楊成峻，陳明舜，劉成梅，周 偉，李積華，陳 軍,

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 湛江 524001）

II型糖尿病是最常見的糖尿病類型，其患病率在世界范圍內(nèi)迅速增加[1]。而現(xiàn)有的藥物治療方案如阿卡波糖和米格列醇等往往會(huì)出現(xiàn)胃腸道紊亂等的副作用[2]。許多植物中發(fā)現(xiàn)的多酚類化合物，具有降血糖功效且副作用較少，具有成為改善血糖和預(yù)防II型糖尿病有效制劑的潛力，有望成為現(xiàn)有藥物的替代品[3]。

花椒（Zanthoxylum bungeanum）屬蕓香科（Rutaceae）植物，目前全世界大約有250 個(gè)花椒品種，分布于亞洲、非洲、美洲及大西洋地區(qū)，其中，我國有50余種[4]?；ń肥俏覈Ｓ玫恼{(diào)味品，為藥食同源原料，具有獨(dú)特的風(fēng)味[5]。花椒中含有多種生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[6]?；ń范喾宇愇镔|(zhì)已經(jīng)被證明具有抗氧化、抑菌、鎮(zhèn)痛抗炎和降血糖等活性[7-10]，Zhang Zecai等[11]發(fā)現(xiàn)花椒果皮提取物（總黃酮含量80.92 mg/g）對(duì)小鼠結(jié)腸炎有顯著改善作用。Ma Yao等[12]發(fā)現(xiàn)花椒果皮提取物具有抗氧化和抗癌活性。Zhang Yali等[13]研究發(fā)現(xiàn)從花椒葉中分離出的金絲桃苷對(duì)糖尿病小鼠具有降血糖和肝細(xì)胞保護(hù)作用，Li Wei等[14]發(fā)現(xiàn)花椒莖中分離出的橙皮苷和金絲桃苷具有對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，但目前鮮見花椒果皮多酚的降血糖活性研究，其降血糖效果需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，前期研究主要采用不同溶劑提取花椒果皮多酚粗提物，缺乏對(duì)花椒果皮多酚的純化鑒定，及其活性的相關(guān)研究[12,15]。

本研究以花椒果皮原料，采用無水乙醇提取，不同極性溶劑分級(jí)萃取花椒果皮多酚，對(duì)其主要化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，并研究其體內(nèi)外降糖活性，為花椒的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宜昌大紅袍花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）果皮，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。

α-葡萄糖苷酶、鏈脲佐菌素、鹽酸二甲雙胍、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖、沒食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；原兒茶酸、香草酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸、金絲桃苷、柚皮苷、槲皮苷、柚皮素、異鼠李素、山柰素標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司；原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸、槲皮素、芹黃素標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 北京中科質(zhì)檢生物有限公司；對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司。

3 周齡SPF級(jí)雄性KM小鼠50 只，體質(zhì)量（35±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中，溫度（24±2）℃。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Multiskan spectrum全波長酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher科技公司；Eksigent ekspert ultraLC 110-XL超高效液相色譜儀、Triple TOFTM5600+電噴霧飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；血糖儀及血糖試紙 三諾生物傳感股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒果皮多酚的提取和分級(jí)萃取

花椒果皮多酚的提取按照Sun Xiaoxia等[7]的方法并稍作修改，將花椒果皮使用中藥粉碎機(jī)粉碎過20 目篩后，稱取1 kg，使用錐形瓶以1∶20的料液比加入花椒果皮干粉和無水乙醇，超聲輔助提取20 min后（400 W），3000 r/min離心20 min，取上清液合并，減壓濃縮后，真空冷凍干燥得到花椒果皮多酚粗提物78.00 g。將花椒果皮多酚粗提物加適量水溶解后等體積加入石油醚，萃取3 次除去油脂。向剩余水層中加入等體積二氯甲烷，萃取3 次合并減壓濃縮后，真空冷凍干燥得到二氯甲烷萃取相（F1）3.33 g。向剩余水層中加入等體積乙酸乙酯，萃取3 次后合并減壓濃縮后，真空冷凍干燥得到乙酸乙酯萃取相（F2）4.98 g。再向剩余水層加入等體積正丁醇，萃取3 次，合并減壓濃縮后，真空冷凍干燥得到正丁醇萃取相（F3）8.94 g。萃取后的剩余水層在減壓濃縮后，真空冷凍干燥得到水相（F4）47.86 g。

