王 夢， 孫 岳， 楊安寧， 寶 瑞， 暢思容， 李媛媛， 余夢雪， 劉志宏△

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點實驗室，寧夏 銀川 750004）

隨著遺傳因素以及當(dāng)今生活方式等因素的變化，非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題，全球有25%到30%的人口患有不同程度的脂肪肝［1］。NAFLD是在沒有過量飲酒情況下發(fā)生的一系列肝臟疾病，從異位脂質(zhì)儲存形式的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的炎癥和纖維化。NAFLD的特點是肝臟中脂質(zhì)異常堆積。有研究表明，幾種蛋氨酸代謝產(chǎn)物，包括S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine， SAM）、S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine， SAH）和同型半胱氨酸（homocysteine， Hcy），是肝臟脂質(zhì)水平的關(guān)鍵決定因素［2］。與非NAFLD患者相比，NAFLD患者具有更高的SAM、SAH和Hcy水平及更低的SAM/SAH比值［3］。Hcy是一種含硫氨基酸，是半胱氨酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物，血漿Hcy水平升高造成高Hcy血癥，隨之會引起脂質(zhì)代謝紊亂。肝臟是Hcy主要代謝場所，肝臟中的巨噬細胞在維持正常生理下的肝臟穩(wěn)態(tài)以及在NAFLD向NASH的進展中促進炎癥和介導(dǎo)纖維化方面發(fā)揮著重要作用。

肝臟巨噬細胞的代謝方式?jīng)Q定著其炎癥表型，即促炎巨噬細胞依賴于糖酵解，而抗炎巨噬細胞的功能主要依賴于氧化磷酸化。丙酮酸脫氫酶E1 α1亞基（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1， PDHA1）為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的關(guān)鍵E1亞單位，在糖酵解和三羧酸循環(huán)之間占據(jù)重要的位置。PDHA1基因缺乏導(dǎo)致線粒體功能障礙并促進糖酵解［4］。已有研究表明，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物和乳酸脫氫酶是治療急性肝功能衰竭的靶點［5］。SIRT3的缺失使高度賴氨酸乙?；腜DHA1酶活性降低，導(dǎo)致細胞內(nèi)乳酸積累，降低了巨噬細胞內(nèi)pH值，從而調(diào)節(jié)巨噬細胞分泌NLRP3和IL-1β水平［6］。通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶 1（pyruvate dehydrogenase kinase 1， PDK1）增強丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase， PDC）活性來重編程癌癥代謝，可增加對包括非小細胞肺癌在內(nèi)的幾種癌細胞系的抗癌作用，降低PDHA1活性會誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡［7-8］。在NAFLD中，當(dāng)肝細胞達到其脂質(zhì)儲存閾值時，脂毒性和肝細胞應(yīng)激也會導(dǎo)致細胞凋亡［9］。但NAFLD中肝臟巨噬細胞PDHA1表達水平的變化能否影響肝細胞凋亡的發(fā)生，目前尚不清楚。因此，我們構(gòu)建了巨噬細胞特異性PDHA1缺失小鼠，探討巨噬細胞PDHA1對NAFLD中肝細胞凋亡的影響，為NAFLD的防治提供參考資料。

材料和方法

1 實驗動物

6只SPF級雄性巨噬細胞特異性PDHA1敲除（PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ）小鼠和 6 只同背景的雄性 C57BL/6J小鼠，6周齡，體重18～22 g，均購自北京唯尚立德科技有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0009］，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

2 試劑與儀器

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）檢測試劑盒（C010-2-1）和甘油三酯（triglyceride， TG）測試盒（A110-1-1）均購于南京建成科技有限公司；全蛋白提取試劑盒（KGP250）和BCA蛋白定量試劑盒（KGP902）均購于南京凱基生物有限公司；總RNA提取試劑盒（DP419）購于北京天根生化科技有限公司；Bax抗體（ab32503）、caspase-3抗體（ab184787）和β-actin抗體（ab8226）均購自Abcam；山羊抗小鼠抗體（ZB-2305）和山羊抗兔抗體（ZB-2301）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

