林恒宗，梁志源，秦小明，高加龍，范秀萍，黃艷平，常向陽(yáng)，鄧 杰，吳煒俊

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心（湛江），廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

牡蠣為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類，2020年總產(chǎn)量約為542萬(wàn) t，約占貝類總產(chǎn)量的1/3[1]。鮮活牡蠣由于其肉質(zhì)爽滑、味道鮮甜，且富含蛋白質(zhì)、?；撬帷⑻窃拔⒘吭氐葼I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而深受消費(fèi)者青睞，因此在我國(guó)牡蠣主要以鮮銷生食為主[2-3]。牡蠣采捕離水后需歷經(jīng)運(yùn)輸、凈化、?；?、銷售等商業(yè)流通環(huán)節(jié)，然而牡蠣在各流通環(huán)節(jié)均會(huì)受到環(huán)境脅迫應(yīng)激如：缺氧、干露、振蕩、饑餓、溫度波動(dòng)等，隨著流通時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體組織臟器受到不同程度的損傷，存活質(zhì)量也受到顯著影響[4]，因此如何將高品質(zhì)鮮活牡蠣運(yùn)輸至內(nèi)地市場(chǎng)已經(jīng)成為行業(yè)研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)活體牡蠣運(yùn)輸?shù)难芯咳〉昧艘欢ǖ慕?jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，如：香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）[5]在生態(tài)冰溫條件下?；? d，其存活率高達(dá)90%。但產(chǎn)業(yè)實(shí)際中判斷牡蠣活力及品質(zhì)劣變的方法僅能依靠開(kāi)殼、敲擊、嗅聞等傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)手段，難以全面反映牡蠣流通過(guò)程中活力及整體品質(zhì)。

活體牡蠣具有獨(dú)特的海洋鮮香氣味，在流通過(guò)程中香氣會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、環(huán)境的改變而發(fā)生變化，因此風(fēng)味降解是鑒別牡蠣活力品質(zhì)變化的關(guān)鍵途徑。近年來(lái)，氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品揮發(fā)性風(fēng)味成分分析[6-8]，目前該技術(shù)在活體貝類凈化及?；盍魍ㄖ幸延邢嚓P(guān)報(bào)道，如：冉云等[9]采用GC-MS技術(shù)，明確了縊蟶（Sinonovacula constricta）暫養(yǎng)凈化8 h可明顯降低其不良?xì)馕?；張思嘉等[10]采用相同方法探究?jī)艋瘜?duì)美洲簾蛤（Mercenaria mercenaria）風(fēng)味成分的影響也得出類似結(jié)果；傅潤(rùn)澤等[11]研究表明，蝦夷扇貝（Patinopecten yessonensis）在保活運(yùn)輸后其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與采捕后相比具有明顯差異；然而鮮見(jiàn)該技術(shù)應(yīng)用于活體牡蠣商業(yè)流通過(guò)程中風(fēng)味品質(zhì)監(jiān)控的研究。因此，本研究模擬當(dāng)前國(guó)內(nèi)活體太平洋牡蠣流通模式，采用GC-MS聯(lián)用法以鑒定活體太平洋牡蠣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量，分析流通各環(huán)節(jié)風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，探明各流通環(huán)節(jié)間內(nèi)在聯(lián)系，以期建立一種鑒別活體太平洋牡蠣品質(zhì)狀態(tài)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活體太平洋牡蠣于2021年10月購(gòu)自山東威海燈塔水母海洋科技有限公司，規(guī)格為（129.51±2.81）g/個(gè)，殼長(zhǎng)（127.62±2.07）mm，殼寬（64.11±3.57）mm，殼高（31.98±2.47）mm。牡蠣采捕后保留外殼附著物，每50 kg分裝于鋪有海水冰的泡沫箱內(nèi)，經(jīng)專用冷鏈運(yùn)輸車低溫運(yùn)輸48 h抵達(dá)廣東海洋大學(xué)保活流通實(shí)驗(yàn)室，剔除活力弱或死亡的個(gè)體，立即用滅菌人工海水清洗表面泥污后進(jìn)行暫養(yǎng)凈化，以消除捕撈或運(yùn)輸操作時(shí)應(yīng)激脅迫。

