方會(huì)慧 ， 許元寶 張 菁 ， 劉笑芬

多重耐藥、廣泛耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和迅速傳播已成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，臨床可用的抗菌藥物有限。為有效控制多重耐藥、廣泛耐藥菌所致嚴(yán)重感染，防止耐藥性的進(jìn)一步產(chǎn)生，抗菌藥物聯(lián)合用藥成為一個(gè)重要的治療手段?？咕幬锫?lián)合用藥對(duì)多重耐藥菌的抗菌活性及協(xié)同作用可通過(guò)E試驗(yàn)，棋盤法、時(shí)間殺菌曲線等體外研究方法評(píng)估[1]，薈萃分析顯示以體外協(xié)同作用為導(dǎo)向的抗菌藥物聯(lián)合治療與生存率顯著相關(guān)[2]，體外研究發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用的聯(lián)合用藥可進(jìn)一步用于臨床研究。因此，本文對(duì)抗菌藥物聯(lián)合用藥體外研究方法的現(xiàn)狀及進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為多重耐藥、廣泛耐藥菌感染的聯(lián)合治療體外研究提供參考。

1 瓊脂擴(kuò)散法

瓊脂擴(kuò)散法包括紙片擴(kuò)散法和濃度梯度紙條擴(kuò)散法，又稱E試驗(yàn)。紙片擴(kuò)散法是將2種或2種以上含抗菌藥物紙片貼于均勻涂布菌液的平板表面，觀察抑菌圈的變化，示意如圖1。紙片擴(kuò)散法簡(jiǎn)單、易操作，但僅為定性研究。Stein等[3]采用紙片擴(kuò)散法研究美羅培南、替加環(huán)素及多黏菌素E之間的協(xié)同作用，篩選出具有增效作用的7株菌株和無(wú)增效作用的2株菌株。

圖1 紙片擴(kuò)散法

E試驗(yàn)一般用于微生物藥敏試驗(yàn)，用于測(cè)定兩藥的協(xié)同作用時(shí)，有兩種方法：①將2種E試驗(yàn)紙條組合交叉放在涂布細(xì)菌的瓊脂平板表面，根據(jù)相交紙條抑菌圈的最低抑菌濃度（MIC）來(lái)計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FICI），F(xiàn)ICI=MICA藥聯(lián)合/MICA藥單用+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單用。試驗(yàn)結(jié)果判斷 ：FICI≤0.5，兩藥有協(xié)同作用；0.5＜FICI＜1為相加作用；1≤FICI＜4為無(wú)關(guān)作用；FICI≥4為拮抗作用[4]，示意見(jiàn)圖2。②利用E試驗(yàn)法測(cè)定抗菌藥物A在含或不含抗菌藥物B（固定濃度）的細(xì)菌瓊脂平板中的MIC值變化。結(jié)果的判定：聯(lián)合用藥時(shí)A藥的MIC值降低1個(gè)稀釋度為無(wú)關(guān)，降低2個(gè)稀釋度為相加，降低3個(gè)稀釋度為協(xié)同[5]。E試驗(yàn)的缺點(diǎn)是成本較貴。

圖2 E試驗(yàn)交叉法

2 棋盤法

棋盤法（checkerboard assays）是研究體外協(xié)同作用最廣泛使用的方法之一，主要采用肉湯微量稀釋法測(cè)定單藥MIC，根據(jù)測(cè)定的MIC值上推2～4個(gè)和下推4～8個(gè)濃度梯度設(shè)定棋盤法中抗菌藥物的濃度范圍，兩種抗菌藥物按棋盤法設(shè)計(jì)的濃度梯度組合加入96孔微孔板中，24 h后觀察微孔中細(xì)菌的生長(zhǎng)，以微孔中培養(yǎng)基澄清的最低濃度為兩藥聯(lián)合MIC，計(jì)算FICI判斷協(xié)同作用，計(jì)算方法及結(jié)果解讀同E試驗(yàn)交叉法。棋盤法示意見(jiàn)圖3。近年來(lái)，“三相”及“四相”棋盤法可探討3種、4種藥物之間的劑量反應(yīng)關(guān)系[6-7]，Santos等[7]利用該方法考察了利奈唑胺、左氧氟沙星與異煙肼/利福平三藥聯(lián)合對(duì)10株耐藥結(jié)核分枝桿菌的協(xié)同作用，F(xiàn)ICI=(MICA藥聯(lián)合/MICA藥) + (MICB藥聯(lián)合/MICB藥) + (MICC藥聯(lián)合/MICC藥)，F(xiàn)ICI的最低值用于結(jié)果的判斷，F(xiàn)ICI≤0.75為協(xié)同作用；0.75＜FICI＜4為無(wú)關(guān)作用；FICI≥4為拮抗作用。但Stein等[3]在“三相”棋盤法中計(jì)算FICI時(shí)采用的是中位值而非最低值，結(jié)果的判斷認(rèn)為FICI≤0.8為協(xié)同作用。不同研究中3種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用判斷協(xié)同作用的FICI標(biāo)準(zhǔn)不同，可能影響協(xié)同作用的判斷，因此，有必要統(tǒng)一協(xié)同作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 棋盤法示意圖

