傅昭粵，沈娛汀，李 娟，王 寧，方 亮，陳麗華

(空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

戰(zhàn)斗機(jī)在高速飛行過程中，由于飛行速度和方向發(fā)生改變，會產(chǎn)生加速度作用。如飛機(jī)俯沖改出時，飛行員可受到由足向頭的持續(xù)性正加速度(positive acceleration，+Gz)作用[1-2]。現(xiàn)代戰(zhàn)斗機(jī)在飛行過程中能產(chǎn)生持續(xù)時間長達(dá)45 s，以及高達(dá)6 G/s的加速度增長率，在此作用下飛行員會受到高達(dá)+9 Gz的重復(fù)暴露[3-5]。因此，隨著現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機(jī)的列裝，航空環(huán)境對飛行員的影響不容小覷，其持續(xù)性+Gz所引起的應(yīng)激會導(dǎo)致飛行員身體機(jī)能和作業(yè)效能發(fā)生不同程度的變化[6-8]。在高+Gz的作用下，飛行員的免疫系統(tǒng)也會發(fā)生許多變化。既往研究發(fā)現(xiàn)，在+Gz作用下，CD4+T細(xì)胞亞群比例會發(fā)生改變[9]，提示+Gz可能會影響免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[10-11]。CD4+T細(xì)胞是一個異質(zhì)性群體，根據(jù)其細(xì)胞膜標(biāo)記分子、分泌的細(xì)胞因子、表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和功能的不同可分為Th1、Th2、Th9、Th17、濾泡輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T(regulatory T, Treg)細(xì)胞等亞群[12]。既往關(guān)于+Gz對CD4+T細(xì)胞影響的研究并不多見[13]，關(guān)于高+Gz暴露對Treg細(xì)胞影響的研究更是少有報道。

鑒于此，本研究在成功建立+15 Gz重復(fù)暴露7 d小鼠模型的基礎(chǔ)上，初步探討高+Gz重復(fù)暴露下小鼠免疫系統(tǒng)中CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的變化，為后續(xù)進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)選用10只6～8周齡C57BL/6雄性小鼠，平均體質(zhì)量為20 g，均為SPF級。將小鼠隨機(jī)分為+15 Gz組(+15 Gz，15 min/d，7 d)和對照組(0 Gz，15 min/d，7 d)，每組5只。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理委員會審批通過(許可證號：20180101)。

1.2 方法

1.2.1 +Gz暴露 通過動物離心機(jī)構(gòu)建+15 Gz重復(fù)暴露7 d小鼠模型[14]。通過小鼠固定器將小鼠水平固定于離心機(jī)的轉(zhuǎn)臂上，頭部面向離心機(jī)轉(zhuǎn)臂軸心。+15 Gz組小鼠重復(fù)暴露于+15 Gz，15 min/d(峰值作用時間)，共持續(xù)7 d。對照組小鼠僅放置于固定器中，不進(jìn)行+Gz暴露。小鼠重復(fù)暴露7 d后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 脾臟細(xì)胞的提取及單細(xì)胞懸液的制備 45 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，采用頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠浸泡于750 mL/L乙醇5 min后，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺。從小鼠左側(cè)腹部中部剪開皮膚，暴露腹壁，并解剖分離小鼠脾臟。用剪刀將組織剪碎，加入5 mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液，用研磨棒研磨至沒有明顯紅色塊狀物。將研磨后的脾臟細(xì)胞收集于離心管中，液面上加0.5～1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，800g離心30 min(設(shè)置離心機(jī)剎車速度為0檔)。離心后吸取白膜層，加10 mL PBS重懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用細(xì)胞染色緩沖液重懸后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，等待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 外周血單細(xì)胞懸液制備 45 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，進(jìn)行眼球取血。收集小鼠外周血于2 mL EP管中，離心，棄上清。加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解5 min，加入10 mL PBS中和，300g離心5 min后棄上清。用細(xì)胞染色緩沖液重懸脾臟細(xì)胞后計(jì)數(shù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 分別調(diào)整脾臟和外周血單細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度至5×109～1×1010個/L，轉(zhuǎn)移至對應(yīng)流式管中。通過Percp標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體(0.25 μg，100432；Biolegend，美國)、PE標(biāo)記的抗小鼠CD25抗體(0.25 μg，113704；Biolegend，美國)以及Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗小鼠Foxp3抗體(0.25 μg，126406；Biolegend，美國)確定是否為Treg細(xì)胞，對照管加入相應(yīng)的同型對照抗體(0.25 μg，400630，400508，400625；Biolegend，美國)。通過APC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體(0.25 μg，100516；Biolegend，美國)、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD49b抗體(0.25 μg，103504；Biolegend，美國)和PE標(biāo)記的抗小鼠LAG-3抗體(0.25 μg，125208；Biolegend，美國)確定是否為1型調(diào)節(jié)性T(type 1 T regulatory,Tr1)細(xì)胞。對照管加入相對應(yīng)的同型對照抗體(0.25 μg，400512，400906，400408；Biolegend，美國)。4 ℃避光孵育30 min，加入2 mL流式洗液，清洗2次后棄上清。200～400 μL流式洗液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 +15 Gz暴露對小鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞的影響