海水晶 江西鹽通科技有限公司；2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP） 上海安譜有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

貝類暫養(yǎng)凈化系統(tǒng) 廣州創(chuàng)嶺水產(chǎn)有限公司；YC-800低溫恒溫層析柜 北京亞星儀科公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海博迅公司；PR224ZH精密天平美國(guó)OHAUS公司；5810R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；8-2T恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦有限公司；PB-10 pH計(jì)、57330-U固相微萃取裝置、50/30 μm-57348-U型-DVB/CAR/PDMS固相微萃取針 德國(guó)Supelco公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣凈化

凈化流程及方法參照SC/T 3013—2002《貝類凈化技術(shù)規(guī)范》，在貝類凈化系統(tǒng)中按太平洋牡蠣養(yǎng)殖海域鹽度（（31±0.5）‰）配制人工海水，開(kāi)啟增氧設(shè)備持續(xù)曝氣24 h，以流速2.5 m3/h通過(guò)紫外燈管循環(huán)滅菌制冷至25 ℃，通臭氧至海水臭氧質(zhì)量濃度0.15 mg/L，將清洗后的牡蠣分裝于塑料筐（600 mm×420 mm×315 mm），置于預(yù)冷的循環(huán)人工海水中凈化24 h，暫養(yǎng)期間不投喂餌料，保持水體溶解氧不小于8 mg/L，凈化完成后挑選富有活力的個(gè)體進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 誘導(dǎo)休眠及生態(tài)冰溫?；?/p>

參照本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)方法[4]，將暫養(yǎng)凈化后的牡蠣采用聚氯乙烯熱收縮膜逐個(gè)包裹，包裝完成后將牡蠣分裝于塑料周轉(zhuǎn)筐中（600 mm×420 mm×315 mm），轉(zhuǎn)移至低溫恒溫層析柜誘導(dǎo)休眠處理，處理方式為調(diào)節(jié)恒溫層析柜，從（25±0.5）℃開(kāi)始，以5 ℃/h的速率降至生態(tài)冰溫休眠溫度0 ℃，溫度每下降5 ℃停留90 min，避免溫度急劇下降造成應(yīng)激損傷。誘導(dǎo)休眠結(jié)束后，迅速將牡蠣分裝于套有內(nèi)膜袋的泡沫箱（450 mm×250 mm×200 mm）中，裝箱前在箱底平鋪一層無(wú)菌海水制備而成的冰袋，逐層覆蓋浸足滅菌海水的海綿保濕處理，加蓋后放置在溫度設(shè)定為0 ℃的層析柜中進(jìn)行無(wú)水?；?。

1.3.3 樣品采集與制備

實(shí)驗(yàn)分別在凈化前、凈化后、休眠后、?；? d、?；? d、保活9 d取樣，每組隨機(jī)取活體牡蠣60 只，迅速開(kāi)殼刨取牡蠣全臟器，用預(yù)冷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.86%生理鹽水漂洗，吸水紙拭干表面水分，冰浴高速混合勻漿成肉糜狀，立即使用或液氮速凍后置于-80 ℃凍存。

1.3.4 揮發(fā)性氣味成分分析

1.3.4.1 萃取方法

參照Van Houcke等[8]萃取方法并加以改進(jìn)，精確稱取5.000 g牡蠣勻漿肉糜置于20 mL頂空瓶?jī)?nèi)，頂空瓶?jī)?nèi)注入10 μL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的TMP作為內(nèi)標(biāo)物，密封，置于85 ℃水浴中磁力攪拌（轉(zhuǎn)速500 r/min）平衡20 min，萃取針在GC進(jìn)樣口250 ℃活化20 min后插入頂空瓶?jī)?nèi)萃取30 min。

1.3.4.2 GC-MS條件

GC條件：采用不分流進(jìn)樣模式，HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始溫度50 ℃，保持3 min；隨后分別以5、4 ℃/min和4 ℃/min的速率升溫至100、140、180 ℃，并在終溫處分別保持2、1 min和2 min，最后以5 ℃/min升至250 ℃，保留5 min；高純度氦氣作為載氣；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS條件：采用電子電離模式；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃；全掃描m/z35～550。