E試驗(yàn)和棋盤法的優(yōu)點(diǎn)是研究方法簡(jiǎn)單，容易操作，但也存在很多的問(wèn)題：①M(fèi)IC測(cè)定方法不同。E試驗(yàn)和棋盤法協(xié)同作用的判斷依賴于MIC值的變化。肉湯微量稀釋法是測(cè)定抗菌藥物MIC的金標(biāo)準(zhǔn)，但不同體外研究中MIC的測(cè)定有瓊脂稀釋法、E試驗(yàn)等不同方法[3-4,8]，MIC可能存在誤差，因此不同體外研究中協(xié)同作用的結(jié)果可比性差；②抗菌藥物聯(lián)合用藥的殺菌活性被忽視，因此Gomara等[9]建議檢測(cè)抗菌藥物的最低殺菌濃度（MBC），計(jì)算部分殺菌濃度指數(shù)（fractional bactericidal concentration index，F(xiàn)BCI）代替 FICI作為抗菌協(xié)同作用的主要指標(biāo)，對(duì)于心內(nèi)膜炎、腦膜炎等嚴(yán)重感染具有重要意義。

3 時(shí)間殺菌曲線

時(shí)間殺菌曲線（time-kill assays）在新抗菌藥物體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究中應(yīng)用廣泛，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液（通常5×105CFU/mL）暴露于固定濃度的抗菌藥物中，考察一段時(shí)間內(nèi)菌落數(shù)的變化，當(dāng)24 h后菌落數(shù)下降≥ 3log10CFU/mL認(rèn)為有殺菌作用，下降≥2log10CFU/mL則認(rèn)為有抑菌作用。協(xié)同作用通常定義為與最有效的成分相比聯(lián)合用藥24 h內(nèi)菌落數(shù)下降≥2log10CFU/mL；當(dāng)菌落數(shù)下降＜2log10CFU/mL時(shí)為無(wú)關(guān)作用；當(dāng)菌落數(shù)升高≥2log10CFU/mL時(shí)考慮拮抗作用，時(shí)間殺菌曲線示意見(jiàn)圖4。有部分研究應(yīng)用殺菌曲線 下 面 積（area under the bacterial killing curve，AUBC）來(lái)判斷抗菌藥物聯(lián)合用藥的協(xié)同作用，AUBC通過(guò)梯形法計(jì)算時(shí)間殺菌曲線下0～24 h菌落數(shù)的變化，如果聯(lián)合用藥的AUBC低于殺菌活性最強(qiáng)的單一藥物（兩藥中AUBC較小的），則認(rèn)為該組合是有效的[10-11]。多項(xiàng)研究顯示時(shí)間殺菌曲線比E試驗(yàn)、棋盤法能檢測(cè)出更多的協(xié)同作用[12-14]。Pankey等[14]利用兩種不同的方法檢測(cè)多黏菌素B聯(lián)合利福平對(duì)14株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）的協(xié)同作用，E試驗(yàn)僅檢測(cè)出對(duì)3株細(xì)菌有協(xié)同作用，而時(shí)間殺菌曲線顯示利福平（藥物濃度為1MIC）聯(lián)合多黏菌素B（藥物濃度為1MIC、1/2MIC、1/4MIC）對(duì)100%菌株均有協(xié)同作用。

