沈菲，蔣偉萍，梅小斌，韓一平，趙家義，樊劍，顧娟，沈雁紅，徐紅梅，張丹，門英，丁海光，陳彩萍，韓君華*

糖尿病腎病作為糖尿病血管并發(fā)癥中常見的一種類型，主要變化是起始于腎小球以及腎小管肥大的結構改變，同時伴隨著腎臟基底膜增厚以及系膜的擴張，最終會進展為腎小球硬化、腎間質纖維化以及腎小管萎縮等[1]。在全世界范圍內(nèi)糖尿病腎病是死亡率較高的疾病之一[2]。2016年的一項統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球超過4億人患有糖尿病，超30%的患者最終會演變?yōu)樘悄虿∧I病[3]，然而糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全明確，現(xiàn)有的醫(yī)療措施僅能夠延緩病情發(fā)展，無法治愈。

由人體腸道中的各類微生物菌落（真菌、細菌以及噬菌體等）所構成的共生環(huán)境即為腸道菌群，種類極其繁多，數(shù)量龐大[4-5]。細菌作為最多的微生物菌落，最常見的優(yōu)勢細菌是乳酸菌、雙歧桿菌以及擬桿菌等[6]。腸道是此類菌群的代謝和活動場地，因此其代謝活性以及組成成分、比例發(fā)生改變就會導致腸道菌群失調(diào)，內(nèi)環(huán)境失衡，繼而影響腸道功能[7-8]，同時也間接影響腸道外臟器（肝、腎等）的代謝活動。

近年研究顯示，腸道微生態(tài)結構和多樣性變化導致的菌群失調(diào)在糖尿病和慢性腎臟病中發(fā)揮著與疾病互相影響的作用[9]。一方面，細菌和細菌產(chǎn)物如脂多糖從內(nèi)臟易位到血液，通過增加腸道通透性引起2型糖尿病、慢性腎臟病和終末期腎臟病典型的低度炎癥。另一方面，腸道菌群在物種豐富度、多樣性、組成和功能方面的變化可能會通過代謝物的營養(yǎng)利用和合成變化對宿主產(chǎn)生影響[10]。益生菌通過抗氧化應激和抗炎途徑發(fā)揮對糖尿病和腎臟疾病的治療作用，而氧化應激、慢性低度炎癥在基礎層面影響著糖尿病腎病。本研究旨在探究糖尿病腎病患者的腸道菌群特殊變化，根據(jù)微生態(tài)失調(diào)情況選取合適的益生菌制劑進行干預，了解微生態(tài)制劑療效，從而闡明糖尿病腎病發(fā)病和進展過程中腸道菌群結構變化所發(fā)揮的作用，明確腸道菌群與糖尿病腎病之間的聯(lián)系，為社區(qū)糖尿病腎病患者腸道菌群失調(diào)的有效治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采用分層隨機抽樣的方式選取2019年在上海市楊浦區(qū)殷行社區(qū)衛(wèi)生服務中心就診的115例糖尿病腎病患者作為研究對象。根據(jù)1∶1比例平行對照設計試驗方案，設置顯著性水平（α）=0.05，置信區(qū)間（CI）=95%，采用雙側檢驗，結合計算公式并考慮臨床實踐中退出研究或失訪的可能性，設樣本量n=115。本研究經(jīng)上海市楊浦區(qū)殷行社區(qū)衛(wèi)生服務中心倫理委員會批準（倫理批號：2018-01），115例患者均簽署知情同意書。

納入標準：（1）符合糖尿病腎病診斷標準[11]；（2）年齡40～80周歲。排除標準：（1）特殊類型糖尿病以及妊娠期糖尿??；（2）研究開始前15 d以及研究期間出現(xiàn)腹痛、腹瀉等腸道疾?。唬?）研究開始前15 d以及研究期間有各類益生菌以及腸道抗生素服用史；（4）其他原因引起的繼發(fā)性腎臟疾病，如高血壓腎病、IgA腎病以及腎炎綜合征、腎病綜合征；（5）患者并發(fā)其他內(nèi)分泌性疾?。ㄈ缂谞钕俟δ芸哼M癥等）、惡性腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病等[12]；（6）患者并發(fā)糖尿病急性并發(fā)癥，如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病非酮癥性高滲性昏迷等。

