栗俊廣，張旭玥，王 昱,2，禹 曉,2，龐 杰，陳歷水，白艷紅,

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.河南省冷鏈食品質(zhì)量與安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450000；3.中原食品實驗室 鄭州輕工業(yè)大學，河南 漯河 462000；4.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；5.漯河市衛(wèi)龍生物技術有限公司，漯河市食品安全與營養(yǎng)健康重點實驗室，河南 漯河 462000）

肉制品加工中，凝膠特性是決定其感官品質(zhì)的重要功能特性[1]。其中，多糖類常被當作肌肉蛋白凝膠增強劑或者脂肪代替物[2]，不僅可以改善肉制品的感官品質(zhì)，還可以平衡膳食營養(yǎng)[3]。魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是從魔芋塊莖中提取的一種水溶性、非離子性、高分子質(zhì)量的中性多糖[4]，具有降低膽固醇、增強飽腹感、預防高血壓和降血脂的功效[5]。KGM由1∶1.6的D-葡萄糖和D-甘露糖殘基組成，在C-6位置約有5%～10%的乙?；〈?。乙?；cKGM的凝膠特性和增稠特性密切相關，沒有脫除乙?；鶗r，KGM只能形成熱可逆凝膠[6]，且黏度較大，限制了其在食品加工中的應用。脫乙酰魔芋葡甘聚糖（deacetylated konjac glucomannan，DKGM）不但可以形成熱不可逆凝膠[7]，還能改善KGM的黏彈性。Xu Lilan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DKGM可以提高雞肉糜的凝膠硬度，降低烹飪損失；Xu Yongxia等[9]報道DKGM可以與魚肌球蛋白交聯(lián)形成耐熱復合物，從而提高凝膠強度。因此，DKGM在肉制品加工中具有廣泛的應用價值。

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）作為肌肉中最重要的蛋白質(zhì)，不僅影響肉的嫩度，同時還決定著肉糜類制品的凝膠性能[10]。熱誘導凝膠過程中，MP結(jié)構(gòu)和化學作用力變化是決定蛋白凝膠性能（如凝膠強度、持水力）的重要因素[11]。MP在加熱過程中去折疊化，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，暴露內(nèi)部活性基團，活性基團間相互作用形成分子間作用力，從而使蛋白質(zhì)交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成是蛋白質(zhì)之間相互吸引，維持平衡的結(jié)果，且凝膠的形成主要依靠分子間的氫鍵、離子鍵、二硫鍵以及疏水相互作用[11]。多糖被認為是改善低脂重組肉制品適口性的最有效和最經(jīng)濟的脂肪替代品，因此，研究多糖與蛋白質(zhì)之間的相互作用機制至關重要。近年來，大多數(shù)研究集中在多糖對凝膠品質(zhì)的影響，而從結(jié)構(gòu)和分子力的角度出發(fā)，探究DKGM對豬肉MP凝膠特性的影響機理還鮮有報道。

本實驗研究不同添加量DKGM對MP凝膠強度和持水力的影響，同時利用傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、冷場掃描電子顯微鏡等手段，分析DKGM對MP二級結(jié)構(gòu)、微觀構(gòu)像、水分分布及分子間作用力的影響，為DKGM在肉制品中的應用提供一定理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉 鄭州某超市；KGM 上海源葉生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Ultra-turrax T25高速分散器 德國IKA公司；AB265-S分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Avanti J-26s XPI高速冷凍離心機 美國Beckman公司；Lab-1-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；FE-SEM冷場掃描電子顯微鏡、F-7000熒光光度計日本日立公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System公司；NM120低場核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；Vertex傅里葉變換紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；Well水浴恒溫搖床 江蘇省蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DKGM制備

參考李晶[12]的方法并稍作修改。在蒸餾水中加入適量Na2CO3（Na2CO3與KGM質(zhì)量比為0.12∶1），完全溶解后，加入KGM，使其質(zhì)量濃度為4 g/100 mL。1500 r/min攪拌2 h，靜置2 h，用2 倍體積的75%乙醇溶液和蒸餾水（pH值調(diào)整到7左右）交替洗滌沉淀物，室溫揮干乙醇，冷凍干燥后得到DKGM。參照Du Xuezhu等[13]的方法，測得DKGM的脫乙酰度為92.87%。