圖4 時(shí)間殺菌曲線示意圖

時(shí)間殺菌曲線還可探討抗菌藥物聯(lián)合用藥對(duì)生物膜的作用。Geladari等[15]建立了4株CRKP生物膜模型，測(cè)定多黏菌素E、利福平、美羅培南、慶大霉素、替加環(huán)素對(duì)生物膜的最低抑制濃 度（minimum biofilm inhibitory concentration，MBIC50，定義為至少破壞50%生物膜的最低抗菌藥物濃度）分別為64、8、＞256、12、8 mg/L，采用Bliss獨(dú)立模型分析顯示16～64 mg/L的多黏菌素E與利福平、美羅培南或替加環(huán)素聯(lián)合均可觀察到對(duì)生物膜的協(xié)同作用，協(xié)同作用最強(qiáng)的是多黏菌素E聯(lián)合利福平。這對(duì)存在生物膜感染（如假體關(guān)節(jié)感染、囊性肺纖維化、感染性心內(nèi)膜炎等）的治療具有重要意義。

時(shí)間殺菌曲線研究存在的主要問(wèn)題有：①大多數(shù)體外研究都是在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的（多數(shù)為24 h），但臨床治療持續(xù)時(shí)間通常要長(zhǎng)得多，在此期間細(xì)菌密度可能會(huì)異常升高（＞108CFU/mL)；②時(shí)間殺菌曲線的細(xì)菌接種量多為105～106CFU/mL，僅有少數(shù)時(shí)間殺菌曲線進(jìn)行了高接種量下殺菌作用的研究。有研究比較了常規(guī)接種量（105CFU/mL）和高接種量（107CFU/mL）下多黏菌素E聯(lián)合方案協(xié)同作用的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多黏菌素與亞胺培南、替加環(huán)素有協(xié)同作用，但均存在接種效應(yīng)[16-17]；③時(shí)間殺菌曲線結(jié)果難以向臨床轉(zhuǎn)化。時(shí)間殺菌曲線因細(xì)菌的接種菌量、藥物暴露時(shí)間的差異以及無(wú)法模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)抗菌藥物濃度，導(dǎo)致體外抗菌藥物協(xié)同作用很難直接向臨床轉(zhuǎn)化。Oliva等[18]回顧性分析32例產(chǎn)KPC酶的CRKP感染患者（包括血流感染、肺部及泌尿道感染等）應(yīng)用雙碳青霉烯類（18例）和雙碳青霉烯類聯(lián)合多黏菌素E（14例）兩種治療方案的臨床早期反應(yīng)和60 d的病死率，并對(duì)兩組治療方案中采集的病原菌進(jìn)行體外研究（時(shí)間殺菌曲線），體外研究結(jié)果顯示雙碳青霉烯類聯(lián)合多黏菌素具有更高的協(xié)同率，但臨床結(jié)局表明兩組在治療的早期反應(yīng)和60 d死亡率方面差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雙碳青霉烯類聯(lián)合多黏菌素E三聯(lián)療法的患者僅臨床反應(yīng)常比雙碳青霉烯類二聯(lián)療法更早。

4 體外藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）模型

體外PK/PD模型是指一類借助體外裝置來(lái)模擬藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程和藥效學(xué)的研究方法，可反映體內(nèi)抗菌藥物濃度變化情況下的殺菌作用[19]。體外PK/PD模型獲得的研究數(shù)據(jù)與人類和動(dòng)物有良好的相關(guān)性，在抗菌藥物體外研究與臨床應(yīng)用之間的銜接上發(fā)揮了重要作用。與動(dòng)物體內(nèi)感染模型相比，抗菌藥物體外PK/PD模型表現(xiàn)出以下優(yōu)點(diǎn)：①避免了人與動(dòng)物或動(dòng)物間種屬差異；②便于多點(diǎn)采樣及高劑量接種；③避免了菌種不易在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)的情況；④便于耐藥性研究等[20]。體外PK/PD模型包括一室模型和兩室模型，一室模型通常包括一個(gè)中央室、一個(gè)培養(yǎng)基池和一個(gè)廢液池，蠕動(dòng)泵將培養(yǎng)基泵入含有細(xì)菌和抗菌藥物的中央室來(lái)消除藥物，模擬體內(nèi)抗菌藥物藥動(dòng)學(xué)過(guò)程。該模型同時(shí)也引入透析膜能防止細(xì)菌濾出中央室，但細(xì)菌易堵塞過(guò)濾孔，影響抗菌藥物濃度變化[21]。二室模型的代表是中空纖維系統(tǒng)（hollow fiber infection model，HFIM）。HFIM主要由含有中空纖維的套筒組成，細(xì)菌被限制在作為感染部位的中空纖維筒中，模擬體內(nèi)感染，藥物和培養(yǎng)基可以自由通過(guò)，藥物暴露量根據(jù)藥動(dòng)學(xué)特征參數(shù)來(lái)模擬，該系統(tǒng)可以模擬具有相同或不同半衰期的一種或多種藥物的任何藥物濃度時(shí)間過(guò)程[22]。見(jiàn)圖5。