1.2 相關定義及診斷標準

1.2.1 糖尿病 依據(jù)2019年美國糖尿病協(xié)會發(fā)布的糖尿病診斷標準[13]：（1）伴有糖尿病相關癥狀（多尿、多飲、多食以及體質量減輕），同時全天任一時間血糖≥ 11.1 mmol/L；（2）空腹血糖（FPG）≥ 7.0 mmol/L；（3）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）中2 h血糖≥11.1 mmol/L。以上3個標準中符合任一個即可診斷為糖尿病。

1.2.2 糖尿病腎病 依據(jù)《中國糖尿病腎臟疾病防治臨床指南（2019年版）》[11]，即由糖尿病引發(fā)的患者腎功能損傷，同時尿微量白蛋白與尿肌酐比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR）＞30 mg/g， 或 者患者的腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1，總持續(xù)時間超過 3 個月即可診斷為糖尿病腎病。

1.3 研究方法

1.3.1 一般資料 收集患者的一般資料，包括性別、年齡、體質指數(shù)（BMI）、早期糖尿病腎病比例（糖尿病腎病分期標準：早期指ACR為30～299 mg/g，中晚期指ACR ≥ 300 mg/g[14]）、糖尿病腎病病程。

1.3.2 實驗室檢查指標 采集患者清晨空腹外周靜脈血3～4 ml，并收集存放于無熱原的促凝管中，采血管做好相應標記[15]；分離血清，轉速4 000 r/min，時間5 min，分離后的血清采用EP管進行分裝（每管血清200μl左右），同時放置于-80 ℃的冰箱中低溫保存?zhèn)溆?。FPG、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、ACR以及胱抑素C（Cys-C）均采用全自動生化分析儀進行檢測；C反應蛋白（CRP）采用免疫比濁法檢測；腫瘤壞死因子α（TNF-α）以及白介素（IL）-1β采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測。利用腎臟病膳食改良試驗（MDRD）公式計算估算的腎小球濾過率（eGFR），eGFR=186×〔Scr（mmol/L）/88.4〕-1.154× 年齡（歲）-0.203×0.742（女）[11]。

1.3.3 細菌培養(yǎng) （1）細菌培養(yǎng)試劑：單原性培養(yǎng)基（賽默飛，500 ml/瓶）、冰醋酸（濟南鑫順化工有限公司，25 L/桶）、結晶紫（默克，25 g/瓶）、硫酸新霉素（默克，5 g/瓶）、迭氮鈉（捷世康，100 g/瓶）、卵黃液（環(huán)凱，5 ml/支）、布式肉湯（青島海博，250 g/瓶）。（2）細菌培養(yǎng)儀器：電子天平（上海精科天美，型號：JA2603B）、生物安全柜（賽默飛，型號：V147805）、恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛，型號：V252445）、厭氧培養(yǎng)箱（徠譜，型號：HYQX-I）、培養(yǎng)皿（NUNC，型號：150462）。（3）糞便樣本收集：樣本收集前一晚用75%乙醇浸泡收集瓶，經(jīng)0.9%氯化鈉溶液沖洗后分發(fā)至患者；患者取中段便置于收集瓶內(nèi)，確保收集瓶內(nèi)達到1/3容量；將每位患者的標本分為兩份，一份于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一份即刻做細菌培養(yǎng)[16]。（4）腸道細菌培養(yǎng)：將患者的糞便標本接種于雙歧桿苗、擬桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌及梭菌（均購自青島海博，250 g/瓶）的單原性培養(yǎng)基上。需氧菌于37 ℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72 h；厭氧菌于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為72 h[17]。結果計算以每克濕糞的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）的對數(shù)值（lg CFU/g）表示。

