賈麗娜，馬 倩，王新月，葛艷艷，王 楠，何紅鵬，羅學(xué)剛，朱立穎，賈衛(wèi)國，郝力壯，齊 威,

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.四川省第五人民醫(yī)院，四川 成都 610014；4.青海省高原放牧家畜動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病患者的90%～95%，是一種發(fā)病率和患病率都呈現(xiàn)快速增長的全球性流行病[1]。2019年全球糖尿病地圖（第9版）報(bào)告指出，2019年全球約有4.63億20～79 歲的成人患糖尿病。其中，中國糖尿病患者數(shù)量排在了印度和美國前面，位居第一，達(dá)1.164億[2]。T2DM的發(fā)病是環(huán)境和遺傳因素相互作用的結(jié)果，環(huán)境因素的影響大于遺傳因素。大量研究證明，腸道微生物失調(diào)作為一個(gè)重要的環(huán)境因素，在糖尿病發(fā)展中起著重要作用[1]。T2DM現(xiàn)在已成為第一個(gè)被定義腸道菌群特征的人類慢性疾病[3]，因此，靶向調(diào)節(jié)腸道微生物可能是改善T2DM的有效策略[4]。

多糖是重要的天然高分子化合物，廣泛存在于藥食同源植物中，也是中藥水煎液的關(guān)鍵生物活性成分，具有降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生理作用，在改善T2DM等疾病方面發(fā)揮著重要作用[5]。由于人類基因組編碼的消化酶有限，多糖攝入人體后經(jīng)口、胃、小腸等器官通常不被消化，最終進(jìn)入結(jié)腸并被不同腸道微生物降解產(chǎn)生許多不同鏈長、結(jié)構(gòu)構(gòu)象和分支數(shù)量的低聚糖，這些低聚糖可以促進(jìn)有益菌的生長，如雙歧桿菌和擬桿菌[6]。同時(shí)，這些低聚糖還能夠被腸道菌群代謝形成多種生物活性物質(zhì)，如短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）、乳酸、氫和二氧化碳等，進(jìn)而影響宿主的生理狀態(tài)[7]。

大量研究報(bào)道植物多糖具有降血糖活性，雖然不同植物多糖的降糖機(jī)制存在差異，但其主要是在促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰島細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)胰島素敏感性、降低胰島素抵抗、提高抗氧化應(yīng)激能力、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面發(fā)揮作用，因此植物多糖可作為抗糖尿病的潛在藥物[8]。腸道菌群影響T2DM患者代謝的潛在機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面[9]：一是調(diào)節(jié)炎癥，總的來說T2DM與促炎細(xì)胞因子、趨化因子和炎性蛋白水平有關(guān)，一些腸道微生物及其代謝物可以通過促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子和趨化因子分泌，同時(shí)抑制促炎細(xì)胞因子的分泌預(yù)防和改善機(jī)體的炎癥反應(yīng)；二是降低腸道通透性，腸道通透性增加是T2DM的一個(gè)特征，它會(huì)導(dǎo)致腸道菌群代謝物易位進(jìn)入血液并引起代謝性內(nèi)毒素血癥，據(jù)報(bào)道，兩種對(duì)T2DM可能有益的擬桿菌（Bacteroides vulgatus和B.dorei）可通過調(diào)節(jié)結(jié)腸中緊密連接基因的表達(dá)，降低腸道通透性，減少脂多糖的生成，改善小鼠的內(nèi)毒素血癥[10]；三是葡萄糖代謝，腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)肝臟等主要代謝器官中的胰島素抵抗和葡萄糖穩(wěn)態(tài)，以及腸道中的消化和控糖激素的產(chǎn)生影響T2DM，例如一種潛在益生菌（Bifidobacterium lactis）可以增加糖原合成并降低肝臟糖異生相關(guān)基因的表達(dá)[11]；四是脂肪酸氧化、合成和能量消耗，增加脂肪酸氧化和能量消耗并減少脂肪酸合成可改善肥胖和T2DM，據(jù)報(bào)道，Akkermansia muciniphila、B.acidifaciens、Lactobacillus gasseri和SCFA會(huì)增加脂肪組織中的脂肪酸氧化[12]；五是細(xì)菌間的綜合作用，一些微生物可以通過增加其他潛在的有益微生物或通過交叉喂養(yǎng)影響宿主生理，如Bifodobacterium的幾個(gè)菌種與其他菌群（如Faecalibacterium和Roseburia）具有交叉喂養(yǎng)作用[13]，L.rhamnosus可以增加大鼠盲腸中Bifidobacterium的豐度[14]，L.casei可以增加產(chǎn)丁酸細(xì)菌的豐度[15]。

