許沁宇 劉帛嶼 喻楊樂夫 王軍 王成輝

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306)

體色是一個(gè)重要的生物學(xué)性狀，在動(dòng)物的偽裝、生存、求偶、繁衍、生殖等生命活動(dòng)中起著重要的作用[1]。魚類體色是最為豐富的表型性狀和重要的種質(zhì)特征之一，是研究性狀遺傳規(guī)律和決定基礎(chǔ)的良好材料[2]。甌江彩鯉(Cyprinuscarpiovar.color)是一種主要分布于浙江省甌江流域的兼具食用和觀賞價(jià)值的魚類[3]，因具有體色豐富、肉質(zhì)鮮嫩等特點(diǎn)而被推廣至全國(guó)多地養(yǎng)殖。上海海洋大學(xué)自1999年開展甌江彩鯉的種質(zhì)研究和人工選育以來，已獲得5種不同的體色純合度較高的選育群體，為研究體色遺傳基礎(chǔ)和機(jī)制提供了豐富的素材。

清道夫受體(scavenger receptor，SR)是一種細(xì)胞表面糖蛋白，具有廣泛的配體識(shí)別譜[4-6]，因其可以與多種配體結(jié)合，并參與機(jī)體的免疫系統(tǒng)，故而被命名為清道夫受體。其中，B族I型清道夫受體(SR-BI/Scarb1)是第1個(gè)在分子水平上得到證實(shí)的高密度脂蛋白(HDL)受體，參與并介導(dǎo)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，并在動(dòng)物體中發(fā)揮多種重要的生理作用[7]。Du等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Scarb1基因在甌江彩鯉紅色體色的形成過程中起著重要的調(diào)控作用，在敲除全紅體色甌江彩鯉的Scarb1基因后，發(fā)現(xiàn)嵌合體(F0)呈現(xiàn)出體表紅色皮膚斷裂、紅色區(qū)域大范圍褪色成白色的現(xiàn)象，且白色皮膚組織的類胡蘿卜素含量顯著降低?？梢?，Scarb1基因是通過介導(dǎo)類胡蘿卜素的含量來影響魚類體色表型的。

近幾年，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對(duì)甌江彩鯉的多個(gè)體色相關(guān)基因進(jìn)行了敲除，并在敲除基因的F0個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了大量的體色變異個(gè)體[9-12]。由于甌江彩鯉的性成熟時(shí)間較長(zhǎng)，目前尚未對(duì)這些敲除體自交子代的體色表型變化開展研究。本研究以敲除Scarb1基因的甌江彩鯉敲除體自交繁育獲得的F1樣本為對(duì)象，觀察和比較基因敲除型和野生型全紅和粉玉體色個(gè)體的體表色素細(xì)胞形態(tài)和體內(nèi)類胡蘿卜素含量變化，以期了解基因敲除體在自交繁育過程中的體色遺傳和變異情況，為研究魚類的體色遺傳基礎(chǔ)和機(jī)制提供資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年，在上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)試驗(yàn)站(上海市浦東新區(qū)新場(chǎng)鎮(zhèn))，取甌江彩鯉“龍申1號(hào)”的“全紅”選育系個(gè)體，應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Scarb1基因，獲得了敲除型F0。2020年對(duì)敲除型F0進(jìn)行自繁，獲得敲除型F1。本研究選用的試驗(yàn)魚為敲除型F1的2齡全紅和粉玉個(gè)體，相應(yīng)的對(duì)照組(野生型)為甌江彩鯉“龍申1號(hào)”F10的2齡全紅和粉玉個(gè)體。每組試驗(yàn)魚2種體色各3尾，體質(zhì)量為200～250 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鱗片色素細(xì)胞觀察

將試驗(yàn)魚體表的黏液擦除干凈后，用干凈鑷子于魚體背鰭之下、側(cè)線鱗之上的中間位置取鱗片3～5片，置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)中暫存。觀察時(shí)，按照魚鱗正常生長(zhǎng)朝向，將其置于經(jīng)無水乙醇消毒過的載玻片上，用光學(xué)顯微鏡觀察色素細(xì)胞的分布和形態(tài)，并用成像系統(tǒng)拍照。然后，參照馮彩等[13]的試驗(yàn)方法，用小刀輕輕刮去鱗片表層膜，觀察鱗片上色素細(xì)胞的層次分布。