圖5 體外PK/PD模型示意圖

近年來(lái)，體外PK/PD模型已越來(lái)越多應(yīng)用于抗菌藥物聯(lián)合用藥研究，探討聯(lián)合用藥方案對(duì)耐藥突變菌感染的抑制作用或協(xié)同殺菌作用。體外PK/PD模型顯示多黏菌素E聯(lián)合美羅培南[23-24]、多立培南聯(lián)合多黏菌素E[25]、多黏菌素E聯(lián)合替加環(huán)素[24]、多黏菌素B/E聯(lián)合磷霉素[26-30]及三藥多黏菌素B、美羅培南、利福平聯(lián)合[23,31]等對(duì)CRKP感染均有協(xié)同作用，并可消除多黏菌素耐藥亞群的出現(xiàn)。此外，基于生物膜的體外PK/PD模型可用于研究聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)菌殺滅作用。Ribera等[32]利用“生物膜發(fā)生器”建立2株產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌的生物膜，研究美羅培南、多黏菌素E和兩藥聯(lián)合對(duì)已產(chǎn)生物膜的細(xì)菌殺滅作用，美羅培南單藥（Cmax=90 mg/L，t1/2=1 h，每8小時(shí)1次給藥）對(duì)2株形成生物膜的肺炎克雷伯菌仍有明顯的殺菌作用 [下降（3.5±0.8） log10CFU/mL]，聯(lián)合多黏菌素E并未增加殺菌活性[下降（3.2±0.4）log10CFU/mL]。

體外PK/PD模型在評(píng)估細(xì)菌耐藥性中發(fā)揮了重要作用。HFIM允許使用高接種量，這對(duì)耐藥性發(fā)展的研究尤其重要，因?yàn)楦呒?xì)菌載量（例如108CFU/mL）更容易檢測(cè)到耐藥突變體。HFIM可以在患者嚴(yán)重細(xì)菌感染的抗生素治療期間（5～14 d）評(píng)估聯(lián)合用藥對(duì)耐藥性預(yù)防作用。Bulman等[31]在體外PK/PD模型（HFIM）中評(píng)估大劑量多黏菌素B（劑量5.53 mg/kg，Cmax=6 mg/L）與利福平聯(lián)合治療時(shí)多黏菌素B耐藥亞群的生長(zhǎng)水平，10 d后發(fā)現(xiàn)菌株仍對(duì)多黏菌素B保持高度敏感（ MIC240h=0.5 mg/L）。

體外PK/PD研究中需要注意的問(wèn)題：①菌株的選擇：研究過(guò)程中一般應(yīng)包含適當(dāng)?shù)膮⒖季辏ㄈ鏏TCC菌株或敏感菌株）來(lái)證明可重復(fù)性。需評(píng)估細(xì)菌的耐藥機(jī)制，可以提供某一特定耐藥機(jī)制的影響；②藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，盡量選擇感染患者的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用于模擬，因?yàn)榻】凳茉囌吲c患者或重癥患者之間的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程差異非常大；③解釋體外PK/PD結(jié)果，考慮抗菌藥物是否快速殺菌以及判斷終點(diǎn)（如細(xì)菌不再生長(zhǎng)或減少2log10CFU/mL）與臨床最相關(guān)，如對(duì)于嚴(yán)重感染菌落降低2log10CFU/mL的時(shí)間點(diǎn)可能更重要。