本研究采用體外發(fā)酵模型，分析黃芪多糖、蒼術(shù)多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖5 種植物多糖對(duì)T2DM患者糞便微生物及其產(chǎn)氣情況、SCFA和代謝物質(zhì)的影響，探究5 種多糖潛在的益生作用，以期為植物多糖與腸道菌群的相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪購買自甘肅岷縣，蒼術(shù)購買自內(nèi)蒙古自治區(qū)，玄參、烏梅購買自云南大理，紅棗購買自新疆和田地區(qū)。

無水乙醇 天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；核糖醇、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA）、甲氧胺鹽酸鹽 美國Sigma公司；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

-80 ℃冰箱 浙江捷盛低溫設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電子天平 美國康州電子科技有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；快速冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；GC9720 plus氣相色譜儀 浙江福立分析儀器股份有限公司；HL-QT01體外發(fā)酵氣體分析儀 蘇州海路生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取及成分測(cè)定

原料用粉碎機(jī)粉碎置于錐形瓶中，按1∶8（g/mL）加入蒸餾水，混合均勻后于90 ℃條件下水浴6～7 h，用3 層紗布過濾后6000 r/min離心10 min得粗多糖提取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低于65 ℃濃縮粗多糖提取液，之后緩慢加入5 倍量（V/V）的95%乙醇溶液，過夜沉降，8000 r/min離心10 min，收集沉淀，靜置揮發(fā)殘留乙醇，-80 ℃預(yù)凍多糖溶液24 h以上后冷凍干燥，收集備用。黃芪多糖、蒼術(shù)多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖得率分別為9.48%、27.80%、5.62%、3.82%和10.40%。

對(duì)5 種多糖進(jìn)行簡單的成分測(cè)定：采用苯酚-硫酸法測(cè)得黃芪多糖、蒼術(shù)多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為65.73%、91.13%、87.35%、25.60%、81.90%；采用Bradford法測(cè)得黃芪多糖、蒼術(shù)多糖、玄參多糖、紅棗多糖和烏梅多糖蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.79%、1.58%、2.19%、0.35%、2.59%。

1.3.2 糞便樣本采集及體外發(fā)酵

本實(shí)驗(yàn)召集6 名志愿者，2 男4 女，年齡階段20～70 歲。實(shí)驗(yàn)分為2 組：NC組，3 名正常人；T2DM組，3 名糖尿病人。所有志愿者近3 個(gè)月正常飲食，在這3 個(gè)月內(nèi)沒有服用抗生素或益生菌等。研究人員對(duì)所有志愿者進(jìn)行了全面解釋，并獲得了書面同意。并經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，批準(zhǔn)號(hào)為2018（286）。

使用自動(dòng)糞便處理儀將新鮮糞便（0.8±0.02）g加入到8 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，處理成10 g/100 mL的糞便懸濁液。吸取500 μL懸浮液分別接種于酵母浸粉-水解酪蛋白-脂肪酸（yeast extract-casein hydrolysate-fatty acids，YCFA）培養(yǎng)基和添加5‰多糖的YCFA培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.3.3 16S rRNA基因測(cè)序

取發(fā)酵液4 ℃、12000 r/min離心10 min，菌體沉淀送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，完成16S rRNA基因測(cè)序。

1.3.4 代謝組分析

取發(fā)酵液4 ℃、12000 r/min離心10 min，取200 μL上清液，加入20 μL核糖醇（內(nèi)標(biāo)），真空冷凍干燥。凍干樣品中加入50 μL含甲氧胺鹽酸鹽（20 mg/mL）的吡啶溶液，在40 ℃水浴肟化反應(yīng)90 min，加入80 μL的MSTFA，在37 ℃水浴硅烷化反應(yīng)30 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾溶液除去雜質(zhì)后，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)[16]。利用NIST05譜庫初步鑒定成分，結(jié)合化學(xué)成分的實(shí)際成分和保留時(shí)間等進(jìn)行定性。采用面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.3.5 SCFA檢測(cè)

取500 μL發(fā)酵液加入100 μL巴豆酸偏磷酸溶液，振蕩混勻后-30 ℃酸化反應(yīng)24 h，隨后將樣品于4 ℃、10000 r/min離心3 min，上清液過0.22 μm濾膜，使用氣相色譜儀分析乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸。利用外標(biāo)法進(jìn)行絕對(duì)定量。

1.3.6 氣體成分測(cè)定

利用氣體分析儀檢測(cè)發(fā)酵后樣品小瓶中CO2、CH4、H2、H2S氣體的體積。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有樣品的測(cè)定均重復(fù)3 次。利用SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），采用GraphPrism 8軟件繪圖，利用SIMCA 14.1軟件和Metaboanalyst 5.0網(wǎng)站（http://www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物多糖對(duì)腸道菌群產(chǎn)氣情況的影響