1.3.2 花椒果皮總酚和總黃酮含量的測定

使用福林-酚法測定花椒果皮多酚各組分中的總酚，分別移取0.5 mg/mL花椒各組分多酚溶液各1 mL于比色管中，加入0.5 mL福林-酚試劑和6.5 mL水，靜置2 min后，再加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液，渦旋振蕩1 min，70 ℃水浴中反應(yīng)10 min，在暗處靜置1 h后，立刻在750 nm波長條件下使用紫外-可見分光光度計(jì)測定吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總酚含量，以每克干質(zhì)量的沒食子酸當(dāng)量表示總酚值[16]。

總黃酮的測定采用亞硝酸鈉-三氯化鋁法。分別移取0.5 mL待測液，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL振蕩搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL振蕩搖勻，放置6 min后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，加乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，使用紫外-可見分光光度計(jì)在波長510 nm處測定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總黃酮值。以每克干質(zhì)量的蘆丁當(dāng)量表示總黃酮值。

1.3.3 超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析

將F1、F2、F3、F4的凍干粉末和多酚標(biāo)準(zhǔn)品分別用適量75%甲醇溶液（色譜純）溶解，經(jīng)過0.22 μm尼龍66濾頭過濾后上樣。

超高壓液相色譜測定條件：T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A：水（色譜純）；流動(dòng)相B：乙腈（色譜純）。梯度洗脫條件：0～5 min，99% A、1% B；5～15 min，99%～50% A、1%～50% B；15～25 m i n，50%～10% A、50%～90% B；25～30 min，10% A、90% B。

質(zhì)譜測定條件：電噴霧離子源為負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1500；鞘氣流速45 arb；輔助氣體流速15 arb；噴霧電壓-3.6 kV；毛細(xì)管溫度400 ℃；full MS分辨率70000；MS/MS分辨率17500；碰撞能量20/40/60 eV。

定性和定量的數(shù)據(jù)處理軟件為PeakViewTM2.0譜圖數(shù)據(jù)分析處理工作站。

1.3.4α-葡萄糖苷酶的抑制活性

按照Xu Yaqin等[17]的方法稍作修改，以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷為底物測定α-葡萄糖苷酶的活性。用PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）溶液將F1、F2、F3、F4和阿卡波糖配制成50～1000 μg/mL的系列樣品溶液。其中阿卡波糖作為陽性對(duì)照，PBS溶液（0.1 mol/L，pH 6.8）為陰性對(duì)照。首先將40 μL樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別加入48 孔板中與80 μLα-葡糖苷酶（1 U/mL）混合，37 ℃孵育5 min后，加入80 μL 2.5 mmol/L硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷底物以啟動(dòng)反應(yīng)。37 ℃反應(yīng)15 min，加入320 μL碳酸鈉（1.0 mol/L）終止反應(yīng)，立即在波長405 nm處測定吸光度，按式（1）計(jì)算抑制率。α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為樣品或陽性對(duì)照的吸光度。

利用SPSS分析軟件，根據(jù)樣品濃度和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率計(jì)算IC50值，樣品IC50值越低表明其對(duì)酶的抑制能力越強(qiáng)。

1.3.5α-葡萄糖苷酶的抑制類型的確定

根據(jù)Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的原理分析α-葡萄糖苷酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型的確定由Lineweaver-Burk圖在特定酶的濃度和反應(yīng)時(shí)間確定，硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的濃度范圍為0.5～10 mmol/L，按照1.3.4節(jié)方法測定，記錄底物質(zhì)量濃度及α-葡萄糖苷酶的反應(yīng)速率，依此繪制Lineweaver-Burk圖，同時(shí)計(jì)算米氏常數(shù)（Km）和最大初始反應(yīng)速率（Vm）。