1.3.4.3 定性分析

根據(jù)GC-MS得出的太平洋牡蠣揮發(fā)性香氣化合物的質(zhì)譜信息，與NIST和Wiley譜庫(kù)對(duì)比，輔助人工圖譜解析，選擇正反向匹配值均大于800的化合物進(jìn)行定性分析，各化合物峰面積由儀器軟件計(jì)算。

1.3.4.4 定量分析

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析[12]，根據(jù)已知濃度的TMP峰面積計(jì)算出不同實(shí)驗(yàn)組牡蠣組織樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量，按式（1）計(jì)算：

式中：Ci為目標(biāo)化合物的含量/（ng/g）；Ax為目標(biāo)化合物的峰面積；Ai為內(nèi)標(biāo)化合物TMP的峰面積；Cx為內(nèi)標(biāo)化合物的含量/（ng/g）。

1.3.4.5 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析

參照Feng Yunzi等[13]方法及相關(guān)文獻(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值，以香氣活性值（odor activity value，OAV）對(duì)樣品中起關(guān)鍵作用的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行確定，按式（2）計(jì)算OAV：

式中：Ci為目標(biāo)化合物的質(zhì)量含量/（ng/g）；Ct為該物質(zhì)的感覺(jué)閾值/（ng/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 太平洋牡蠣流通過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分析

采用頂空固相萃取結(jié)合GC-MS測(cè)定，通過(guò)NIST/Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，鮮活太平洋牡蠣共鑒定出7大類、49 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物（表1、圖1），其中醛類15 種、酯類14 種、烷烴類5 種、雜環(huán)化合物4 種、酮類4 種、醇類3 種、芳香族化合物2 種以及其他化合物2 種。可見(jiàn)，醛、酯類化合物為活體太平洋牡蠣中含量最豐富的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，在葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）[14]、歐洲扁牡蠣（Ostrea edulis）[8]中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。由圖1可知，太平洋牡蠣采捕離水后在不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量均發(fā)生不同的變化。凈化前牡蠣共鑒定出31 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，醛類15 種，含量為700.86 ng/g；酯類6 種，含量為726.74 ng/g；酮類3 種，含量為91.8 ng/g。復(fù)水凈化后，醛、脂類化合物各減少1 種，含量分別下降了64.25%、46.73%；酮類化合物減少1 種，含量下降了36.49%。誘導(dǎo)休眠至?；盍魍ńK期揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量大體呈上升趨勢(shì)，?；? d后，酯類化合物較凈化前增加了8 種，含量為凈化前的4.56 倍；醛酮類化合物減少各減少2 種，其中醛類化合物增加了19.9%，酮類化合物則下降了39.9%；同時(shí)雜環(huán)及烴類物質(zhì)分別增加1～2 種。以上結(jié)果顯示，活體太平洋牡蠣采捕后不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味化合物差異明顯，但要確定各階段風(fēng)味物質(zhì)具體含量變化仍需進(jìn)一步分析。

圖1 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量（a）、種類個(gè)數(shù)（b）變化Fig.1 Changes in contents (a) and types of flavor substances (b) of C.gigas during different circulation stages

