張曉雁，徐麗群，張麗君，唐 浩，李 萌，孫 權(quán)，薛 桐，胡澤兵，曹新生，石 菲，張 舒

(空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系航空航天生物動力學教研室，航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西 西安 710032)

航天失重環(huán)境打破骨形成和骨吸收之間的平衡，導致嚴重的骨質(zhì)丟失[1]。研究表明骨內(nèi)微血管在骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，血管生成先于骨形成，是骨化的先決條件；此外，骨內(nèi)微血管是骨與鄰近組織的溝通網(wǎng)絡(luò)，提供營養(yǎng)物質(zhì)，清除代謝廢物，表明血管生成和骨形成之間存在緊密的時空聯(lián)系，這種聯(lián)系被稱為“血管-成骨耦聯(lián)”[2]。骨內(nèi)微血管及血管生成減少可導致骨形成障礙，骨量減少，骨折愈合能力降低[2]。已有文獻報道模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞可調(diào)控成骨細胞功能[3]，但具體機制尚未闡明。外泌體是一種直徑為30～150 nm、具有脂質(zhì)雙分子層的膜性囊泡，可通過轉(zhuǎn)運核酸、蛋白質(zhì)和其他調(diào)控因子到受體細胞中發(fā)揮調(diào)控作用，參與體內(nèi)免疫應(yīng)答、骨重建、血管生成等多種生理活動[4-5]。在骨重塑微環(huán)境中，外泌體可向成骨細胞遞送微小RNA(microRNA，miRNA)進而影響骨形成[6]。miRNA是一類由約22個核苷酸組成的非編碼RNA，與靶基因的mRNA特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控基因表達，以調(diào)節(jié)多種生物學過程[7]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可參與調(diào)控成骨細胞功能，如miR-132-3p、miR-139-3p、miR-320-3p等[8-10]。前期，我們對模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞源外泌體進行了miRNA芯片分析，結(jié)果顯示模擬失重組外泌體內(nèi)miR-223-3p表達豐富。文獻[11]報道m(xù)iR-223-3p可參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，以小鼠微血管內(nèi)皮細胞系bEnd.3細胞和小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1細胞為研究對象，探究模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞通過外泌體轉(zhuǎn)運miR-223-3p是否可調(diào)控成骨細胞分化功能。該研究將有助于從“血管-成骨耦聯(lián)”的角度，深化對失重性骨質(zhì)丟失發(fā)生機制的認識，為失重性骨質(zhì)丟失防治提供新的干預靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠微血管內(nèi)皮細胞系bEnd.3(中國科學院上海細胞庫)，小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1(中國科學院上海細胞庫)，DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(Gibco公司)，2D回轉(zhuǎn)器(中國航天員科研訓練中心)，mimic-223-3p、inhibitor-223-3p及相應(yīng)的陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，RNAiso Plus細胞裂解液、SYBR?PremixExTaqTM、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit(TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，M-PER哺乳動物蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)，預制膠、PVDF膜(美國Invitrogen公司)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測試盒(南京建成生物工程研究所)，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒、DiI、Actin-Tracker Green、DAPI染色液(中國碧云天公司)，0.4 cm間隙電擊杯、電穿孔系統(tǒng)、qRT-PCR儀、酶標儀(美國Bio-Rad公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(Merck Millipore公司)，化學發(fā)光儀(Tanon-4200，上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和體外分化 在37 ℃培養(yǎng)箱中(50 mL/L CO2、950 mL/L濕度)，用含有100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)bEnd.3細胞，用含有100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MC3T3-E1細胞。研究成骨細胞分化功能時，用成骨誘導培養(yǎng)基(含有100 mL/L胎牛血清，10 mL/L青-鏈霉素，100 nmol/L地塞米松，50 mg/L抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM培養(yǎng)基)常規(guī)培養(yǎng)MC3T3-E1細胞。實驗均用第4～8代的細胞，所有實驗均重復3次。

1.2.2 細胞模擬失重實驗 2D回轉(zhuǎn)器用于模擬地面細胞的失重環(huán)境，將bEnd.3細胞以適當?shù)拿芏冉臃N于回轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，將培養(yǎng)瓶灌滿培養(yǎng)基并加塞，確保完全去除氣泡。然后，將培養(yǎng)瓶放入2D回轉(zhuǎn)器中，以24 r/min的速度繞水平軸回轉(zhuǎn)48 h，此為失重組(Clino組)。對照組(Con組)置入同一環(huán)境中靜置培養(yǎng)相同時間，不進行回轉(zhuǎn)。