人體腸道氣體圖譜在很大程度上取決于微生物組成和底物[17]，因此，利用體外發(fā)酵技術(shù)評(píng)估腸道微生物利用植物多糖產(chǎn)生的氣體情況。相較于正常人，T2DM患者腸道菌群發(fā)酵多糖產(chǎn)氣體積有所減少，CO2、H2、CH4、H2S含量也減少（表1）。不同植物多糖對(duì)腸道菌群代謝產(chǎn)氣作用有差異，烏梅多糖降低了各組的產(chǎn)氣體積和H2S產(chǎn)量，其余多糖組的產(chǎn)氣量均有增加。5 種多糖均能降低NC組的H2S含量。5 種多糖均能提高T2DM組的CO2和CH4含量，降低H2S含量，紅棗多糖能夠提高T2DM組H2含量。T2DM患者腸道微生物發(fā)酵蒼術(shù)多糖產(chǎn)生的CO2含量最高，發(fā)酵紅棗多糖產(chǎn)生CH4、H2和H2S含量最高。結(jié)果表明添加植物多糖能夠影響腸道菌群產(chǎn)氣情況，因此，植物多糖可能通過調(diào)節(jié)腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的氣體成分及含量對(duì)宿主產(chǎn)生影響。

表1 植物多糖對(duì)腸道菌群體外發(fā)酵產(chǎn)氣的影響Table 1 Effects of plant polysaccharides on gas production by fermentation of intestinal bacteria in vitro

2.2 植物多糖對(duì)腸道菌群產(chǎn)生SCFA的影響

T2DM患者腸道菌群體外發(fā)酵產(chǎn)生SCFA水平顯著低于正常人（表2）。5 種植物多糖均能夠提高T2DM組的SCFA總量、丁酸、戊酸、異丁酸和異戊酸含量，尤其是以黃芪多糖、蒼術(shù)多糖和玄參多糖效果顯著。紅棗多糖、蒼術(shù)多糖對(duì)T2DM組乙酸具有一定的調(diào)節(jié)作用，分別提高了20.29%、75.01%。紅棗多糖、黃芪多糖、蒼術(shù)多糖和玄參多糖對(duì)T2DM組丙酸具有一定的調(diào)節(jié)作用，分別提升了130.80%、259.06%、185.33%和248.01%。SCFA作為腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物，介導(dǎo)人體和腸道微生物之間的相互作用。SCFA是腸道菌群與宿主之間信號(hào)傳遞的重要物質(zhì)，能夠增強(qiáng)屏障功能、維持免疫系統(tǒng)健康和降低腸腔內(nèi)的氧含量等功能，對(duì)糖尿病具有益處[18]。植物多糖能夠影響腸道菌群代謝乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等含量，且可能通過調(diào)節(jié)腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的SCFA成分及含量對(duì)宿主產(chǎn)生影響。

表2 植物多糖對(duì)SCFA濃度的影響Table 2 Effects of plant polysaccharides on SCFA contents μmol/mL

2.3 植物多糖對(duì)腸道菌群代謝組的影響

利用氣相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)所有樣品的代謝物進(jìn)行分析，共檢測(cè)到105 種代謝產(chǎn)物，其中包括有機(jī)酸類（39 種）、氨基酸類（23 種）、糖類（2 種）、醇類（12 種）、酯類（2 種）、酚類（1 種）、核酸類（3 種）、胺類（9 種）。應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析方法，結(jié)果顯示樣品能明顯區(qū)分，說明不同處理組的代謝物有差異，菌群的代謝情況發(fā)生改變（圖1）。

圖1 正交偏最小二乘判別分析圖Fig.1 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis

與NC組相比，T2DM患者腸道菌群體外發(fā)酵組17 種代謝物發(fā)生了顯著變化：木糖醇、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、尸胺、焦谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、D-焦谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、乳酸、5-氨基戊酸。其中前16 種代謝物相對(duì)于NC組顯著上調(diào)，5-氨基戊酸顯著下調(diào)。顯著性差異代謝物主要與氨基酸代謝通路相關(guān)，包括谷胱甘肽代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷氨酰胺和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，酪氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化。

多糖處理能夠改變T2DM患者菌群體外發(fā)酵的代謝圖譜。烏梅多糖、紅棗多糖、玄參多糖、黃芪多糖和蒼術(shù)多糖處理組都顯著上調(diào)了乳酸、D-焦谷氨酸，下調(diào)了尸胺。值得注意的是，不同多糖對(duì)代謝的影響存在差異性。黃芪多糖組上調(diào)了丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸，下調(diào)了尸胺；蒼術(shù)多糖組上調(diào)了甘氨酸、亮氨酸，下調(diào)了脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、尸胺；玄參多糖組下調(diào)了纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸；烏梅多糖組上調(diào)了木糖醇，下調(diào)了纈氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸；紅棗多糖組上調(diào)了甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，下調(diào)了苯丙氨酸、脯氨酸。