2.2 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

為解析太平洋牡蠣在不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味成分變化，首先將化合物按官能團(tuán)分類，并通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其氣味特征進(jìn)行描述（表1）。大量研究表明，揮發(fā)性醛類化合物為鮮活太平洋牡蠣主要香氣來(lái)源[15]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)醛類物質(zhì)在活體太平洋牡蠣中占主導(dǎo)地位，這可能與牡蠣生長(zhǎng)環(huán)境及攝食密切相關(guān)。暫養(yǎng)凈化期間庚醛、壬醛、月桂醛、己醛、十三醛、十一醛、苯甲醛、癸醛等直鏈飽和醛的含量與凈化前相比有所下降，但無(wú)顯著差異（P＞0.05），這些醛類化合物是脂質(zhì)氧化的降解產(chǎn)物，其中壬醛是油酸和亞油酸氧化的產(chǎn)物，多具有塑料味、魚(yú)腥味[14]；己醛、癸醛、庚醛會(huì)產(chǎn)生刺鼻的油脂氧化氣味[14]；苯甲醛具有苦味和焦糖類似味，被認(rèn)為是苯丙氨酸Strecker反應(yīng)降解的產(chǎn)物。冉云等[9]研究表明，縊蟶體內(nèi)泥土味、腥臭味、糞便味等不良風(fēng)味主要來(lái)源于直鏈飽和醛，這也證實(shí)了牡蠣通過(guò)暫養(yǎng)凈化能緩解捕撈或運(yùn)輸操作時(shí)應(yīng)激脅迫導(dǎo)致的脂質(zhì)氧化損傷，保留其獨(dú)特風(fēng)味的同時(shí)可降低其不良?xì)馕妒鼓迪牳舆m口。(E)-2-壬烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等不飽和醛類較凈化前同樣有所下降，其中(E)-2-壬烯醛降幅更為明顯（P＜0.05），Aruna等[16]研究發(fā)現(xiàn)，這些產(chǎn)物多為脂肪酸氧化降解產(chǎn)物，推測(cè)太平洋牡蠣采捕后長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中體內(nèi)多不飽和脂肪酸氧化速率加快，復(fù)水后其脅迫解除，活力恢復(fù)，緩解了脂質(zhì)氧化進(jìn)一步加劇，體內(nèi)揮發(fā)性氣味物質(zhì)得以再次積累，呈現(xiàn)出濃烈的清香氣味。牡蠣在誘導(dǎo)休眠后醛類化合物含量呈明顯上升趨勢(shì)；之后隨著保活時(shí)間的延長(zhǎng)，含量變化與?；顣r(shí)間呈正相關(guān)。推測(cè)牡蠣長(zhǎng)時(shí)處于低溫脅迫狀態(tài)，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞內(nèi)生物大分子氧化損傷，肌肉脂質(zhì)、游離脂肪酸發(fā)生初始氧化損傷，其降解產(chǎn)物為醛類化合物，同時(shí)也是貝類鮮甜香氣的主要來(lái)源[17]。保活9 d后，活體牡蠣組織中庚醛、壬醛、苯甲醛等14 種醛類明顯高于凈化后水平（P＜0.05），可見(jiàn)無(wú)水?；钣欣谔嵘迪犝w風(fēng)味。

表1 太平洋牡蠣流通過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化Table 1 Changes of volatile flavor substances in C.gigas during circulation stages

酯類香氣化合物主要呈奶油香、水果香、花香、甜味、青草味等愉悅性氣味[18]，鮮活太平洋牡蠣檢測(cè)出肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、壬烯酸甲酯、十七酸甲酯等14 種酯類，其中棕櫚酸甲酯在?；畹?天其含量高達(dá)1264.76 ng/g。這些酯類大多為牡蠣組織中未經(jīng)甲酯化處理的脂肪酸與不飽和脂肪酸，其不僅可以作為能源抵御不良環(huán)境變化，同時(shí)也是牡蠣中鮮、香氣味的主要來(lái)源[19]。牡蠣在復(fù)水凈化后肉豆蔻酸甲酯、十五碳酸甲酯、十六烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯較凈化前明顯下降（P＜0.05），可見(jiàn)牡蠣采捕離水后，干露、缺氧脅迫致使脂質(zhì)發(fā)生了初級(jí)氧化，復(fù)水凈化后牡蠣活力恢復(fù)，緩解了脂肪氧化進(jìn)一步加劇，同時(shí)牡蠣處于饑餓脅迫狀態(tài)需消耗脂肪酸以維持的正常生命代謝活動(dòng)。誘導(dǎo)休眠至保活流通終期，肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、十六烯酸甲酯、亞油酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯等酯類物質(zhì)隨運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)（P＜0.05），提示低溫運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致牡蠣肌肉組織脂質(zhì)氧化加劇，然而這些化合物多為牡蠣中的不飽和脂肪酸，其賦予牡蠣獨(dú)特脂肪清香氣味，?；? d后活體牡蠣組織中仍檢測(cè)出二十碳五烯酸等人體所需的酯類化合物大量存在，可見(jiàn)牡蠣在長(zhǎng)時(shí)無(wú)水流通過(guò)程中整體風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未發(fā)生改變。在已有的研究中，吳梓宣等[20]研究表明，蝦夷扇貝在暫養(yǎng)凈化過(guò)程中，隨著凈化時(shí)間的延長(zhǎng)其多不飽和脂肪酸呈下降趨勢(shì)。Fan Xiuping等[21]研究發(fā)現(xiàn)，珍珠龍膽石斑魚(yú)（♀Epinephelus fuscoguttatus×♂E.lanceolatus）在無(wú)水保活過(guò)程中二十碳五烯酸甲酯呈下降趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相似。

