篩選出差異代謝物19種。

2.3.4 聚類分析結(jié)果 對(duì)MAP組與SAP組患者血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示在正、負(fù)離子模式下，兩組患者的血清代謝物均呈現(xiàn)出較為明顯的聚類，見圖3。

圖3 MAP組與SAP組患者血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)聚類分析熱圖Figure 3 Heat map of cluster analysis of serum metabolomics data of patients in MAP group and SAP group

2.4 差異代謝物及代謝通路分析結(jié)果

2.4.1 MAP與SAP患者血清代謝物分析結(jié)果 正離子模式下有31種差異代謝物，其中升高的有18種：2，5-二甲基呋喃、龍膽紫、3-亞磺基丙氨酸、腎上腺素乙醇酰胺、2-吡咯烷酮、P物質(zhì)、對(duì)乙酰氨基酚、LysoPC_20:1_11Z_、去氮芥、氯乙胺、四氫脫氧皮質(zhì)酮、赤蘚醇四硝酸酯、3-羥基丁酸、六氟異丙醇、鈮、N-乙酰鳥氨酸、賴氨酸、脫氧膽酸；降低的有13種：原黃素、葡萄糖6-磷酸、8-羥基韋拉平葡萄糖醛酸、二氨基庚二酸、S-3，4-二羥基丁酸、乙醇胺、葡萄糖基半乳糖基羥賴氨酸、焦磷酸法呢酯、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羥基苯甲酸、5-氟尿苷、壬酸、磺胺乙酰胺。

負(fù)離子模式下有19種差異代謝物，其中升高的有7種：膦甲酸、2-苯基-1，3-丙二醇單氨基甲酸酯、甜菜堿、rac-5，6-環(huán)氧-視黃酰-β-D-葡糖醛酸、乙酰膽甾醇葡萄糖醛酸苷、3-甲基-2-氧代戊酸、4-乙烯基苯酚硫酸鹽；降低的有12種：NNALN-葡萄糖醛酸、根皮素2_-O-葡糖苷酸、七氟烷、馬拉硫磷二羧酸、坎利酮、2-氧精氨酸、三氟乙酸、苯海拉明N-葡萄糖醛酸、O-去甲基曲馬多葡糖苷酸、4_-O-methyl-_-_-epicatechin-7-O-beta-glucuronide、DG_18:1_11Z_20:5_5Z，8Z，11Z，14Z，17Z_0:0、4_-O-methyl-_-_-epicatechin-3_-O-beta-glucuronide。

2.4.2 差異代謝物的代謝通路分析 利用MetaboAnalyst 5.0對(duì)在正、負(fù)離子模式下篩選出的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。依據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，匹配到了19條代謝通路，再以-log（P）＞0.5且通路影響因子（pathway impact）＞0.05篩選出5條代謝通路，分別為：牛磺酸和亞?；撬岽x，賴氨酸降解，淀粉和蔗糖代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，萜類骨架生物合成，見表1。

表1 篩選出的代謝通路及其相關(guān)信息Table 1 Screened metabolic pathways and related information

2.4.3 差異代謝物對(duì)MAP和SAP的鑒別診斷價(jià)值對(duì)篩選出來(lái)的50種差異代謝物進(jìn)行分析，篩選出其中ROC曲線下面積（AUC）＞0.9的差異代謝物共8種，其對(duì)MAP和SAP的鑒別診斷價(jià)值見圖4和表2。

圖4 篩選出的差異代謝物對(duì)MAP與SAP鑒別診斷價(jià)值的ROC曲線Figure 4 ROC curves of the differential diagnostic value of the differential metabolites screened for MAP and SAP

表2 差異代謝物對(duì)MAP與SAP的鑒別診斷價(jià)值Table 2 Differential diagnostic value of the differential metabolites screened for MAP and SAP

3 討論

本研究基于LC-MS技術(shù)對(duì)MAP和SAP患者的血清差異代謝物進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)了50種差異代謝物，

5條代謝通路，其中8種差異代謝物具有較高的鑒別診斷效能，與MAP相比，在SAP患者中表達(dá)升高的有：2-苯基-1，3-丙二醇單氨基甲酸酯、rac-5，6-環(huán)氧-視黃酰-β-D-葡萄糖醛酸、六氟異丙醇、赤蘚醇四硝酸酯、3-羥基丁酸、四氫脫氧皮質(zhì)酮；表達(dá)下調(diào)的有：苯海拉明N-葡萄糖醛酸、NNAL-N-葡萄糖醛酸。