2.4 植物多糖對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 多樣性分析

如圖2所示，曲線平緩顯示測(cè)序的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。α多樣性分析常用Chao指數(shù)和ACE指數(shù)衡量群落豐富度，這兩個(gè)指數(shù)越高表明微生物的豐度越高。如圖3所示，T2DM組與NC組間的α多樣性指數(shù)無顯著差異，這與已報(bào)道的研究結(jié)果一致[19]；經(jīng)過多糖處理后，α多樣性指數(shù)也無明顯差異。如圖4所示，β多樣性分析顯示不同處理組樣品兩兩分離，說明不同處理組的微生物組成存在差異性，腸道菌群組成發(fā)生了一定程度的改變。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves

圖3 α多樣性分析Fig.3 α Diversity analysis

圖4 主坐標(biāo)分析Fig.4 PCoA analysis

2.4.2 腸道微生物組成分析

Venn圖是統(tǒng)計(jì)多個(gè)組別中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，可以比較直觀地看出不同環(huán)境樣本中物種組成情況。腸道菌群在屬水平上分布的結(jié)果見圖5，NC組共152 個(gè)屬、T2DM組含有108 個(gè)屬，黃芪多糖+NC組含有122 個(gè)屬（特有屬5 個(gè)）、黃芪多糖+T2DM組102 個(gè)屬（特有屬11 個(gè)），烏梅多糖+NC組含有180 個(gè)屬（特有屬27 個(gè)）、烏梅多糖+T2DM組含有138 個(gè)屬（特有屬18 個(gè)），蒼術(shù)多糖+NC組含有128 個(gè)屬（特有屬4 個(gè)）、蒼術(shù)多糖+T2DM組含有93 個(gè)屬（特有屬7 個(gè)），紅棗多糖+NC組含有128 個(gè)屬（特有屬10 個(gè)）、紅棗多糖+T2DM組含有93 個(gè)屬（特有屬2 個(gè)），玄參多糖+NC組含有129 個(gè)屬（特有屬4 個(gè)）、玄參多糖+T2DM組含有102 個(gè)屬（特有屬7 個(gè)）。

圖5 Venn圖分析Fig.5 Venn diagram analysis

腸道菌群在種水平上分布的結(jié)果顯示，NC組共252 個(gè)種、T2DM組含有171 個(gè)種、黃芪多糖+NC組含有207 個(gè)種（特有種12 個(gè)）、黃芪多糖+T2DM組167 個(gè)種（特有種18 個(gè)），烏梅多糖+NC組含有298 個(gè)種（特有種49 個(gè)）、烏梅多糖+T2DM組含有212 個(gè)種（特有種29 個(gè)），蒼術(shù)多糖+NC組含有219 個(gè)種（特有種11 個(gè)）、蒼術(shù)多糖+T2DM組含有154 個(gè)種（特有種9 個(gè)），紅棗多糖+NC組含有217 個(gè)種（特有種17 個(gè)）、紅棗多糖+T2DM組含有157 個(gè)種（特有種8 個(gè)），玄參多糖+NC組含有230 個(gè)種（特有種4 個(gè)）、玄參多糖+T2DM組含有167 個(gè)種（特有種7 個(gè)）。不同多糖處理組樣品間微生物組成存在差異，植物多糖發(fā)酵可能對(duì)微生物菌落結(jié)構(gòu)和物種組成有影響。

2.4.3 腸道微生物相對(duì)豐度顯著差異的分析

腸道菌群在門水平上組成主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）。由圖6A可知，5 種植物多糖都提高了Firmicutes豐度、提高了NC組Bacteroidota豐度、降低了T2DM組Bacteroidota豐度。烏梅多糖顯著降低了Actinobacteriota豐度。5 種植物多糖降低Bacteroidota豐度，并增加Firmicutes豐度，與滇黃精中的總多糖作用類似，多糖可以在門水平上改善腸道的微生態(tài)環(huán)境[20]。