1.3.6 熒光猝滅

將α-葡萄糖苷酶與各組分樣品在3 個(gè)不同的溫度（297.15、303.15、310.15 K）下混合后孵育5 min。295 nm的激發(fā)波長測定α-葡萄糖苷酶的發(fā)射熒光，并收集300～400 nm波長下酶的發(fā)射熒光，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為2.5 nm。結(jié)合常數(shù)（Ka）、熒光猝滅常數(shù)（Kq）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）的值按式（2）、（3）計(jì)算[18]。

式中：F0和F分別為加入花椒果皮多酚前后α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度（340 nm）；τ0為熒光團(tuán)的壽命（10-8s）；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)/（mL/mg）；Kq為猝滅速率常數(shù)/（mL/（mg·s））；[Q]為猝滅劑的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 II型糖尿病小鼠的造模和給藥

選擇健康雄性KM小鼠40 只，自由采食、自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為2 組，即空白對(duì)照組（n=8）和建模組（其余）。建模期間空白對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，建模組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，4 周后，將小鼠不禁水禁食12 h后，腹腔注射30 mg/kg的鏈脲佐菌素（鏈脲佐菌素溶解于冰浴的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，30 min內(nèi)注射于體內(nèi)），每3 d重復(fù)注射1 次，總共注射6 次。注射結(jié)束3 d后，將小鼠不禁水禁食12 h后，尾靜脈采血，使用血糖儀測定小鼠12 h空腹血糖，12 h空腹血糖大于11.10 mmol/L的小鼠判定為建模成功的二型糖尿病小鼠。將建模成功的小鼠按體質(zhì)量和血糖值隨機(jī)分為4 組，每組8 只，分別為低劑量組（100 mg/kg F3）、高劑量組（300 mg/kg F3）、陽性對(duì)照組（100 mg/kg鹽酸二甲雙胍）、模型對(duì)照組（等體積0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液），繼續(xù)喂養(yǎng)28 d，期間空白對(duì)照組給與等體積的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液灌胃，每天在同一時(shí)間給予不同劑量的受試物（鹽酸二甲雙胍和F3）進(jìn)行灌胃。

1.3.8 小鼠體質(zhì)量和攝食量、飲水量的測定

實(shí)驗(yàn)開始后，小鼠實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，自由采食，在每天的同一時(shí)間（15:00）測量小鼠的體質(zhì)量，監(jiān)測小鼠每日的體質(zhì)量變化，同一時(shí)間取出飼料及水瓶稱量，記錄每日小鼠攝食量和飲水量。

1.3.9 小鼠空腹血糖和口服糖耐量的測定

實(shí)驗(yàn)第0、5、10、15、20、25天同一時(shí)間從禁食8 h（9:00—17:00）小鼠的尾尖采血使用血糖儀測量小鼠的空腹血糖。

實(shí)驗(yàn)期結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h（21:00至次日9:00），給小鼠灌胃2 g/kg的葡萄糖溶液（用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液溶解），于灌胃后0、0.5、1 h和2 h，分別測定各時(shí)間點(diǎn)的血糖值并記錄為小鼠口服葡萄糖耐量，并按式（4）計(jì)算血糖曲線下面積：

式中：G0、G30、G60、G120分別為灌胃葡萄糖后0、0.5、1 h和2 h的血糖值/（mmol/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，并在5%置信水平下使用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量的測定

如表1所示，不同組分花椒果皮多酚的總酚和總黃酮含量具有顯著差異（P＜0.05），且呈現(xiàn)相同的趨勢，為F2＞F3＞F4＞F1。經(jīng)過分級(jí)萃取后，多酚類物質(zhì)主要富集于F2（總酚（351.769±2.512）mg/g，總黃酮（421.973±7.293）m g/g）、F 3（總酚（202.662±15.544）mg/g，總黃酮（321.793±2.225）mg/g）中，可能是因?yàn)榛ń分写蟛糠侄喾宇愇镔|(zhì)的極性和介電常數(shù)與乙酸乙酯和正丁醇的極性和介電常數(shù)接近，所以大部分多酚更易溶解在這2 種有機(jī)溶劑中而被分離開[19-20]，說明分級(jí)萃取能夠很好地富集花椒中的多酚類化合物。