1.2.3 外泌體分離與鑒定 模擬失重48 h后分別收集Clino組與Con組bEnd.3細胞培養(yǎng)基，在4 ℃條件下，依次300g離心10 min收上清、2 000g離心10 min收上清、1×104g離心30 min收上清，將上清置于超高速離心機1×105g離心70 min，棄上清，沉淀即為外泌體，PBS重懸后，再次1×105g離心70 min洗滌，沉淀用PBS重懸后可用于后續(xù)實驗，保存于-80 ℃，避免反復凍融。利用透射電鏡(HT-7700，日本Hitachi公司)觀察外泌體形態(tài)。使用粒徑分析儀(N30E，中國NanoFCM公司)檢測外泌體粒徑分布。利用蛋白質(zhì)印跡檢測外泌體的表面標記物，如Calnexin(1∶2 000；中國萬類生物科技公司)、CD9和TSG101(1∶1 000；Proteintech，美國)。將外泌體分為Con Exos組和Clino Exos組。

1.2.4 細胞攝取外泌體 取500 μL外泌體置于1.5 mL離心管中，渦旋30 s，向其中加入DiI(1∶500；中國碧云天公司)，在37 ℃暗室中染色30 min。以1×105g離心70 min，棄上清，用200 μL PBS重懸外泌體并渦旋60 s。將染色后的外泌體加入MC3T3-E1細胞中，3 h后用PBS沖洗3次，40 g/L多聚甲醛固定細胞10 min，然后進行免疫熒光染色。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染 將MC3T3-E1細胞以適當?shù)拿芏葌髦亮装?，用有血清無雙抗的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)過夜，細胞密度為60%～80%時轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine 2000將mimic-223-3p(40 nmol/L)、inhibitor-223-3p(80 nmol/L)及其相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細胞，無血清無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h后更換為有血清無雙抗培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細胞分組為：mimic-NC組、mimic-223-3p組、inhibitor-NC組、inhibitor-223-3p組。RNA Oligo序列見表1。

表1 RNA Oligo序列

1.2.6 外泌體電轉(zhuǎn)miRNA 取蛋白濃度為1 g/L的外泌體，分別加入33 μg mimic-223-3p或mimic-NC，33 μg inhibitor-223-3p或inhibitor-NC，充分溶解后將外泌體轉(zhuǎn)移至間隙為0.4 cm的電擊杯中，以700 V/150 mF脈沖2次。電轉(zhuǎn)完成后，將外泌體靜置于冰上30 min。用RNase處理外泌體以去除可能結(jié)合到外泌體膜上的miRNA。隨后，用PBS洗滌外泌體3次，1×105g離心70 min，去除未電轉(zhuǎn)的游離核酸，PBS重懸外泌體并渦旋60 s。

1.2.7 實時熒光定量PCR 用RNAiso Plus提取bEnd.3細胞和MC3T3-E1細胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)。使用PrimeScriptTMRT Master Mix Kit或Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH或U6作為內(nèi)參基因。采用CFX96 real-time PCR檢測系統(tǒng)和SYBR?PremixExTaqTMⅡ檢測mRNA和miRNA的表達水平，采用Ct(2-ΔΔCt)計算樣本間miRNA或mRNA的相對表達量。PCR引物序列見表2。

表2 基因引物序列

1.2.8 Western blotting分析 胰酶消化收集細胞，加入含100 mL/L蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取MC3T3-E1細胞總蛋白。超聲裂解蛋白樣本，在4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min并吸取上清后進行BCA定量。按照Western blotting操作說明進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。室溫下50 g/L脫脂牛奶封閉2 h后與特異性一抗4 ℃孵育過夜。使用一抗如下：GAPDH(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，Runx2(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)和Ocn(1∶2 000；Abcam，英國)。然后，洗膜，將膜與二抗孵育2 h(1∶5 000；中杉金橋公司，中國)，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。利用ImageJ軟件進行定量分析。

1.2.9 ALP活性測定 將MC3T3-E1細胞胰酶消化收集后加入含有100 mL/L蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，超聲裂解后在4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min吸取上清，使用BCA定量法測定蛋白樣品濃度。使用ALP檢測試劑盒檢測上清液中的ALP活性，37 ℃孵育15 min后加入顯色劑，以苯酚為標準溶液，ddH2O作為空白對照溶液測定溶液A520 nm值。

1.2.10 ALP染色 本研究使用BCIP/NBT ALP顯色試劑盒進行ALP染色。細胞棄去原培養(yǎng)基用PBS沖洗，40 g/L多聚甲醛固定15 min后用PBS沖洗3次，每次5 min。將BCIP/NBT染色工作液加到每個孔中，室溫避光孵育30 min。去除工作液，ddH2O洗滌2次終止顯色反應(yīng)。數(shù)碼相機拍照獲取圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 外泌體的分離鑒定及攝取