在小鼠完成+15 Gz重復(fù)暴露7 d后，制備其脾臟單細(xì)胞懸液，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，+15 Gz組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量變化均無顯著差異(圖1)。以上結(jié)果證明，+15 Gz重復(fù)暴露7 d并未引起脾臟CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量的改變。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的代表圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測+15 Gz組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的代表圖；C：對照組和+15 Gz組脾臟CD4+T細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖；D：對照組和+15 Gz組脾臟CD4+T細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖。

2.2 +15 Gz暴露對小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的影響

為研究+15 Gz重復(fù)暴露對小鼠外周血CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量的影響，取+15 Gz重復(fù)暴露7 d后小鼠的外周血，制備單細(xì)胞懸液，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。對照組和+15 Gz組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞流式檢測代表圖如圖2A～B所示。結(jié)果顯示，對照組CD4+T細(xì)胞比例平均值為15.41%，+15 Gz組CD4+T細(xì)胞比例平均值為18.80%(圖2C)，對照組CD4+T細(xì)胞數(shù)量平均值為3 950，+15 Gz組CD4+T細(xì)胞數(shù)量平均值為6 991(圖2D)。+15 Gz暴露后小鼠外周血CD4+T細(xì)胞所占比例較對照組有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而+15 Gz暴露后小鼠外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量相比對照組顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，+15 Gz重復(fù)暴露7 d顯著上調(diào)外周血CD4+T細(xì)胞的數(shù)量。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的代表圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測+15 Gz組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的代表圖；C：對照組和+15 Gz組外周血CD4+T細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖；D：對照組和+15 Gz組外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖(aP<0.05)。

2.3 +15 Gz暴露對小鼠脾臟Treg細(xì)胞的影響

Treg細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的亞群之一，在免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及自身免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用。因此，我們進(jìn)一步探究+15 Gz重復(fù)暴露7 d后小鼠脾臟Treg細(xì)胞的變化情況。對照組和+15 Gz組小鼠脾臟Treg細(xì)胞流式檢測代表圖如圖3A～B所示。結(jié)果顯示，對照組和+15 Gz組小鼠脾臟Treg細(xì)胞比例平均值分別為12.95%和12.40%(圖3C)，脾臟Treg細(xì)胞數(shù)量平均值分別為2 482和2 497(圖3D)，兩組小鼠脾臟Treg細(xì)胞比例和數(shù)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組小鼠脾臟Treg細(xì)胞的代表圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測+15 Gz組小鼠脾臟Treg細(xì)胞的代表圖；C：對照組和+15 Gz組脾臟Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖；D：對照組和+15 Gz組脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖。

2.4 +15 Gz暴露對小鼠外周血Treg細(xì)胞的影響

為進(jìn)一步探討+15 Gz重復(fù)暴露是否影響外周血Treg細(xì)胞的比例和數(shù)量，在完成+15 Gz暴露7 d后，獲取小鼠外周血并制備單細(xì)胞懸液，通過CD25和Foxp3雙陽性表達(dá)來確定Treg細(xì)胞。對照組和+15 Gz組小鼠外周血Treg細(xì)胞流式代表圖如圖4A～B所示。結(jié)果顯示，相比對照組，+15 Gz組外周血CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例顯著下降(P<0.05)，但數(shù)量無顯著變化。以上結(jié)果表明，+15 Gz暴露顯著下調(diào)小鼠外周血CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組小鼠外周血CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的代表圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測+15 Gz組小鼠外周血CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的代表圖；C：對照組和+15 Gz組外周血CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖(aP<0.05)；D：對照組和+15 Gz組外周血CD4+ T細(xì)胞中Treg細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖。

2.5 +15 Gz暴露對小鼠脾臟Tr1細(xì)胞的影響

Tr1細(xì)胞是2004年發(fā)現(xiàn)的一種重要的Treg細(xì)胞亞群，其表型是CD4+LAG-3+CD49b+，能分泌大量IL-10，同時具有免疫抑制作用，因而在免疫穩(wěn)態(tài)維持、移植耐受等中發(fā)揮重要作用[15]。為進(jìn)一步深入研究+Gz是否影響Tr1細(xì)胞的比例和數(shù)量，在+15 Gz重復(fù)暴露7 d后，獲取小鼠脾臟并制備單細(xì)胞懸液，通過CD49b和LAG-3雙陽性表達(dá)來確定CD4+T細(xì)胞中的Tr1細(xì)胞亞群(圖5A～B)。結(jié)果顯示，兩組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Tr1細(xì)胞的比例和數(shù)量雖有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5C～D)，表明+15 Gz對于脾臟CD4+T細(xì)胞中Tr1細(xì)胞亞群的比例和數(shù)量無顯著影響。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組小鼠脾臟CD4+ T細(xì)胞中Tr1細(xì)胞的代表圖；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測+15 Gz組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Tr1細(xì)胞的代表圖；C：對照組和+15 Gz組脾臟CD4+ T細(xì)胞中Tr1細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖；D：對照組和+15 Gz組脾臟CD4+T細(xì)胞中Tr1細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖。