表1 花椒果皮中總酚和總黃酮含量Table 1 Contents of total phenolics and total flavonoids in Z.bungeanum pericarps mg/g

2.2 超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法分析

使用超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)結(jié)合外標(biāo)法對(duì)花椒果皮多酚各組分進(jìn)行分析以確定其中多酚的種類及含量，結(jié)果如表2所示。共鑒定出20 種化合物，包括9 種酚酸及其衍生物和11 種黃酮類化合物（表3）。

表2 花椒果皮多酚各相中化合物的鑒定Table 2 Identification of phenolic compounds in Z.bungeanum pericarps

表3 花椒果皮多酚各相中化合物的含量Table 3 Contents of phenolic compounds in Z.bungeanum pericarps

黃酮類化合物是F2和F3中鑒定出化合物的主要成分，共鑒定出11 種黃酮類化合物，分別為表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、柚皮苷、槲皮苷、芹黃素、山柰酚、異鼠李素、山柰素。其中，蘆丁（13.200 g/kg）是F3中黃酮類化合物的主要成分，占F3鑒定出黃酮類化合物含量的74.55%。蘆?。?.044 g/kg）和槲皮苷（4.577 g/kg）是F2中黃酮類化合物的主要成分，分別占F2鑒定出黃酮類化合物含量的30.82%和34.89%。Yang Lichen等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，花椒葉片的黃酮類化合物中金絲桃苷（886.36 g/kg）含量較高而表兒茶素（77.80 g/kg）和蘆?。?9.41 g/kg）的含量較低。Yu Li等[22]報(bào)道奉賢大紅袍花椒和秦安一號(hào)花椒中蘆丁含量分別為14.175 g/kg和12.728 g/kg，含量與F3中的蘆丁含量接近。Ma Yao等[12]研究中發(fā)現(xiàn)花椒果皮乙酸乙酯提取物含有金絲桃苷含量65.1 mg/kg，遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)F2中金絲桃苷的含量（1885 mg/kg），這可能是本研究中分級(jí)萃取時(shí)乙酸乙酯對(duì)金絲桃苷有富集效果。

對(duì)于酚酸及酚酸衍生物，從花椒果皮多酚各組分中共鑒定出9 種酚酸及酚酸衍生物：沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、原兒茶醛、阿魏酸和對(duì)香豆酸。F2和F3中鑒定出的總酚酸含量顯著高于F1和F4，分別為7.064 g/kg（35.00%）和5.106 g/kg（22.38%），其中綠原酸為F2和F3鑒定出的酚酸中的主要成分，占到60.88%和89.32%。這與Bhatt[23]和Yang Lichen[21]等在花椒葉片多酚和Yu Li等[22]在花椒果皮多酚中鑒定出的結(jié)果一致，說明綠原酸是花椒酚酸的主要成分。Ma Yao等[12]乙酸乙酯提取的花椒果皮提取物中，綠原酸（0.5 mg/kg）和對(duì)香豆酸含量（7.7 mg/kg）顯著低于本實(shí)驗(yàn)乙酸乙酯相F2中的綠原酸（4.300 g/kg）和對(duì)香豆酸（1.56 g/kg）含量，再次印證了分級(jí)萃取時(shí)乙酸乙酯對(duì)多酚的富集效果。

總之，不同組分多酚類化合物含量不同，但趨勢為F2＞F3＞F4＞F1，這與總酚和總黃酮含量的趨勢一致。因此，使用不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行分級(jí)萃取對(duì)不同極性的多酚類物質(zhì)能夠起到較好的富集作用。