1.3.4 微生態(tài)制劑干預方法 均衡糖尿病腎病患者的年齡、性別、尿微量白蛋白和菌群變化情況，利用簡單隨機抽樣法將115例糖尿病腎病患者分為兩組，一組給予控制血糖和血壓、降脂等常規(guī)治療（對照組，n=57）；另一組除常規(guī)治療外還給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.5 g/片，國藥準字：S19980004，批號：201601077，用量：4片/次，2次/d）（治療組，n=58），兩組患者均治療8周。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 115例糖尿病腎病患者中男28例、女87例，平均年齡為（62.9±10.0）歲，糖尿病腎病病程為（14.3±7.1）年。對照組和治療組患者男性比例、年齡、BMI、早期糖尿病腎病比例、糖尿病腎病病程比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data of diabetic nephropathy patients with usual treatment， and those with treatment of microbiota-modulating agents

2.2 微生態(tài)制劑干預前后實驗室檢查指標比較 干預前，兩組患者各實驗室檢查指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，干預后治療組患者FPG、TG、BUN、Scr、ACR、Cys-C、CRP、IL-1β、TNF-α均降低，HDL、eGFR均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者微生態(tài)制劑干預前后實驗室檢查指標比較Table 2 Comparison of pre- and post-treatment laboratory test indices in diabetic nephropathy patients with usual treatment， and those with treatment of microbiota-modulating agents

2.3 微生態(tài)制劑干預前后腸道細菌培養(yǎng)結果比較 干預前，兩組患者各菌落數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預后，治療組患者腸球菌、腸桿菌菌落數(shù)低于對照組，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者微生態(tài)制劑干預前后腸道細菌培養(yǎng)結果比較〔M（P25，P75），lg CFU/g〕Table 3 Comparison of pre- and post-treatment bacterial culture results in diabetic nephropathy patients with usual treatment，and those with treatment of microbiota-modulating agents

3 討論

人體的腸道菌群在機體代謝活動中具有不可替代的作用，不僅參與腸道疾病的發(fā)生，同時還影響腸道外疾病的發(fā)展進程[18]。人體所需的維生素以及部分必需氨基酸就是由腸道內(nèi)無法消化吸收的多糖經(jīng)過腸道菌群轉化為單糖以及短鏈脂肪酸所提供，同時腸道菌群還可抑制病原微生物附著于腸道黏膜，激活補體旁路，中和微生物毒素，繼而調(diào)節(jié)機體免疫力[19-20]。腸道細菌是免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能的重要組成部分。腸道菌群的變化可能是許多炎性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素。生活方式的改變可能會改變腸道菌群組成比例，進而引發(fā)菌群失調(diào)。糖尿病腎病的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，可能系多因素參與，在一定的遺傳背景以及部分危險因素的共同作用下致病。本研究采用分層隨機抽樣的方式選取門診患者作為研究對象，研究微生態(tài)制劑改善腸道菌群對于糖尿病腎病患者的治療作用。

糖尿病腎病患者是否也存在腸道菌群失調(diào)的情況？部分學者認為，糖尿病腎病患者由于GFR的明顯下降，導致腸道的尿酸和草酸鹽無法正常排出體外并大量堆積于結腸段，繼而引起腸道內(nèi)環(huán)境紊亂、酸堿失衡，引發(fā)菌群結構改變，最終導致菌群失調(diào)[21-22]。此外，GFR下降所引起的代謝廢物累積會透過腸壁進入腸腔，影響腸道益生菌生活環(huán)境，益生菌數(shù)量下降導致腸道菌群失調(diào)。同時，在腸道菌群失調(diào)的環(huán)境下，微生物的有毒有害代謝產(chǎn)物在腸腔釋放、累積，透過腸腔壁吸收入血，加速GFR的降低，最終影響腎功能。對于糖尿病腎病患者，由于腸道菌群失調(diào)，腸道上皮細胞屏障功能消失[23]，腸道內(nèi)累積的大量尿素代謝產(chǎn)物如氨等會透過損壞的腸道屏障，繼而被吸收入血，隨血液循環(huán)至肝臟后，肝內(nèi)重新合成尿素，加重腎小球濾過負擔[24]。并且尿素代謝產(chǎn)物氨還可在腸道內(nèi)轉化為氫氧化銨，引起腸道pH值升高，腸道黏膜屏障功能進一步下降，腸腔內(nèi)各類微生物代謝毒素均可透過屏障進入血液循環(huán)，最終導致全身炎性反應。