由圖6 B 可知，與T2 DM 組相比，植物多糖+T2DM組均提高了Faecalibacterium、Roseburia的豐度，降低了Escherichia的豐度，表明5 種多糖能夠富集Faecalibacterium、Roseburia；同時(shí)除烏梅多糖外，其他多糖均能夠提高M(jìn)egamonas的豐度；黃芪多糖+T2DM組提高Bifidobacterium、Bacteroides、Akkermansia豐度，降低Ruminococcus豐度；玄參多糖+T2DM組提高Bacteroides豐度；紅棗多糖+T2DM組提高Bifidobacterium、Akkermansia豐度，降低Ruminococcus豐度；烏梅多糖+T2DM組提高Blautia的豐度；蒼術(shù)多糖+T2DM組提高Bifidobacterium、Akkermansia豐度。Escherichia coli能夠促進(jìn)糖尿病，而Akkermansia和Bifidobacterium對(duì)T2DM具有改善作用，B.longum、B.infantis、B.Animals、B.carinii、B.brevis等都顯示對(duì)糖耐量有所改善[3,21]。簡言之，植物多糖能夠改善菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益微生物的生長，抑制有害微生物的增長。

圖6 群落組成分析Fig.6 Analysis of intestinal microbial composition

2.4.4 腸道菌群功能預(yù)測(cè)

對(duì)測(cè)序結(jié)果樣本中微生物群落的功能組成進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖7），豐度較高的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路包括氨基酸生物合成、氨基酸和核苷酸糖代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、碳代謝、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、嘌呤代謝。此外，與T2DM組相比，紅棗多糖+T2DM、蒼術(shù)多糖+T2DM、烏梅多糖+T2DM組下調(diào)了苯丙氨酸代謝。黃芪+T2DM組下調(diào)了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等代謝通路。紅棗+T2DM組下調(diào)了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)等代謝通路。氨基酸代謝與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[22]。多糖可能通過影響腸道菌群的氨基酸代謝途徑，進(jìn)一步對(duì)宿主發(fā)揮作用。

圖7 KEGG功能豐度統(tǒng)計(jì)Fig.7 KEGG functional abundance statistics

2.5 多組學(xué)聯(lián)合分析

應(yīng)用多組學(xué)聯(lián)合分析，對(duì)NC、T2DM和加糖實(shí)驗(yàn)組的腸道菌群與氣體成分、SCFA和差異性代謝物繪制熱圖（圖8）。玄參多糖組中甘氨酸與Ruminococcus呈正相關(guān)；戊酸與Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；異丁酸與Alistipes呈正相關(guān)；異戊酸與Phascolarctobacterium、Eggerthella、Escherichia-Shigella、Negativibacillus呈正相關(guān)；5-氨基戊酸與Phascolarctobacterium、Bilophila呈正相關(guān)；尸胺與Dorea呈正相關(guān)；H2與Collinsella呈負(fù)相關(guān)，與Subdoligranulum、Klebsiella呈正相關(guān)；H2S與Dorea、Escherichia-Shigella、Enterococcus正相關(guān)，與Bifidobacterium呈負(fù)相關(guān)；丙酸與Desulfovibrio呈正相關(guān)。

圖8 相關(guān)性熱圖分析Fig.8 Correlation heatmap

黃芪多糖組中甘氨酸與Lactobacillus、Bifidobacterium呈正相關(guān)，與E.coli、Escherichia-Shigella呈負(fù)相關(guān)；乳酸與Phascolarctobacterium呈負(fù)相關(guān)；丙氨酸與Desulfovibrionaceae呈負(fù)相關(guān)；異丁酸與Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；5-氨基戊酸與Lactobacillales、Megasphaera呈正相關(guān)；戊酸與Clostridium_sensu_stricto_1、Oscillospiraceae_UCG-002、Romboutsia、Megasphaera、unclassified_o__Lactobacillales、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；丁酸與unclassified_o__Lactobacillales、Megasphaera、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；L-脯氨酸與Veillonella呈正相關(guān)；尸胺與Eggerthella、Escherichia-Shigella、Dorea呈正相關(guān)；H2與Subdoligranulum呈正相關(guān)，與Lactobacillus呈負(fù)相關(guān)；H2S與Lactobacillus呈負(fù)相關(guān)，與Escherichia-Shigella呈正相關(guān)。

蒼術(shù)多糖組中乳酸與Lachnospiraceae呈負(fù)相關(guān)；丙酸與Monoglobus呈負(fù)相關(guān)；H2與Lactobacillus呈負(fù)相關(guān)，與Subdoligranulum、Klebsiella呈正相關(guān)；H2S與Subdoligranulum呈正相關(guān)；戊酸與Oscillospiraceae_UCG-005、Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；異丁酸與Oscillospiraceae_UCG-002、Bilophila呈正相關(guān)，異戊酸與Dorea、Escherichia-Shigella、Phascolarctobacterium、Bilophila、unclassified_f__Desulfovibrionaceae呈正相關(guān)；5-氨基戊酸與Phascolarctobacterium、Bilophila、unclassified_f__Desulfovibrionaceae呈正相關(guān)；L-酪氨酸與Megamonas呈負(fù)相關(guān)；木糖醇與Escherichia-Shigella、Parabacteroides呈正相關(guān)；尸胺與Dorea、Eggerthella呈正相關(guān)；DL-苯丙氨酸與Streptococcus、Veillonella呈正相關(guān)；纈氨酸與Intestinibacter呈正相關(guān)；異亮氨酸與Eubacterium_hallii_group、Intestinibacter、Ruminococcus呈正相關(guān)；甘氨酸與Monoglobus、Intestinibacter呈正相關(guān)；D-焦谷氨酸與Streptococcus呈正相關(guān)；鳥氨酸與Rombutzia、Oscillospiraceae_UCG-002呈負(fù)相關(guān)。