1.2.2 體內(nèi)類胡蘿卜素含量測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)測(cè)定試驗(yàn)魚體內(nèi)的類胡蘿卜素含量。分別取各試驗(yàn)魚側(cè)線鱗以上的皮膚和肌肉，以及腸道、鰭條、眼睛及血液等組織，加入適量的PBS溶液進(jìn)行勻漿后，以4 000 r/min的速度離心15 min，取上清液作為檢測(cè)樣品。分別準(zhǔn)備空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，將類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別進(jìn)行5倍梯度稀釋，加入包被酶標(biāo)板，封板37 ℃溫育30 min。溫育結(jié)束后，棄上清液,加入洗滌液洗滌5次并晾干，再加入酶標(biāo)試劑50 μL，于37 ℃下反應(yīng)30 min。再加入顯色液，于37 ℃條件下顯色反應(yīng)10 min后加入終止液，在15 min內(nèi)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD值)，然后計(jì)算出各組織中的類胡蘿卜素含量。

2 結(jié)果

2.1 鱗片色素細(xì)胞觀察

在光學(xué)顯微鏡下，野生型全紅個(gè)體(W-WR)鱗片上存在大量的黃色素細(xì)胞和少量紅色素細(xì)胞。其中黃色素細(xì)胞均勻分布，在10倍鏡下單個(gè)視野觀察到的細(xì)胞數(shù)為56～66個(gè)，直徑在30 μm左右，細(xì)胞邊緣呈樹突狀，多個(gè)細(xì)胞的樹突狀結(jié)構(gòu)連接在一起呈網(wǎng)絡(luò)狀分布。紅色素細(xì)胞呈團(tuán)狀，直徑在40 μm左右，但數(shù)量稀少，呈離散型分布在鱗片上。敲除型F1全紅個(gè)體(M-WR)鱗片上黃色素細(xì)胞的分布位置、密集程度和形態(tài)大小與野生型相似，單個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)為59～71個(gè)，但黃色素細(xì)胞的顏色較野生型淺，且未觀察到紅色素細(xì)胞(見圖1)。

注：圖中Ery為紅色素細(xì)胞，Xan為黃色素細(xì)胞。圖1 野生型和敲除型全紅體色甌江彩鯉鱗片上的色素細(xì)胞(10倍鏡)

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，野生型全紅體色的甌江彩鯉，鱗片上的黃色素細(xì)胞內(nèi)含有明顯的細(xì)胞核和大量直徑1～2 μm的黃色素小泡，色素小泡聚集在細(xì)胞主體部分，呈深黃色；紅色素細(xì)胞則由許多紅色的色素小泡聚集而成，色素小泡直徑也是1～2 μm，呈團(tuán)狀分布，但沒有觀察到細(xì)胞核。敲除型全紅體色甌江彩鯉，其鱗片上黃色素細(xì)胞中的色素小泡在整個(gè)細(xì)胞中分布較均勻，色素小泡的直徑與野生型的相似，但其分布較野生型稀疏，整體呈現(xiàn)淺黃色(見圖2)。

注：圖中Ery為紅色素細(xì)胞，Xan為黃色素細(xì)胞；Iri為虹彩細(xì)胞。圖2 野生型和敲除型全紅體色甌江彩鯉鱗片上的色素細(xì)胞(100倍鏡)

在野生型粉玉個(gè)體(W-WW)和敲除型粉玉個(gè)體(M-WW)鱗片上均僅觀察到密集排列、呈短棒狀的虹彩細(xì)胞，其長(zhǎng)度為10 μm左右，在自然光下反射出藍(lán)紫色的光澤。野生型和敲除型虹彩細(xì)胞的形態(tài)和大小無明顯差異(見圖3)。

注： 圖中Iri為虹彩細(xì)胞。圖3 野生型和敲除型粉玉體色甌江彩鯉鱗片上的色素細(xì)胞(10倍鏡)

2.2 鱗片色素細(xì)胞分層觀察

根據(jù)觀察，甌江彩鯉鱗片的下層(靠近皮膚組織的一側(cè))均分布著密集排列的虹彩細(xì)胞。虹彩細(xì)胞中含有反射小板，在自然光下呈現(xiàn)出藍(lán)紫色的光澤。虹彩細(xì)胞層之上的色素細(xì)胞根據(jù)不同的體色而有所不同。野生型全紅個(gè)體鱗片的虹彩細(xì)胞層之上含有紅色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞。敲除型全紅個(gè)體鱗片的虹彩細(xì)胞層之上有均勻分布的黃色素細(xì)胞，而未見紅色素細(xì)胞。敲除型和野生型粉玉個(gè)體的鱗片上均只有虹彩細(xì)胞，未見黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞分布(見表1)。

表1 野生型和敲除型兩種體色甌江彩鯉的鱗片色素細(xì)胞分層情況

2.3 類胡蘿卜素含量測(cè)定

注：數(shù)據(jù)柱上標(biāo)有不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖4 野生型和敲除型兩種體色甌江彩鯉的類胡蘿卜素含量變化