1.3.2 豬肉MP提取

參照Li Junguang等[14]的方法。將新鮮豬肉絞碎后，先后分別與4 ℃、pH 7.0的提取緩沖液（含1×10-5mol/L Na2HPO4、2×10-6mol/L MgCl2、0.1 mol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸）和4 ℃、0.1 mol/L NaCl洗滌液按1∶4（g/mL）混合并均質(zhì)，4 ℃、3000×g離心3 次，每次15 min，得到MP。用雙縮脲法測定MP質(zhì)量濃度。

1.3.3 DKGM-MP混合凝膠制備

將不同添加量的DKGM（0%、0.125%、0.25%、0.5%、1%，m/m）加入到4 ℃、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、5×10-5mol/L Na2HPO4/NaH2PO4）中，攪拌均勻后加入MP（質(zhì)量濃度30 mg/mL），10000 r/min勻漿30 s。將混合后的樣品以5 ℃/min的速率從20 ℃加熱到80 ℃，80 ℃維持20 min，得到DKGM-MP混合凝膠。

1.3.4 持水力的測定

將凝膠樣品放入離心管中，4 ℃、10000×g離心10 min，棄去上清液，按下式計算凝膠持水力：

式中：m為離心后凝膠樣品的質(zhì)量/g；M為離心前凝膠樣品的質(zhì)量/g。

1.3.5 凝膠強度的測定

使用TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)分析儀測定樣品的凝膠強度，條件設置如下：探頭為P/0.5，測試前、測試中、測試后速率分別為2、1、2 mm/s，壓縮比為40%，觸發(fā)力5 g。

1.3.6 水分分布測定

參照栗俊廣等[15]的方法。使用低場核磁共振儀對MP凝膠中的氫質(zhì)子密度進行成像掃描，結(jié)果用Osiris軟件進行偽彩處理。

1.3.7 內(nèi)源性熒光測定

根據(jù)Li Ke等[16]的方法并稍作修改。參數(shù)設置如下：激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長280～500 nm，狹縫寬度2.5 nm，掃描速率1200 nm/min。將MP懸浮液調(diào)節(jié)至0.1 mg/mL后進行掃譜并記錄其內(nèi)源性熒光強度。

1.3.8 活性巰基含量測定

參照Ellman[17]的方法。將MP溶液稀釋至4 mg/mL，將1 mL MP溶液與4 mL pH 7.0緩沖液（含1×10-5mol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.6 mol/L NaCl）混合，加入100 μL 1×10-5mol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，4 ℃避光條件下繼續(xù)反應1 h。在412 nm波長處測定吸光度。1.36×104作為摩爾消光系數(shù)，按下式計算MP活性巰基含量：

式中：D為稀釋倍數(shù)；A為MP溶液在412 nm處的吸光度；C為MP質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜掃描

將凝膠樣品冷凍干燥并通過80 目篩，將1 mg樣品和100 mg干燥的KBr加入瑪瑙研缽并壓制成片。使用傅里葉變換紅外光譜儀上在4000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)對樣品進行掃描，分辨率為4 cm-1。使用PeakFit v.4.12軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.10 凝膠分子力測定

參照王昱[18]的方法。5 種不同變性溶液：0.05 mol/L NaCl（S1）、0.6 mol/L NaCl（S2）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（S3）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（S4）以及0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/Lβ-巰基乙醇（S5）。將切碎的凝膠樣品分別與5 種變性溶液按質(zhì)量比1∶5混合，10000 r/min均質(zhì)2 min，4 ℃保持1 h，10000×g離心15 min。取上清液，用Bradford法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，計算離子鍵（S2和S1之差）、氫鍵（S3和S2之差）、疏水相互作用（S4和S3之差）和二硫鍵（S5和S4之差）的含量。

1.3.11 微觀結(jié)構(gòu)觀察

參照Zhou Feibai等[19]的方法。升華時間為12 min，5 mA下濺射60 s后，在1 kV加速電壓下使用冷場掃描電子顯微鏡觀察MP凝膠結(jié)構(gòu)，并在放大3000 倍下拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 DKGM對MP凝膠持水力和凝膠強度的影響