烏梅多糖組中甘氨酸與Anaerostipes、Lactobacillus、Ruminococcus呈正相關(guān)；谷氨酸與Bilophila呈負(fù)相關(guān)，與Lachnospiraceae_ND3007_group呈正相關(guān)；H2S與Enterococcus、Escherichia-Shigella、Parabacteroides呈正相關(guān)，與Anaerostipes、Lactobacillus、Blautia、Lachnospira、Faecalibacterium、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-001 呈負(fù)相關(guān)；丙酸與Agathobacter、Lachnospiraceae_UCG-001呈負(fù)相關(guān)；L-脯氨酸與Enterococcus、Escherichia-Shigella呈正相關(guān)，與Agathobacter、Faecalibacterium、Roseburia、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-001呈負(fù)相關(guān)；尸胺與Escherichia-Shigella呈正相關(guān)，與Lachnospiraceae_UCG-001呈負(fù)相關(guān)；異丁酸與Bilophila呈正相關(guān)；乙酸與Parabacteroides呈正相關(guān)，與Lachnospiraceae_UCG-001呈負(fù)相關(guān)；異戊酸與Bilophila、Phascolarctobacterium呈正相關(guān)；5-氨基戊酸與Bilophila、Phascolarctobacterium呈正相關(guān)；H2與Anaerostipes、Lachnospira呈負(fù)相關(guān)；纈氨酸與Lachnospiraceae呈負(fù)相關(guān)；苯丙氨酸與Lachnospiraceae、Sutterella呈負(fù)相關(guān)；焦谷氨酸與Lachnospira、Faecalibacterium、Roseburia、norank_f__Ruminococcaceae呈負(fù)相關(guān)，與Bifidobacterium呈正相關(guān)；L-酪氨酸與Parabacteroides呈正相關(guān)，與Faecalibacterium呈負(fù)相關(guān)；戊酸與Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；異亮氨酸與Sutterella呈負(fù)相關(guān)。

紅棗多糖組中H2S與Dorea、Escherichia-Shigella呈正相關(guān)；戊酸與Romboutsia、Ruminococcus、Oscillospiraceae_UCG-002、Megasphaera、unclassified_o__Lactobacillales呈正相關(guān)；異丁酸與Oscillospiraceae_UCG-002呈正相關(guān)；異戊酸與Phascolarctobacterium、Bilophila呈正相關(guān)；尸胺與Dorea呈正相關(guān)；5-氨基戊酸與Desulfovibrionaceae、Phascolarctobacterium、Bilophila呈正相關(guān)；甘氨酸與Lactobacillus呈正相關(guān)；乳酸與Lachnospiraceae、Faecalibacterium、Lachnospira、Ruminococcus_torques_group呈負(fù)相關(guān)；谷氨酸與Sutterella呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

腸道菌群被稱為“第二個(gè)人類基因組”，作為機(jī)體的一種內(nèi)部環(huán)境因素，它能調(diào)節(jié)人體內(nèi)的新陳代謝，起到多種作用[9]。正常生理狀態(tài)下，這些微生物與人體共生，相互依賴且相互制約，保持動(dòng)態(tài)平衡，以此維持人類身體健康。如果出現(xiàn)病理因素將這種平衡打破時(shí)，就會(huì)引起糖尿病等諸多疾病。多糖作為腸道菌群的碳源，能夠促進(jìn)有益菌群生長，同時(shí)多糖能夠被腸道菌群碳水化合物活性酶分解后轉(zhuǎn)化為次生代謝物或發(fā)酵產(chǎn)物被機(jī)體吸收，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞增殖和凋亡，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，改變宿主代謝[23]。腸道菌群對(duì)多糖的利用降解是多糖活性的基礎(chǔ)，因此，以腸道菌群為媒介，探索多糖的作用機(jī)制是研究多糖功能的主要方向之一。