XU等[9]通過(guò)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)MAP患者與正常人的血清差異代謝物進(jìn)行分析，篩選出了12種差異代謝物，其中辛酰膽堿的診斷效果最好，而本研究中MAP與SAP患者的差異代謝物中未發(fā)現(xiàn)膽堿類代謝物，提示膽堿類代謝物可能不是一個(gè)很好的鑒別MAP與SAP的差異代謝物。也有研究通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和隨機(jī)森林算法尋找膽汁性急性胰腺炎（BAP）、高脂血癥性急性胰腺炎（HLAP）和酒精性急性胰腺炎（AAP）的差異代謝物[10]，本研究所得結(jié)果與之相比，在AAP的差異代謝通路中也存在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路的異常，因此，過(guò)量飲酒可能通過(guò)這一條代謝通路導(dǎo)致AP進(jìn)一步向重癥化轉(zhuǎn)變。也有研究通過(guò)GC-MS分析AP患者與健康體檢者體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)3-羥基丁酸、磷酸、甘油、檸檬酸、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、十六酸和5-羥色胺等是可以幫助臨床診斷AP的潛在生物標(biāo)記物[11]；本研究發(fā)現(xiàn)，3-羥基丁酸在SAP患者中的表達(dá)明顯升高，SAP會(huì)導(dǎo)致患者組織和器官的進(jìn)一步損傷，甚至導(dǎo)致器官衰竭，對(duì)于胰腺腺泡細(xì)胞來(lái)說(shuō)，這種炎性反應(yīng)會(huì)損傷線粒體功能，使ATP的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致更多的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為酮體（乙酰乙酸、3-羥基丁酸和丙酮），從而使SAP患者中3-羥基丁酸水平升高[12]。

血清Ca2+的降低通常被認(rèn)為與胰腺壞死有關(guān)，持續(xù)的低鈣將導(dǎo)致患者出現(xiàn)多器官功能衰竭[13]。目前關(guān)于Ca2+在AP發(fā)病機(jī)制中作用的研究有很多，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載和線粒體損傷能夠影響胰腺腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞功能，是AP進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵致病步驟，細(xì)胞內(nèi)高濃度Ca2+能夠?qū)е乱认偌?xì)胞ATP產(chǎn)生障礙，使胰腺細(xì)胞大量壞死，而胰腺細(xì)胞壞死將進(jìn)一步導(dǎo)致胰蛋白酶的釋放，最終引起大范圍的胰腺炎癥[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，單氨基甲酸酯能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，通過(guò)阻斷神經(jīng)元中的T型Ca2+通道，防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+的過(guò)度聚集，從而起到保護(hù)神經(jīng)的作用[15]。目前，尚未見關(guān)于單氨基甲酸酯在胰腺細(xì)胞中作用的研究報(bào)道，在本研究中，SAP患者血清2-苯基-1，3-丙二醇單氨基甲酸酯的表達(dá)明顯升高，其是否也是通過(guò)該機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的過(guò)度聚集從而導(dǎo)致胰腺的炎癥尚需進(jìn)一步研究。

葡萄糖醛酸是葡萄糖的C-6羥基被氧化為羧基后形成的糖醛酸，葡萄糖醛酸通過(guò)葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成高度親水性的產(chǎn)物葡萄糖醛酸苷，葡萄糖醛酸苷通過(guò)膽汁或尿液排出[16]。在人體內(nèi)，多種內(nèi)源性物質(zhì)（如膽紅素）、藥物和其他外源性物質(zhì)（如環(huán)境毒素）通過(guò)與葡萄糖醛酸結(jié)合形成親水性的物質(zhì)從而更好地從體內(nèi)排除[17]。因此，葡萄糖醛酸化反應(yīng)是人類一種重要的防御機(jī)制，可以避免體內(nèi)出現(xiàn)有毒物質(zhì)的過(guò)度堆積。本研究表明，MAP與SAP患者的血清差異代謝物中，rac-5，6-環(huán)氧-視黃酰-β-D-葡萄糖醛酸、苯海拉明N-葡萄糖醛酸、NNAL-N-葡萄糖醛酸三種差異代謝物具有較高的鑒別診斷效能，其中rac-5，6-環(huán)氧-視黃酰-β-D-葡萄糖醛酸在SAP患者體內(nèi)水平明顯升高。

亞硝胺4（甲基亞硝胺）-1-（3-吡啶基）丁酮（NNK）是煙草中特有的導(dǎo)致肺癌的成分，在人體中，NNK可通過(guò)葡萄糖醛酸化反應(yīng)生成NNAL-N-葡萄糖醛酸，從而通過(guò)尿液排出[18]，一旦這個(gè)代謝途徑受到抑制，人體患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)將增大。有研究表明，細(xì)胞色素P450 2A6（CYP2A6）能夠催化NNK的代謝，從而降低肺癌的發(fā)病率[19]，也有研究表明，胰腺癌的發(fā)病與CYP2A6有關(guān)[20]。在SAP患者中，NNAL-N-葡萄糖醛酸表達(dá)下降，可能導(dǎo)致體內(nèi)有毒物質(zhì)如NNK的代謝障礙，有毒物質(zhì)在體內(nèi)大量堆積，從而進(jìn)一步損傷患者的肺和胰腺組織，使重癥患者出現(xiàn)更嚴(yán)重的臨床癥狀，以后有望通過(guò)對(duì)此機(jī)制的深入研究，為臨床早期診斷、治療胰腺炎提供新的思路和方法。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)MAP和SAP患者的血清差異代謝物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了50種差異代謝物，5條代謝通路，其中8種差異代謝物具有較高的鑒別診斷效能，可能是區(qū)別二者較好的潛在生物標(biāo)志物，后續(xù)可進(jìn)行深入研究，從而為AP的診斷和治療提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：黃湘平負(fù)責(zé)研究方案的設(shè)計(jì)，研究過(guò)程的實(shí)施，結(jié)果的分析，論文的撰寫；吳玲負(fù)責(zé)標(biāo)本的收集，標(biāo)本的前處理，論文的修訂；譚超超提出研究思路，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突