本研究結果顯示，與對照組相比，經(jīng)過雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預后的治療組患者腸道中腸桿菌和腸球菌菌落數(shù)明顯下降，雙歧桿菌和乳酸桿菌菌落數(shù)明顯升高，可見腸道菌群失調(diào)程度明顯緩解，同時HDL、eGFR明顯升高，TG、BUN、Scr、ACR以及Cys-C等反映腎功能惡化的指標均明顯下降，可見患者腎功能有所恢復，最終菌群失調(diào)程度緩解的同時伴隨著患者腎功能的部分恢復，提示有效的微生態(tài)制劑利于調(diào)節(jié)腸道菌群，恢復菌群平衡，對于降低機體炎性因子水平具有重要作用。

脂多糖作為一種具有高度致炎性的G-菌細胞表面抗原，在體內(nèi)一般通過Toll樣受體2（TLR-2）以及受體4（TLR-4）介導炎性反應。TLR-2和TLR-4可激活核因子κB，繼而誘導機體內(nèi)促炎性細胞釋放IL-1以及TNF等炎性因子[25-26]，加劇全身炎性反應，促使腎功能進一步惡化，同時脂多糖引發(fā)的慢性炎癥還可促使胰島β細胞程序性凋亡，造成胰島素分泌不足，最終導致血糖調(diào)節(jié)功能進一步降低。YU等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠模型中，TLR-4在腎小球中的表達持續(xù)上調(diào)，血液中炎性因子IL水平明顯升高，伴隨尿白蛋白明顯增加，慢性炎癥加重，腎臟功能惡化。

綜上所述，腸道菌群失調(diào)與糖尿病腎病的進展具有緊密關聯(lián)，腸道菌群失調(diào)引發(fā)代謝性的炎性改變，影響GFR及腎功能，糾正腸道菌群失調(diào)可作為一項治療糖尿病腎病的新靶點[28]。合理應用益生菌、益生元等微生態(tài)制劑利于調(diào)節(jié)腸道的菌群環(huán)境，降低機體炎性反應，既能降糖調(diào)脂，又能減輕胰島素抵抗，對于糖尿病腎病的慢性炎癥具有積極治療作用[29]。

需要指出的是，雖然本研究顯示應用益生菌、益生元等微生態(tài)制劑可降糖調(diào)脂，減輕胰島素抵抗，對于糖尿病腎病的慢性炎癥具有治療意義，但是人體的腸道菌群本就是受到多種外界因素（如精神、壓力以及藥物）的影響，因此針對腸道菌群的研究設計仍存在一定的爭議；此外，本研究僅發(fā)現(xiàn)益生菌對于糖尿病腎病患者的腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用，但是具體是通過哪一條路徑或者是哪一種因子介導來發(fā)揮治療作用目前不得而知，同時腸道菌群種類繁多，在益生菌特定的治療劑量或者治療濃度方面仍存在一定的爭議，有待進一步研究驗證。

作者貢獻：沈菲、趙家義進行研究的設計與實施、撰寫論文初稿；樊劍進行統(tǒng)計分析；顧娟、沈雁紅、徐紅梅、張丹、門英、丁海光、陳彩萍進行病歷資料收集與整理、研究評估與方案實施、表格制作；梅小斌、韓一平、韓君華進行質量控制及論文修改、審校；蔣偉萍等所有作者確認了論文的最終稿；沈菲、韓君華對論文整體負責。

本文無利益沖突。