在本研究中，通過腸道菌群功能預(yù)測(cè)和代謝數(shù)據(jù)揭示了5 種植物多糖能夠調(diào)節(jié)微生物組成，進(jìn)一步影響產(chǎn)氣情況、氨基酸代謝和SCFA代謝通路，與之前有關(guān)報(bào)道一致[24]。盡管許多研究分析了不同人群的腸道菌群與T2DM的關(guān)系[25]，但糖尿病人和健康人腸道菌群差異方面的研究結(jié)果不一致。Larsen等[26]發(fā)現(xiàn)，T2DM患者中Firmicutes和梭菌類的比例顯著降低；而巴基斯坦的一項(xiàng)基于60 人的數(shù)據(jù)顯示，T2DM患者的Firmicutes、梭菌門和陰性菌門占主導(dǎo)地位[27]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的Firmicutes和Actinobacteriota的相對(duì)豐度均有增加，而Bacteroidota相對(duì)豐度則有降低，條件致病菌和硫酸鹽還原菌富集，雙歧桿菌和擬桿菌等益生菌和丁酸鹽產(chǎn)生菌減少[28]。Le等[29]發(fā)現(xiàn)，T2DM患者腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量明顯低于健康人，而糞腸球菌數(shù)量高于健康人。另一方面，Doumatey等[30]報(bào)道T2DM患者的豐富度顯著降低，β多樣性指標(biāo)的顯著差異，而Ahmad[27]和Chavez-Carbajal[25]等觀察到α多樣性指數(shù)沒有顯著差異。在本研究中，α多樣性分析T2DM患者菌群豐度與正常人相比無顯著變化，5 種植物多糖干預(yù)T2DM患者菌群豐度也無顯著差異；β多樣性分析5 種植物多糖干預(yù)正常人和T2DM患者的菌群組成在一定程度上有所改變，同時(shí)提高了兩組的Firmicutes豐度、降低了T2DM組Bacteroidota豐度，這些變化被認(rèn)為與通過幫助宿主消化多糖或激活A(yù)MP激活的蛋白激酶加速能量吸收和體重增加有關(guān)[31]。黃芪多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bifidobacterium、Bacteroides、Akkermansia豐度，降低Ruminococcus豐度。玄參多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bacteroides豐度。紅棗多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bifidobacterium、Akkermansia的豐度，降低Ruminococcus豐度。烏梅多糖+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Blautia菌的豐度。蒼術(shù)+T2DM組提高Faecalibacterium、Roseburia、Megamonas、Bifidobacterium、Akkermansia的豐度。Bifidobacterium、Bacteroides、Faecalibacterium為腸道益生菌，Roseburia和Faecalibacterium是丁酸產(chǎn)生菌 。Roseburia可以改善葡萄糖耐受性[33]。Roseburia、Faecalibacterium、Akkermansia和Blautia與T2DM呈負(fù)相關(guān)，而Ruminococcu與T2DM呈正相關(guān)[9]。乳酸桿菌可能參與糖尿病發(fā)展中的慢性炎癥，與葡萄糖、糖化血紅蛋白呈顯著正相關(guān)[28]。Akkermansia可能是一種潛在的治療糖尿病的益生菌，由于其在黏蛋白降解過程中的特殊表現(xiàn)，已成為腸道與宿主細(xì)胞之間的黏膜界面上的關(guān)鍵生物，與炎癥性腸病、肥胖、結(jié)腸炎、T2DM和其他代謝紊亂有關(guān)[21]。

腸道菌群能夠通過代謝產(chǎn)生CO2、H2、CH4、H2S等氣體介質(zhì)對(duì)宿主健康產(chǎn)生影響。CO2和H2是微生物發(fā)酵碳水化合物過程中產(chǎn)生的主要?dú)怏w，CH4則是由大腸中古生菌代謝CO2和H2產(chǎn)生。H2S和含硫微量氣體是還原硫酸鹽和亞硫酸鹽的硫還原細(xì)菌發(fā)酵蛋白質(zhì)產(chǎn)生的[34]。腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生氣體的同時(shí)也會(huì)消耗氣體，H2主要被產(chǎn)甲烷菌、產(chǎn)乙酸菌和硫酸鹽還原菌所利用；H2和CO2被產(chǎn)乙酸細(xì)菌利用產(chǎn)生乙酸，還能夠被產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)生CH4。H2是碳水化合物發(fā)酵的主要?dú)怏w標(biāo)記物，用于診斷碳水化合物吸收不良或小腸細(xì)菌過度生長，H2S也是蛋白質(zhì)發(fā)酵的一個(gè)潛在有用的生物標(biāo)志物。H2S可以直接通過中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)。一般認(rèn)為，腸道微生物群產(chǎn)生的H2很容易通過飲食調(diào)節(jié)，CH4的生成則更強(qiáng)烈地依賴于微生物群組成[17]。相比較于NC組，T2DM患者腸道菌群產(chǎn)氣體積減低，添加黃芪、蒼術(shù)、玄參、紅棗多糖能夠提高腸道菌群的產(chǎn)氣含量。烏梅多糖能夠降低各組的H2S產(chǎn)量，研究表明利用膳食纖維干預(yù)腸道菌群降解H2S有助于調(diào)節(jié)宿主糖代謝、改善T2DM 。