5 其他方法

Mezzatesta等[33]報(bào)道了一種快速測(cè)定多種抗菌藥物組合殺菌作用的多重組合殺菌試驗(yàn)（multiple-combination bactericidal test，MCBT），在96孔板中加入抗菌藥物30 μL及菌液70 μL（0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?4 h后檢測(cè)小孔中的菌落數(shù)變化。21株多重耐藥的肺炎克雷伯菌（其中11株產(chǎn)KPC-3酶，6株 產(chǎn)KPC-2酶，2株 產(chǎn)VIM-1酶，2株產(chǎn)OXA-48酶）的聯(lián)合用藥：①美羅培南（120 mg/L）聯(lián)合厄他培南（70 mg/L）和/或多黏菌素E（20 mg/L）；②利福平（6 mg/L）聯(lián)合替加環(huán)素（0.9 mg/L）和/或多黏菌素E（20 mg/L）；③利福平（6 mg/L）聯(lián)合多黏菌素E（20 mg/L）。研究發(fā)現(xiàn)含有多黏菌素E的組合對(duì)所有細(xì)菌均有殺菌作用，與時(shí)間-殺菌曲線結(jié)果一致。MCBT是一種快速測(cè)試多種抗菌藥物組合對(duì)多重耐藥菌作用的方法，參照藥物能達(dá)到的血清藥物濃度設(shè)計(jì)藥物濃度，能同時(shí)進(jìn)行多達(dá)4種抗菌藥物的聯(lián)合。一項(xiàng)新加坡總醫(yī)院291例住院患者的回顧性研究證實(shí)，MCBT體外驗(yàn)證有殺菌作用的抗菌藥物聯(lián)合用藥（多黏菌素B聯(lián)合碳青霉烯類或氟喹諾酮類）治療廣泛耐藥革蘭陰性菌的感染相關(guān)死亡率為6.0%，而經(jīng)驗(yàn)性聯(lián)合用藥的死亡率為74.6%，死亡風(fēng)險(xiǎn)OR=5.75（95%CI=1.25-25.73）[34]。

個(gè)性化的藥物組合篩選可以鑒別出用于治療的分離株特異性組合。Sun等[35]開(kāi)發(fā)了自動(dòng)超高通量篩選技術(shù)結(jié)合細(xì)菌生長(zhǎng)檢測(cè)，對(duì)5 170種已批準(zhǔn)的藥物和其他化合物的快速篩選，篩選出25種具有抗肺炎克雷伯菌的活性（1 536孔板高通量篩選）化合物。研究進(jìn)一步結(jié)合抗菌藥物的臨床敏感性折點(diǎn)、可達(dá)到的血漿濃度、臨床不良反應(yīng)和作用機(jī)制來(lái)確定最佳的聯(lián)合用藥方法，鑒定出3組3種藥物組合（多黏菌素E +金諾芬+頭孢他啶、多黏菌素E +金諾芬+利福平、利福平+多黏菌素E +亞胺培南）對(duì)10株多重耐藥臨床分離株具有廣譜抗菌活性。該方法在臨床應(yīng)用中也得到進(jìn)一步證實(shí)，1例重癥感染患者血液中分離出3株多重耐藥的革蘭陰性菌，對(duì)8種藥物組成的14種兩藥、三藥和四藥聯(lián)合用藥方案進(jìn)行高通量篩選，慶大霉素+多黏菌素E+利福平體外抑菌率＞90%，其他方案多黏菌素E+亞胺培南+利福平，多黏菌素E+美羅培南+替加環(huán)素抑菌率54%～90%，多黏菌素E+美羅培南+替加環(huán)素+頭孢他啶，多黏菌素E+美羅培南+替加環(huán)素+利福平抑菌率22%～83%，選擇協(xié)同作用最佳的聯(lián)合方案（慶大霉素+多黏菌素E+利福平），調(diào)整治療后取得了良好的臨床療效[36]。因此，高通量藥物組合篩選有助于臨床醫(yī)師在有限的時(shí)間內(nèi)從大量的藥物組合中尋找合適的聯(lián)合方案控制嚴(yán)重感染。

多重耐藥菌感染的聯(lián)合治療目前已引起廣泛關(guān)注，但體外抗菌藥物聯(lián)合用藥協(xié)同作用的研究方法存在一定的復(fù)雜性、技術(shù)問(wèn)題及結(jié)果解釋的差異性，體外研究與臨床治療有效率有一定的差異。因此，建議利用體外聯(lián)合用藥的協(xié)同作用數(shù)據(jù)進(jìn)行前瞻性臨床試驗(yàn)來(lái)提高多重耐藥菌感染臨床治療效果。