野生型和敲除型全紅、粉玉體色甌江彩鯉體內(nèi)不同組織的類胡蘿卜素含量存在一定差異。在腸道和肌肉組織中，野生型全紅個(gè)體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型全紅個(gè)體(P<0.05)，野生型粉玉個(gè)體的類胡蘿卜素含量也顯著高于敲除型粉玉個(gè)體(P<0.05)。在皮膚組織中，野生型全紅個(gè)體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型全紅個(gè)體(P<0.05)，但野生型粉玉個(gè)體的類胡蘿卜素含量與敲除型粉玉個(gè)體差異不顯著(P>0.05)。在鰭條組織中，野生型全紅個(gè)體的類胡蘿卜素含量與敲除型全紅個(gè)體差異不顯著(P>0.05)，而野生型粉玉個(gè)體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型粉玉個(gè)體(P<0.05)。在血漿中，野生型全紅個(gè)體的類胡蘿卜素含量顯著高于敲除型全紅個(gè)體(P<0.05)，但野生型粉玉個(gè)體的類胡蘿卜素含量與敲除型粉玉個(gè)體差異不顯著(P>0.05)。在眼睛中，野生型全紅和粉玉個(gè)體的類胡蘿卜素含量與敲除型全紅和粉玉個(gè)體的差異均不顯著(P>0.05)(見圖4)。

整體來看，野生型全紅個(gè)體腸道、血漿、肌肉和皮膚中的類胡蘿卜素含量均顯著高于敲除型全紅個(gè)體(P<0.05)；野生型粉玉個(gè)體腸道、肌肉和鰭條組織中的類胡蘿卜素含量也顯著高于敲除型粉玉個(gè)體(P<0.05)。

3 討論

由于Scarb1基因?qū)τ诋T江彩鯉紅、白體色的形成有一定影響，因此，野生型和敲除型甌江彩鯉的體色存在一定的差異。本研究中，在野生型全紅個(gè)體的鱗片上觀察到由紅色素小泡聚集而形成的、呈團(tuán)狀離散分布的紅色素細(xì)胞，以及由黃色素小泡聚集而成的樹突狀黃色素細(xì)胞，且因黃色素小泡較密集而呈現(xiàn)深黃色。敲除型全紅個(gè)體的鱗片上只有黃色素細(xì)胞，且其中色素小泡的分布較野生型的稀疏，黃色素細(xì)胞整體呈現(xiàn)出淡黃色。造成這種現(xiàn)象的原因，可能是在Scarb1基因敲除后，甌江彩鯉對(duì)類胡蘿卜素的吸收利用效率降低，從而影響了紅色素細(xì)胞的形成，并且可能對(duì)黃色素細(xì)胞中黃色素小泡的數(shù)量也產(chǎn)生了一定的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-430b會(huì)抑制錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)體內(nèi)Scarb1基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致錦鯉體表著色受到影響[14-15]。外源性睪丸酮會(huì)抑制斑馬雀體內(nèi)類胡蘿卜素循環(huán)過程，使其紅色喙部發(fā)生褪色[16]。Toomey等[17]在金絲雀白色突變體的研究中也發(fā)現(xiàn)，Scarb1是鳥類類胡蘿卜素著色表達(dá)的重要基因。以上研究結(jié)果均表明，Scarb1基因在多種動(dòng)物體內(nèi)影響了類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和沉積等過程。

類胡蘿卜素是對(duì)魚類體色著色影響非常大的一類色素，能夠在動(dòng)物體表沉積，從而顯示出紅、橙、黃等一系列顏色。但是包括魚類在內(nèi)的多種生物自身并不能合成類胡蘿卜素，只能通過從外界食物中攝取，且經(jīng)過吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化等一系列過程才能作用于體表著色[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，腸道和肌肉組織中的類胡蘿卜素含量在野生型和敲除型甌江彩鯉個(gè)體之間存在顯著差異(P<0.05)。由于類胡蘿卜素主要在胃腸道中被生物體吸收和利用[18-19]，因此，敲除Scarb1基因?qū)ΞT江彩鯉攝取類胡蘿卜素產(chǎn)生了較大影響，導(dǎo)致魚體攝入的類胡蘿卜素總量減少，進(jìn)而造成肌肉中的色素沉積量也有所降低。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，甌江彩鯉的皮膚也是類胡蘿卜素沉積的重要部位，尤其在全紅和粉玉個(gè)體的皮膚中，類胡蘿卜素含量存在顯著差異，這與本研究的結(jié)果是一致的。以上研究結(jié)果表明，由于Scarb1基因敲除表型向子代遺傳，影響了子代對(duì)類胡蘿卜素等的利用，導(dǎo)致其體色也發(fā)生了相應(yīng)的變化。