如表1所示，添加DKGM后，凝膠的持水力先上升后下降，添加量為0.25%時達到最大值。研究表明，持水力與凝膠系統(tǒng)中的氫鍵含量密切相關，而持水力的小幅度增強可能是由于DKGM改善了凝膠系統(tǒng)中分子間的作用力[20]，形成了更穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，使其保持水分的能力增強，但去除乙?；腒GM水溶性減小[21]，DKGM可以使MP疏水性劇烈增加，導致蛋白質(zhì)過度展開或聚集，從而導致MP凝膠的持水力不會大幅度增強。樣品的凝膠強度隨著DKGM質(zhì)量分數(shù)的增加而增大，0.25%時達到峰值后略微減小，這與Yuan Li等[21]的研究結(jié)果類似，表明DKGM可以通過促進蛋白質(zhì)的聚集從而增強魚糜的凝膠強度。凝膠系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)與多糖相互作用是提高凝膠變形和破裂力的原因[22]，去除乙?；腒GM不僅排除了空間位阻效應[23]，同時也促進了MP的去折疊，暴露了更多的活性基團（疏水基團、活性巰基），改善了凝膠系統(tǒng)中多糖與蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)間的相互作用，從而形成了更穩(wěn)固的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。

表1 DKGM添加量對MP凝膠持水力和凝膠強度的影響Table 1 Effect of DKGM addition on water-holding capacity and gel strength of MP gels

2.2 DKGM對MP凝膠水分分布的影響

如圖1所示，通過低場核磁成像得到了凝膠內(nèi)部的氫質(zhì)子分布情況，從紅到藍依次代表水分含量的減少[24]，氫質(zhì)子密度與凝膠強度和持水力密切相關，對照組顯示出更強的氫質(zhì)子密度，且分布最均勻，這與持水力和凝膠強度的結(jié)果一致。Li Zhiyu等[25]表示，DKGM作為一種“活性填料”，可以與蛋白發(fā)生非特異性相互作用，從而減緩水的流動性，并在凝膠系統(tǒng)中捕獲更多的水分子。

圖1 不同DKGM添加量的MP凝膠水分分布Fig.1 Moisture distribution of MP gels with different amounts of DKGM added

2.3 DKGM對MP內(nèi)源性熒光的影響

300～450 nm波長處的熒光光譜可以表征MP分子中疏水殘基附近的微環(huán)境變化[26]。如圖2所示，添加DKGM后，最大熒光發(fā)射波長紅移，表明更多色氨酸殘基暴露于極性環(huán)境中[27]，DKGM的加入改變了蛋白的三級結(jié)構(gòu)，將先前掩埋的疏水基團和結(jié)合位點暴露在外。熒光強度與最大熒光發(fā)射波長的結(jié)果相似，對照組的熒光強度最小，表明DKGM與MP之間發(fā)生了一定的相互作用，在一定程度上改變了色氨酸環(huán)境的敏感程度，改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)像，促進了蛋白質(zhì)的展開，從而影響了MP凝膠特性。

圖2 不同DKGM添加量的MP熒光光譜Fig.2 Endogenous fluorescence spectra of MP with different amounts of DKGM added

2.4 DKGM對MP活性巰基含量的影響

巰基含量常用于反映蛋白質(zhì)的二硫鍵生成情況、折疊或空間構(gòu)像的改變情況[28]，大多數(shù)分布在肌球蛋白頭部，暴露的巰基基團是形成凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的先決條件，在維持蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)中起重要作用。由圖3可知，添加DKGM后，MP的活性巰基含量顯著增加（P＜0.05），表明DKGM可以促進MP的去折疊，使蛋白質(zhì)展開，暴露內(nèi)部的活性巰基，從而在加熱過程中氧化形成更多二硫鍵，穩(wěn)定MP的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。DKGM質(zhì)量分數(shù)超過0.25%時，活性巰基含量呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于完全展開的蛋白質(zhì)更傾向于形成大的聚集體[22]，從而使活性巰基重新被掩埋。

圖3 不同DKGM添加量的MP活性巰基含量Fig.3 Contents of active sulfhydryl groups in MP with different amounts of DKGM added

2.5 DKGM添加量對MP凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可知，加入DKGM后，α-螺旋相對含量顯著降低（P＜0.05），α-螺旋主要由分子中羥基氧和羥基氫之間形成的氫鍵穩(wěn)定[29]。β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量明顯升高，Liu Ru等[30]研究表明更多β-折疊和β-轉(zhuǎn)角可以提高凝膠的凝膠強度和儲能模量。DKGM可以促進α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變，有益于凝膠的形成。這一結(jié)果也說明了DKGM可以促進α-螺旋結(jié)構(gòu)的展開，誘導MP的去折疊反應，暴露更多疏水基團和活性巰基，從而影響其分子間作用力，形成更密集的三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，這與三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果相呼應。