烷烴類、酚類、含硫等雜環(huán)類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在各不同流通階段的牡蠣中檢出較少，烷烴類物質(zhì)的產(chǎn)生主要來(lái)源于脂肪酸烷氧自由基斷裂，含氮含硫及雜環(huán)化合物主要由蛋白質(zhì)在微生物和酶的作用下分解產(chǎn)生，酚類物質(zhì)則可能來(lái)自環(huán)境中的污染物[22]。在本研究中，活體牡蠣鑒定出十六烷、2-乙基呋喃、2-戊基呋喃、二甲基硫醚等活貝中具有代表性的關(guān)鍵氣味物質(zhì)，其中2-乙基呋喃、2-戊基呋喃具有很強(qiáng)的肉香味；二甲基硫醚則由氨基酸降解產(chǎn)生，是牡蠣中最重要的香氣揮發(fā)物[11,23]。牡蠣在暫養(yǎng)凈化后十六烷、2-乙基呋喃較凈化前有所提升，研究表明，采捕后未經(jīng)凈化的活貝腸道中含有大量未排出的糞便、泥沙等雜質(zhì)，這些殘留物通常被認(rèn)為是不良口感及腥臭味的主要來(lái)源[9]，可見(jiàn)通過(guò)暫養(yǎng)凈化牡蠣愉悅性風(fēng)味得到明顯改善。隨著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，2-乙基呋喃、2-戊基呋喃、二甲基硫醚較凈化后顯著提升（P＜0.05），同時(shí)吲哚類化合物緩慢增加，牡蠣組織整體香氣含量呈積聚趨勢(shì)，這一現(xiàn)象在活體蝦夷扇貝[11]流通過(guò)程中也有報(bào)道，提示在長(zhǎng)時(shí)低溫流通過(guò)程中牡蠣生理狀態(tài)變差，風(fēng)味品質(zhì)也受到一定的影響，但由于這幾類化合物閾值較高，對(duì)牡蠣氣味作用不顯著。

酮類化合物在牡蠣等海洋貝類中主要貢獻(xiàn)青草香、脂肪香、花香、果香風(fēng)味，是脂肪氧化及氨基酸降解產(chǎn)物，本研究中活體牡蠣鑒定出2-壬酮、3,5-辛二烯-2-酮、3-辛酮、(E)-3,5-辛二烯-2-酮4 種化合物；其中2-壬酮已被鑒定為活體牡蠣中主要呈鮮味化合物[24]。酮類化合物含量變化與醛類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，在流通過(guò)程中整體呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，其中3,5-辛二烯-2-酮、3-辛酮與凈化后相比具有明顯差異（P＜0.05），這可能是流通過(guò)程中微生物快速增長(zhǎng)，代謝活動(dòng)需分解羥基類化合物，從而導(dǎo)致風(fēng)味品質(zhì)逐漸下降。醇類化合物主要由脂肪氧合酶和氫過(guò)氧化酶降解亞油酸產(chǎn)生，其風(fēng)味閾值遠(yuǎn)高于醛酮類化合物，對(duì)牡蠣整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，但一些不飽和醇的閾值較低，對(duì)牡蠣的整體風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)。如：十六烷醇、7-十四烷醇、1-戊烯-3-醇，這幾類物質(zhì)通常具有植物芳香氣味，在凈化前后均能檢出，但隨著流通時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)氧化作用導(dǎo)致這些化合物發(fā)生明顯的積聚。