腸道菌群的改變可以調(diào)節(jié)SCFA和氨基酸的含量，改善腸道內(nèi)環(huán)境，預(yù)防和治療糖尿病[36]。乙酸、丙酸和丁酸是腸道菌群利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，是腸上皮細(xì)胞的重要能量來源，而屬于支鏈SCFA的異丁酸和異戊酸主要由分支氨基酸和到達(dá)結(jié)腸時(shí)未被消化的蛋白質(zhì)被腸道微生物發(fā)酵利用所產(chǎn)生[37]。乙酸和丙酸主要由Bacteroidota產(chǎn)生，而大量的丁酸來自Firmicutes 。乙酸是含量最多的SCFA，作為能量來源參與機(jī)體代謝，它能到達(dá)外周組織，尤其是脂肪和肌肉，用于膽固醇代謝和脂肪合成，影響人體食欲。腸道微生物產(chǎn)生的丁酸可以改善機(jī)體的胰島素反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)，具有抗炎和抗癌作用。丙酸能夠調(diào)節(jié)膽固醇的合成，但是丙酸異?？赡軙?huì)增加T2DM的風(fēng)險(xiǎn)，但是丙酸與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)之間的因果關(guān)系仍需要進(jìn)一步的研究[33]。擬桿菌屬和雙歧桿菌屬能夠產(chǎn)生乙酸和丁酸，乙酸和丁酸與對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合，并誘導(dǎo)下游的胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、酪酪肽的分泌，通過對(duì)胰腺功能以及胰島素釋放的影響，最終發(fā)揮降低血糖的作用[39]。此外，本研究數(shù)據(jù)也與之前的研究相符合，SCFA與產(chǎn)氣之間可能存在某種平衡[17]。5 種多糖發(fā)酵導(dǎo)致較多還原性丁酸的產(chǎn)生，也導(dǎo)致較多的還原劑H2的產(chǎn)生，增加了總體產(chǎn)氣量。多糖體外發(fā)酵影響T2DM患者腸道菌群氨基酸通路，丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸和己糖水平與T2DM風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)，并且T2DM可能會(huì)改變患者體內(nèi)的酪氨酸和丁酸水平，調(diào)節(jié)酪氨酸代謝和丁酸的產(chǎn)生可能是改善T2DM預(yù)防的一種潛在方法[40]。苯丙氨酸代謝與胰島素抵抗有關(guān)，可能增加T2DM的風(fēng)險(xiǎn)[41]。在T2DM患者中，腸道菌群細(xì)胞膜對(duì)糖和支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)更為活躍，但丁酸的合成減少，與促炎反應(yīng)直接相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)激增。植物多糖可以通過糾正腸道菌群失調(diào)恢復(fù)腸道微生物生態(tài)、促進(jìn)產(chǎn)SCFA微生物的富集、提高SCFA水平 。黃芪多糖、蒼術(shù)多糖和玄參多糖提高了T2DM組的乙酸、丁酸、丙酸水平。

4 結(jié)論

基于T2DM患者腸道菌群和植物多糖體外發(fā)酵模型，分析5 種植物多糖對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝圖譜的影響。本研究結(jié)果可以篩選得到更具有糖尿病功能食品潛力的植物多糖。在氣體成分方面，黃芪多糖、蒼術(shù)多糖、玄參多糖和紅棗多糖均能夠提高T2DM組的總氣體介質(zhì)含量以及CO2和CH4含量，降低H2S含量，而烏梅多糖降低了總氣體介質(zhì)；在SCFA方面，黃芪多糖、蒼術(shù)多糖、玄參多糖調(diào)節(jié)T2DM組總酸的含量更為顯著；在代謝物質(zhì)方面，5 種多糖均能夠上調(diào)氨基酸等有益代謝物質(zhì)；在腸道菌群方面，5 種多糖均能夠調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌的豐度。綜合結(jié)果來看，蒼術(shù)多糖、玄參多糖和黃芪多糖更具有發(fā)展為糖尿病功能食品的可能性。參照最新的藥食同源名錄，發(fā)現(xiàn)黃芪在特定的范圍和劑量內(nèi)可作為藥食兩用，蒼術(shù)和玄參也均在可用于保健食品的中藥名單中，因此這3 種植物多糖在功能性食品開發(fā)方面具有廣闊前景，但是否能夠真正開發(fā)為功能食品，還需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)。本研究為植物多糖對(duì)慢性代謝類疾病產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。