將bEnd.3細胞置于2D回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)48 h，收集細胞培養(yǎng)上清，采用低溫超高速離心法提取外泌體。透射電鏡下可觀察到提取的兩組外泌體均呈典型的茶杯樣結(jié)構(gòu)(圖1A)。納米流式分析兩組外泌體平均粒徑分別為78.83 nm和77.56 nm(圖1B)。Western blotting檢測兩組外泌體中均有外泌體經(jīng)典膜分子標志物CD9和TSG101表達，均未檢測到外泌體陰性標志物Calnexin(圖1C)。利用DiI分別標記兩組外泌體，將外泌體與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)，共聚焦顯微鏡下可觀察到兩組外泌體均可被MC3T3-E1細胞攝取(圖1D)。qRT-PCR實驗表明外泌體與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)后，Clino Exos組MC3T3-E1細胞中miR-223-3p表達顯著升高(P<0.05，圖1E)。

A：模擬失重處理bEnd.3細胞48 h后提取細胞培養(yǎng)上清中外泌體，透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，標尺為100 nm；B：納米流式分析外泌體直徑分布；C：Western blotting檢測外泌體和細胞中的外泌體標志物(CD9，TSG101)和細胞標志物(Calnexin)；D：共聚焦顯微鏡觀察MC3T3-E1細胞攝取外泌體，標尺為50 μm；E：qRT-PCR測定外泌體處理的MC3T3-E1細胞中miR-223-3p表達。 aP<0.05。

2.2 miR-223-3p抑制成骨細胞分化

為了探究miR-223-3p在成骨細胞分化中的作用，向MC3T3-E1細胞中轉(zhuǎn)染mimic-NC，mimic-223-3p，inhibitor-NC或inhibitor-223-3p。結(jié)果表明，與mimic-NC組相比，mimic-223-3p組ALP、Ocn、Runx2 mRNA水平表達顯著下降，且Ocn、Runx2蛋白水平也顯著下調(diào)(P<0.05，P<0.01，圖2A～B)；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-223-3p組ALP、Ocn、Runx2 mRNA水平表達升高(P<0.01)，且Ocn、Runx2蛋白水平也顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01，圖2A～B)。ALP活性檢測及ALP染色檢測結(jié)果與qRT-PCR、Western blotting結(jié)果一致(P<0.01，圖2C～D)，提示miR-223-3p抑制成骨細胞分化。

A：轉(zhuǎn)染mimic-NC、mimic-223-3p、inhibitor-NC、inhibitor-223-3p后MC3T3-E1細胞中的ALP、Ocn、Runx2的mRNA表達；B：Western blotting測定MC3T3-E1細胞中的Ocn和Runx2蛋白表達；C：ALP活性檢測；D：ALP染色，染色深表示ALP表達量高，染色淺表示ALP表達量低。 aP<0.05， bP<0.01。

2.3 外泌體可傳遞miR-223-3p抑制成骨細胞分化

將mimic-NC或mimic-223-3p電轉(zhuǎn)到Con Exos中，然后將兩組電轉(zhuǎn)外泌體與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，與mimic-NC組相比，mimic-223-3p組ALP、Ocn、Runx2 mRNA水平表達顯著下降，且Ocn、Runx2蛋白水平也顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖3A～B)。ALP活性檢測及ALP染色檢測也呈現(xiàn)相同的結(jié)果(P<0.05，圖3C～D)。這些結(jié)果表明，外泌體可傳遞miR-223-3p抑制成骨細胞分化。

2.4 抑制miR-223-3p可緩解模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞源外泌體對成骨細胞分化的抑制

將inhibitor-NC或inhibitor-223-3p電轉(zhuǎn)到Clino Exos中，然后將兩組電轉(zhuǎn)外泌體與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)。結(jié)果表明，與inhibitor-NC組相比，電轉(zhuǎn)inhibitor-223-3p組外泌體顯著增加了MC3T3-E1細胞中Ocn、Runx2的mRNA和蛋白水平(P<0.05，P<0.01，圖4A～B)。此外，ALP mRNA、ALP活性以及ALP染色也得到了相同的結(jié)果(P<0.05，圖4A，圖4C～D)，提示沉默miR-223-3p可有效緩解模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞源外泌體對成骨細胞分化的抑制。

A：Con Exos電轉(zhuǎn)mimic-NC、mimic-223-3p后與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)ALP、Ocn、Runx2的mRNA表達；B：Western blotting測定MC3T3-E1細胞的Ocn和Runx2蛋白表達；C：ALP活性檢測；D：ALP染色，染色深表示ALP表達量高，染色淺表示ALP表達量低。 aP<0.05， bP<0.01。