2.3 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類熱圖分析

為直觀區(qū)分太平洋牡蠣在不同流通階段揮發(fā)性香氣物質(zhì)的差異，將各流通階段香氣化合物含量進(jìn)行熱圖聚類分析，結(jié)果如圖2所示。49 種化合物可聚類為4 類，其中香氣化合物A類＞B類＞C類＞D類，活體太平洋牡蠣不同流通階段香氣化合物差異最為顯著的是A、B類化合物，包括十六烯酸甲酯、棕櫚酸甲酯、己醛、3-辛酮、2-乙基呋喃等醛、酯物質(zhì)。由樣品聚類分析結(jié)果可以看出，凈化前與凈化后組牡蠣在最小距離水平首先發(fā)生聚類，表明牡蠣在凈化前與凈化后揮發(fā)性物質(zhì)組成與含量相似性較高，這說(shuō)明太平洋牡蠣在采捕離水后通過(guò)暫養(yǎng)凈化機(jī)體呈現(xiàn)出明顯的恢復(fù)性，對(duì)其風(fēng)味具有明顯改善作用；在?；盍魍A段，休眠組與?；畹?天首先發(fā)生聚類，隨著歐式距離的增加與?；畹?、9天聚為另一大類；表明隨著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)，牡蠣體內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)含量發(fā)生明顯改變。鮮活牡蠣鑒定出揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類較多，為明確牡蠣各流通階段關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)及含量變化仍需采用OAV進(jìn)行篩選分析。

圖2 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量變化熱圖Fig.2 Heatmap of changes in volatile flavor substances of C.gigas during circulation stages

2.4 太平洋牡蠣不同流通階段關(guān)鍵風(fēng)味化合物的確定

為進(jìn)一步明確各不同流通階段太平洋牡蠣關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)及其含量變化，依據(jù)牡蠣風(fēng)味化合物的組成及其閾值，采用OAV評(píng)價(jià)方法以客觀反映每種揮發(fā)性化合物對(duì)牡蠣總香氣的貢獻(xiàn)。一般認(rèn)為，OAV不小于1的物質(zhì)是影響樣品關(guān)鍵風(fēng)味化合物，且OAV越大則對(duì)樣品香氣貢獻(xiàn)程度越高[25]。由表2可知，揮發(fā)性香氣化合物以醛酮類為主，因而確定醛酮類化合物為活體太平洋牡蠣中關(guān)鍵香氣成分；太平洋牡蠣在各不同流通階段OAV不大于1的物質(zhì)共有5 種，分別為苯甲醛、(E)-3,5-辛二烯-2-酮、3,5-辛二烯-2-酮、2-乙基呋喃、1-戊烯-3-醇，說(shuō)明其對(duì)牡蠣總體風(fēng)味具有修飾作用；OAV不小于1的物質(zhì)有13 種，分別為己醛、庚醛、十一醛、(E)-2-壬烯醛、4-乙基苯甲醛、壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、癸醛、(E)-2-辛烯醛、2-戊基呋喃、3-辛酮、2-壬酮，表明這些揮發(fā)性化合物為活體牡蠣流通過(guò)程中起主要貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)，其中己醛（青香味）、癸醛（脂味、海味）、(E,E)-2,4-壬二烯醛（脂香味）、(E)-2-辛烯醛（油脂味）、(E)-2-壬烯醛（肉香味）、2-戊基呋喃（青草香味）是牡蠣獨(dú)有的主要揮發(fā)性物質(zhì)，與已有相關(guān)文獻(xiàn)[24-26]報(bào)道一致。將OAV進(jìn)行熱圖可視化處理（圖3），凈化前、凈化后組聚集，說(shuō)明其揮發(fā)性物質(zhì)含量相似度較高；保活6 d和?；?、9 d分別在2 個(gè)不同大類分支上，表明牡蠣在流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量具有差異。暫養(yǎng)凈化后醛酮類化合物OAV較凈化前明顯下降，提示牡蠣脂肪氧化得到明顯緩解，愉悅性風(fēng)味成分得到改善；誘導(dǎo)休眠至保活流通階段，牡蠣體內(nèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物較凈化前明顯上升，醛酮類化合物隨著?；顣r(shí)間的延長(zhǎng)明顯積聚，提示脂質(zhì)氧化進(jìn)一步加劇，其中戊醛、己醛、E-2-庚醛等醛類化合物是油酸和亞油酸的氧化降解產(chǎn)物[25]，賦予牡蠣清香、脂肪香、花香、新鮮氣味。Zhang Zuoming等[27]研究發(fā)現(xiàn)，腐敗變質(zhì)的牡蠣組織中三甲胺、二甲硫化合物占主導(dǎo)地位，而本研究在各流通階段均檢出以上物質(zhì)，可見(jiàn)牡蠣仍保留較高的鮮香氣味。