圖4 不同DKGM添加量的MP凝膠二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure composition of MP gels with different amounts of DKGM added

2.6 DKGM對MP凝膠分子力的影響

蛋白質(zhì)分子間的作用力對凝膠網(wǎng)絡的形成十分重要，其中包括離子鍵、氫鍵、疏水相互作用以及二硫鍵的作用。Xu Yongxia等[9]表明疏水相互作用是形成凝膠的主要驅(qū)動力，而氫鍵會對穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。如圖5所示，疏水相互作用和二硫鍵是MP凝膠中的主要作用力，DKGM的添加不會影響凝膠系統(tǒng)中離子鍵的相對含量，而氫鍵的相對含量減小。α-螺旋由氫鍵穩(wěn)定，DKGM的加入加速了α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變，因此破壞了凝膠系統(tǒng)中的氫鍵。添加DKGM后疏水相互作用相對含量顯著提高（P＜0.05）。這是由于乙?；娜コ黾恿薉KGM的疏水性，促使MP中疏水基團的暴露，從而促進MP熱誘導凝膠過程中蛋白質(zhì)的展開，導致蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間以及蛋白質(zhì)和DKGM間的疏水相互作用增強[8]，而過量的DKGM可能會導致MP表面疏水性劇烈增加從而導致蛋白質(zhì)重新聚集，在加熱過程中疏水相互作用減小。二硫鍵的結(jié)果與活性巰基的結(jié)果相呼應，MP的去折疊化使活性巰基暴露，導致加熱過程中氧化形成了更多二硫鍵，二硫鍵和疏水相互作用的共同作用使MP形成了更好的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。

圖5 不同DKGM添加量的MP凝膠分子力Fig.5 Molecular forces of MP gels with different amounts of DKGM added

2.7 DKGM對MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖6所示，所有樣品都具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表明凝膠具有彈性行為。圖中黑色孔徑代表水分通道[31]。放大3000 倍后，對照組的孔徑較大，且孔徑分布不均勻；添加DKGM后，凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密且均勻。且添加量為0.25%時，凝膠壁厚增加，DKGM均勻分布在三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。添加量達到0.5%時，雖然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密，但斷裂較多，壁厚減??；添加量達到1%時，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)大片斷裂，水分通道再次增大，凝膠的持水能力與水分通道的分布有關，水分通道越小，結(jié)構(gòu)斷裂越少則持水力越好[32]，這與持水力的結(jié)果一致。加熱過程中，蛋白質(zhì)展開并發(fā)生相互作用，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果說明DKGM促進了蛋白質(zhì)的展開，從而促進了蛋白質(zhì)分子間以及蛋白質(zhì)和DKGM之間的相互交聯(lián)，且DKGM可以充當“基質(zhì)”填充在三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，但DKGM添加量過多時，DKGM會破壞原有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且可能由于蛋白質(zhì)過度展開從而導致其更傾向于重新聚集，對凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成負面影響。

圖6 不同DKGM添加量的MP凝膠的冷場電鏡掃描圖Fig.6 Cold-field scanning electron micrographs of MP gels with different amounts of DKGM added

3 結(jié)論

研究不同添加量DKGM對MP凝膠強度和持水力的影響，同時利用傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、冷場掃描電子顯微鏡等手段，分析DKGM對MP二級結(jié)構(gòu)、微觀構(gòu)像、水分分布及分子間作用力的影響。結(jié)果表明，DKGM可以通過改善MP的結(jié)構(gòu)特性影響分子間作用力，從而增強其凝膠強度和持水力，且在質(zhì)量分數(shù)為0.25%時效果最佳；DKGM的添加可以加速MP的去折疊，導致疏水基團的暴露和活性巰基的增加；二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，DKGM可以誘導加熱過程中更多α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變；分子力結(jié)果顯示，添加DKGM后MP凝膠中氫鍵的相對含量減少，二硫鍵和疏水相互作用的相對含量增加；DKGM通過改善MP的結(jié)構(gòu)特性使MP凝膠水分通道減小，形成了更加致密的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，但DKGM添加量過大時，MP原有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，且蛋白的過度變性可能致使其重新聚集，導致凝膠強度和持水力下降。