A：Clino Exos電轉(zhuǎn)inhibitor-NC、inhibitor-223-3p后與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)ALP、Ocn、Runx2的mRNA表達；B：Western blotting測定MC3T3-E1細胞的Ocn和Runx2蛋白表達；C：ALP活性檢測；D：ALP染色，染色深表示ALP表達量高，染色淺表示ALP表達量低。 aP<0.05， bP<0.01。

3 討論

失重環(huán)境導致的骨質(zhì)丟失尚未發(fā)現(xiàn)具有自限性，且隨著時間延長不斷加重，因此失重性骨質(zhì)丟失是限制長期載人航天任務(wù)的主要因素之一[12]。骨骼是高度血管化的組織，其中的血液循環(huán)和血管再生對于骨骼的生長與發(fā)育、塑形與重塑、損傷愈合至關(guān)重要[13]。骨內(nèi)微血管不僅為骨骼細胞提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、內(nèi)分泌激素等，并且內(nèi)皮細胞能夠通過分泌各種細胞因子與成骨細胞、破骨細胞等形成直接或間接的廣泛聯(lián)系，從而耦聯(lián)血管新生與骨形成[2]。多項研究發(fā)現(xiàn)，微血管內(nèi)皮細胞可促進共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化[14-15]。此外，在Transwell小室共培養(yǎng)條件下，微血管內(nèi)皮細胞能夠顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖，并抑制其凋亡[16]。有文獻[3]報道，模擬失重下人微血管內(nèi)皮細胞的條件培養(yǎng)基抑制人原代成骨細胞的增殖和分化功能，表明模擬失重可通過影響微血管內(nèi)皮細胞與成骨細胞的胞間通訊，從而間接干預成骨細胞功能。因此，我們從“血管-成骨耦聯(lián)”的角度，探索了模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞對成骨細胞的調(diào)控作用及其可能機制。

外泌體介導的細胞間信息交流被認為是細胞-細胞間信息交流的重要方式。外泌體可通過直接與靶細胞胞膜融合進入細胞質(zhì)、通過內(nèi)吞作用被靶細胞攝取以及識別細胞表面的特異性受體，對靶細胞內(nèi)的生理活動進行調(diào)節(jié)[17]。同時外泌體還具有良好的生物相容性，穩(wěn)定的物理化學特性和可塑性，能通過改構(gòu)實現(xiàn)藥物裝載和靶向遞送，在疾病治療方面有很好的應(yīng)用前景[18]。研究[6]表明，由骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞和破骨細胞分泌的外泌體可通過遞送miRNA調(diào)節(jié)成骨細胞功能。此外，SONG等[19]研究發(fā)現(xiàn)小鼠微血管內(nèi)皮細胞源外泌體具有良好的骨靶向性，并且miR-155能夠通過外泌體作用于破骨細胞并抑制破骨細胞形成，從而抑制骨吸收。然而，在失重性骨質(zhì)丟失的研究領(lǐng)域，尚未明確微血管內(nèi)皮細胞能否通過外泌體來調(diào)節(jié)成骨細胞功能。miRNA是外泌體的重要組分，且外泌體的磷脂雙分子層可保護miRNA分子免遭降解，從而更有利于miRNA進入靶細胞發(fā)揮調(diào)控作用[20-21]。miR-223-3p被認為是一種影響造血、免疫反應(yīng)和炎癥性疾病的骨髓特異性miRNA，參與NFκB、MAPK、PI3K/AKT、HIF-1α、NLRP3等多種信號通路[22]。最近研究表明，miR-223-3p通過靶向FOXO3抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[11]。目前尚未有外泌體轉(zhuǎn)運miR-223-3p調(diào)控成骨細胞分化的研究報道。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞源外泌體可被MC3T3-E1細胞攝取，并增加MC3T3-E1細胞中miR-223-3p表達。分別向MC3T3-E1細胞中轉(zhuǎn)染mimic-223-3p或inhibitor-223-3p進行功能實驗發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p能夠抑制MC3T3-E1細胞分化。將電轉(zhuǎn)mimic-NC或mimic-223-3p的Con Exos分別與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞可通過外泌體傳遞miR-223-3p抑制成骨細胞分化。此外，向Clino Exos電轉(zhuǎn)inhibitor-223-3p抑制miR-223-3p可有效緩解模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞源外泌體對成骨細胞分化的抑制。綜上所述，本研究首次闡明模擬失重下微血管內(nèi)皮細胞可通過外泌體轉(zhuǎn)運miR-223-3p抑制成骨細胞分化，這為防治失重性骨質(zhì)丟失提供了一個潛在的干預靶點。但本研究尚未闡明外泌體轉(zhuǎn)運miR-223-3p抑制成骨細胞分化的具體機制，未來將進一步開展相關(guān)研究。