表2 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAVTable 2 OAVs of volatile flavor substances in C.gigas during different circulation stages

圖3 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV變化熱圖Fig.3 Heatmap of changes in OAVs of volatile flavor substances in C.gigas during different circulation stages

2.5 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA

為了更直觀體現(xiàn)活體太平洋牡蠣不同流通階段氣味特征差異，依據(jù)OAV篩選結(jié)果，選取關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行PCA。如圖4所示，箭頭代表各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分二維和三維空間的投影，箭尖距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表示該變量被主成分解釋的程度越高[28]。由圖4a可知，不同流通階段牡蠣樣品整體區(qū)分度較高，凈化前組牡蠣處于第2象限，對(duì)PC2有正響應(yīng)值；凈化后組與誘導(dǎo)休眠組牡蠣處于第3象限，對(duì)PC1、PC2均具有負(fù)響應(yīng)值；保活第3天處于第4象限，對(duì)PC1有正響應(yīng)值；?；畹?、9天處于第1象限，對(duì)PC1、PC2均具有正響應(yīng)值，可見(jiàn)，牡蠣在不同流通階段有明顯的區(qū)分度。由圖4b可知，PC1、PC2、PC3表示太平洋牡蠣樣品的三維分析圖，PC的貢獻(xiàn)率分別為59.4%（PC1）、15.8%（PC2）和10.4%（PC3），累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.6%，同樣表明PC1、PC2和PC3能夠較好地反映太平洋牡蠣中大部分揮發(fā)性風(fēng)味化合物的信息，同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明了活體牡蠣體內(nèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物在長(zhǎng)時(shí)保活流通過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生了明顯的變化。

圖4 太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA二維圖（a）、三維圖（b）Fig.4 Two-(a) and three-(b) dimensional PCA plots of volatile flavor substances in C.gigas at different circulation stages

3 結(jié)論

采用GC-MS技術(shù)分析活體太平洋牡蠣不同流通階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成與含量變化情況，共鑒定出49 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，確定醛、酮、酯類化合物為活體牡蠣主要風(fēng)味物質(zhì)，其含量變化可作為反映生理狀態(tài)的參考；牡蠣采捕離水后，應(yīng)激脅迫對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響較大；通過(guò)24 h暫養(yǎng)凈化，牡蠣愉悅性風(fēng)味化合物明顯提升，刺激性氣味化合物明顯降低，脂質(zhì)氧化得到明顯的緩解；誘導(dǎo)休眠至?；盍魍A段，牡蠣脂質(zhì)氧化隨著?；盍魍〞r(shí)間的延長(zhǎng)加劇，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈緩慢下降趨勢(shì)。太平洋牡蠣采捕后通過(guò)暫養(yǎng)凈化24 h，機(jī)體活力品質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)達(dá)到新的水平，更有利于后期長(zhǎng)時(shí)低溫?zé)o水?；?；同時(shí)揮發(fā)性成分分析可以作為活體貝類流通過(guò)程中活力品質(zhì)鑒定的一種方法。