2.3 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶是位于小腸絨毛表面的消化酶，可以催化寡糖、二糖和三糖水解為單糖從而可被人體吸收，是人類吸收碳水重要的消化酶[24]。因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以有效地降低二型糖尿病患者餐后血糖升高的峰值，調(diào)節(jié)餐后血糖水平[3,25]。由圖1可知，花椒果皮的4 個(gè)組分均對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用，且抑制率均呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。所有的4 個(gè)組分樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均低于阿卡波糖，其中F3（IC50=0.176 mg/mL）對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用明顯較強(qiáng)，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高可以達(dá)到85.86%，說明花椒果皮多酚中對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制較強(qiáng)的化合物極性可能中等偏高。

圖1 花椒果皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.1 Inhibitory effects of polyphenols from Z.bungeanum pericarps against α-glucosidase

采用SPSS 25.0軟件，對(duì)2.2節(jié)中鑒定出的花椒果皮多酚中含量較高的18 種化合物與花椒果皮多酚各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率進(jìn)行Pearson法相關(guān)性分析，由圖2可以看出，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷與對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率相關(guān)性較好，且具有極顯著相關(guān)性（P＜0.01），而槲皮苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率相關(guān)性較弱。結(jié)合2.2節(jié)的鑒定結(jié)果，蘆丁有可能是花椒果皮多酚中對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制貢獻(xiàn)較大的化合物，蘆丁已經(jīng)被證實(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用[26]，并且它在F3中含量較高，濃度更高更易與α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用，從而相比其他多酚更能發(fā)揮其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

圖2 花椒果皮多酚中主要成分與α-葡萄糖苷酶活性的抑制率相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between major phenolic components in Z.bungeanum pericarps and percentage of α-glucosidase inhibition

2.4 α-葡萄糖苷酶的抑制類型的確定

結(jié)合α-葡萄糖苷酶的活性抑制實(shí)驗(yàn)，選取對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用最強(qiáng)的組分F3，研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)，以確定花椒果皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

由圖3可以看出，隨著F3的質(zhì)量濃度增加，橫截距（-1/Km）降低，縱截距（1/Vm）增加。米氏常數(shù)（Km）和最大初始反應(yīng)速率（Vm）均下降，呈現(xiàn)出明顯反競爭性抑制作用的特征，這與報(bào)道的牡荊素的反競爭性抑制特征類似[27]?？梢酝茰yF3可能是與酶的活性位點(diǎn)入口部分結(jié)合，從而與酶和底物形成的中間產(chǎn)物結(jié)合，并阻止產(chǎn)物從酶的活性位點(diǎn)釋放出來，使可參與反應(yīng)的酶濃度下降，從而抑制α-葡萄糖苷酶的活性，所以出現(xiàn)Km和Vm均下降的現(xiàn)象[28]。

圖3 花椒果皮多酚F3對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用的Lineweaver-Burk圖Fig.3 Lineweaver-Burk plots of α-glucosidase inhibition by ZPP F3

2.5 花椒果皮多酚與α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅光譜分析

為了進(jìn)一步研究花椒果皮多酚與α-葡萄糖苷酶的相互作用，測量F3對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光光譜，并應(yīng)用Stern-Volmer方程做雙對(duì)數(shù)圖，計(jì)算Ksv、Ka值及n值，以研究花椒果皮多酚與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合機(jī)制、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)[29-30]。由圖4A可見，α-葡萄糖苷酶在295 nm波長的激發(fā)光激發(fā)后在340 nm左右處顯示出強(qiáng)烈的熒光發(fā)射峰。隨著體系中F3質(zhì)量濃度增加，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度均隨之降低，表明F3能夠與α-葡萄糖苷酶相互作用并猝滅其固有熒光的強(qiáng)度[31]。

圖4 不同質(zhì)量濃度F3對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光的影響（A）和不同溫度下F3對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的雙倒數(shù)圖（B）Fig.4 Effects of different concentrations of F3 (A) on α-glucosidase fluorescence and double reciprocal diagram of fluorescence quenching of α-glucosidase by F3 (B) at different temperatures