3 討論

盡管許多研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的+Gz暴露會對飛行員的心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌肉系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生影響[16-18]，但關(guān)于+Gz對免疫系統(tǒng)影響的研究并不全面，且+Gz影響CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量變化的研究報道也并不一致[10,13]。CD4+T細(xì)胞，又稱為輔助性T細(xì)胞，通過協(xié)調(diào)其他免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞的功能在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[19]。CD4+T細(xì)胞是包含多種細(xì)胞亞群的異質(zhì)性細(xì)胞群體，其中的Treg細(xì)胞盡管所占比例很低，但其可通過抑制效應(yīng)細(xì)胞的過度應(yīng)答維持免疫耐受，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[20-21]。因此，本研究對+15 Gz暴露后小鼠脾臟和外周血中CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例和數(shù)量的變化進(jìn)行了初步的探究。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)+15 Gz重復(fù)暴露7 d后小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例和數(shù)量無顯著變化，但+15 Gz重復(fù)暴露可顯著升高外周血CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，盡管+15 Gz組外周血CD4+T細(xì)胞比例有所上調(diào)，但由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，每組小鼠數(shù)量較少，故無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有文獻(xiàn)報道，+15 Gz的重復(fù)暴露在小鼠體內(nèi)形成應(yīng)激的生理環(huán)境，胸腺等中樞免疫器官中的T細(xì)胞進(jìn)入外周循環(huán)，導(dǎo)致外周血CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量上調(diào)[22]；而外周血中Treg細(xì)胞所占比例較低，僅占3%～5%[23]，外周血CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量的上調(diào)使得Treg細(xì)胞的比例相對下調(diào)。此外，應(yīng)激條件可導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞中的Th1細(xì)胞比例上調(diào)[24]，這也可能是外周血中Treg細(xì)胞比例相對減少的原因之一。脾臟作為外周免疫器官，為成熟淋巴細(xì)胞定居的場所。盡管+15 Gz在小鼠體內(nèi)形成應(yīng)激的生理環(huán)境，但7 d的暴露時間較短，T細(xì)胞發(fā)育成熟后通過外周循環(huán)到達(dá)脾臟的時間較長[25]，因此所檢測出的脾臟CD4+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞、Tr1細(xì)胞均無顯著變化。后續(xù)我們將擴(kuò)大每組樣本數(shù)量并延長暴露時間，以進(jìn)一步研究+15 Gz重復(fù)暴露對脾臟CD4+T細(xì)胞及其亞群變化的影響。Tr1細(xì)胞最早于1997年由Roncarolo研究小組明確提出，是CD4+Foxp3-的T細(xì)胞(顯著區(qū)別于天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)，能夠分泌大量IL-10[26]。2013年，該研究小組的GAGLIANI等[27]進(jìn)一步證實(shí)Tr1細(xì)胞的表型是CD4+CD49b+LAG-3+CD226+，其中CD4、CD49b和淋巴細(xì)胞活化基因-3等分子穩(wěn)定表達(dá)在Tr1細(xì)胞表面，而CD226分子的表達(dá)水平則隨Tr1細(xì)胞功能狀態(tài)不同而發(fā)生變化。Tr1細(xì)胞表型的確定不僅能夠用于分離體外培養(yǎng)的Tr1細(xì)胞，還可以用于追蹤同種異體造血干細(xì)胞移植耐受患者外周血中以及其他免疫性疾病患者體內(nèi)的Tr1細(xì)胞，更重要的是有助于進(jìn)一步研究Tr1細(xì)胞的分化、增殖和功能，使得純化Tr1細(xì)胞用于誘導(dǎo)免疫耐受治療免疫性疾病成為可能[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在+15 Gz作用下Tr1細(xì)胞并無顯著變化，可能與暴露時間較短，暫未引起脾臟中該細(xì)胞亞群變化有關(guān)。

綜上所述，本研究在成功構(gòu)建+15 Gz重復(fù)暴露7 d小鼠模型的基礎(chǔ)上，初步分析其脾臟和外周血中CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例和數(shù)量的變化。研究發(fā)現(xiàn)，短時間的+15 Gz作用并未顯著影響脾臟中CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和數(shù)量變化；而7 d的+15 Gz重復(fù)暴露顯著上調(diào)外周血中CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，同時顯著下調(diào)外周血CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞的比例。因此，本研究的結(jié)果不僅為高+Gz暴露對機(jī)體CD4+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例和數(shù)量的影響提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為通過檢測外周血CD4+T細(xì)胞及其亞群比例的變化較早期地了解飛行員免疫系統(tǒng)狀態(tài)提供了數(shù)據(jù)參考。