從圖4B表格可以看出，對(duì)于F3，Ka值隨著溫度升高而明顯升高，表明F3與酶的親和力隨著溫度的升高而變強(qiáng)，推測F3與α-葡萄糖苷酶的猝滅過程可能是放熱反應(yīng)。F3的n值在3 個(gè)溫度下接近1，表明F3與α-葡萄糖苷酶可以直接形成一對(duì)一的復(fù)合物[32]，而且n值在較高溫度下出現(xiàn)了一定程度的下降，可能是因?yàn)樵谳^高溫度下F3與α-葡萄糖苷酶的相互作用變得不穩(wěn)定或F3的猝滅能力受損[25]。

2.6 小鼠體質(zhì)量和攝食量、飲水量的測定

由表4可知，實(shí)驗(yàn)期間糖尿病小鼠均出現(xiàn)了多飲多食的現(xiàn)象，而高劑量組的小鼠的攝食量較模型對(duì)照組明顯下降，說明高劑量的F3可以緩解糖尿病小鼠的多食現(xiàn)象。相對(duì)于模型對(duì)照組，低劑量組、高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠飲水量沒有顯著性差異。由表4還可以看出，除了空白對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量增加外，其余各模型組均出現(xiàn)了一定程度的體質(zhì)量減輕，高劑量組的體質(zhì)量下降最少，說明高劑量的F3可能對(duì)糖尿病小鼠的體質(zhì)量減輕癥狀有一定的改善作用。

表4 給藥前后各組小鼠飲水量、攝食量和體質(zhì)量Table 4 Water intake,food intake and body mass of mice from different groups before and after administration

2.7 小鼠空腹血糖和口服糖耐量的測定

由表5可知，開始灌胃后，各模型組空腹血糖值均開始降低，而高劑量組的降低幅度最大，4 周后血糖下降64.2%，幅度接近陽性對(duì)照組（下降58.1%），顯著高于低劑量組（下降29.2%），表明F3對(duì)糖尿病小鼠長期的血糖有一定的改善作用，且體現(xiàn)出劑量依賴。

表5 各組小鼠口服糖耐量值和曲線下面積Table 5 Oral glucose tolerance and area under the curve in mice from different groups

由表6可知，在口服糖耐量實(shí)驗(yàn)中，所有小鼠在灌胃葡萄糖0.5 h后血糖均達(dá)到峰值，隨后開始緩慢下降，相比空白對(duì)照組，所有模型小鼠的血糖全程均高于同時(shí)期的空白對(duì)照組，而相對(duì)于模型對(duì)照組，低劑量組、高劑量組和陽性對(duì)照組均能夠降低灌胃葡萄糖后血糖的峰值，并且血糖下降更快。低劑量組、高劑量組和陽性對(duì)照組的曲線下面積也均低于模型對(duì)照組，高劑量組下降最明顯，相比模型對(duì)照組下降21.42%，說明F3和鹽酸二甲雙胍一樣能夠改善小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力，提高小鼠抗高血糖的能力[33]。

表6 小鼠灌胃期間各組空腹血糖值Table 6 Fasting blood glucose in mice from different groups during the oral treatment period

3 結(jié)論

重點(diǎn)分析花椒果皮中多酚成分的組成和降血糖活性，結(jié)果顯示，不同極性的有機(jī)溶劑萃取的花椒果皮多酚組分的多酚組成、含量及降血糖效果存在差異。通過分級(jí)萃取，花椒果皮中的多酚主要富集于乙酸乙酯萃取相（F2）和正丁醇萃取相（F3）中，總酚和總黃酮第二高的F3體外降血糖能力最強(qiáng)，從中鑒定出的主要酚酸綠原酸和主要黃酮蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率具有極顯著相關(guān)性。給與F3灌胃治療的糖尿病小鼠，其體質(zhì)量減輕和飲食異?，F(xiàn)象得到一定的改善，空腹血糖值和口服糖耐量也明顯降低。因此，花椒果皮多酚在體內(nèi)和體外條件下均具有降血糖的功效，有潛力成為預(yù)防和治療糖尿病的活性成分。