光學(xué)顯微鏡（型號：DM2000）購自Leica；分光光度計（型號：DS-11）購自DeNovix；酶標儀（型號：130412C）購自BioTek；實時定量熒光PCR儀（型號：qTOWER3G）購自Analytik Jena。

3 實驗方法

3.1 實驗動物飼養(yǎng)和分組 隨機選取體重相近的雄性野生型（wild-type， WT）和PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ小鼠各6只。將小鼠飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心。環(huán)境相對濕度50%左右，溫度（25±2） ℃，保證無菌環(huán)境。分籠給予2%高蛋氨酸飲食，喂養(yǎng)12周后進行后續(xù)試驗。

3.2 動物取材與處理 將小鼠禁食12 h后，異氟烷吸入麻醉后，眼球取血，室溫靜置2 h，1 000×g離心15 min，取血清，取各組小鼠肝臟組織，一部分用4%多聚甲醛固定用于制備石蠟切片，一部分用OCT冰凍切片包埋劑固定后，液氮速凍，于-80 ℃保存，用于冰凍切片。剩余組織-80 ℃保存，用于后續(xù)實驗。

3.3 小鼠基因型鑒定 剪取小鼠腳趾約0.5 cm放置入200 μL無菌EP管中，并標記對應(yīng)耳標號。加入裂解液和蛋白酶K，55 ℃水浴過夜裂解，95 ℃變性后，10 000×g離心5 min，取上清為提取的DNA，分別加入Lyz2-Cre和PDHA1-flox基因上下游引物，用PCR儀擴增DNA片段，在進行瓊脂糖凝膠電泳，將擴增后的DNA片段與DNA marker比較，Lyz2-Cre大小為749 bp，PDHA1-flox大小為297 bp。

3.4 小鼠骨髓細胞提取及骨髓來源巨噬細胞分化 分離取出小鼠的股骨，無菌條件下，放入含有75%酒精的細胞培養(yǎng)皿中，分離去除周圍結(jié)締組織，然后移入含有1× PBS的培養(yǎng)皿中清洗，最后再將其轉(zhuǎn)移另一個含有1%雙抗的DMEM的細胞培養(yǎng)液中。隨后，用眼科剪去除股骨的兩端，然后用含有2 mL DMEM細胞培養(yǎng)液的注射器，從骨其中一個斷端沖洗骨髓細胞到10 mL離心管中，重復(fù)3次，1 000×g離心8 min，棄上清液。加入5 mL紅細胞裂解液，吸管反復(fù)吹打，然后靜置3 min。1 000×g離心8 min，棄上清液。加入5 mL DMEM細胞培養(yǎng)液重懸細胞，然后用40 μm細胞濾器過濾細胞。1 000×g離心 8min，棄上清液，重復(fù)3次。加入含有20 μg/L M-CSF、10%FBS和1%青-鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液重懸細胞，誘導(dǎo)骨髓細胞分化為巨噬細胞。細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至 1×109L-1［10］。

3.5 Western blot檢測小鼠原代巨噬細胞中PDHA1蛋白表達 提取小鼠骨髓來源巨噬細胞全蛋白，紫外分光光度計測量蛋白濃度，并且統(tǒng)一蛋白濃度為5 g/L，每管蛋白加占比25%的上樣緩沖液后，高溫變性，每孔加入8 μL蛋白樣品，進行SDS-PAGE。

3.6 小鼠血清Hcy和ALT水平檢測 將每組組小鼠禁飲食12 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉后，眼球取血，室溫靜置2 h，分離血清。將血清樣本交于金域醫(yī)學(xué)檢驗集團股份有限公司，應(yīng)用全自動生化儀檢測血清中Hcy和ALT水平。

3.7 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色 取材后，將肝臟投入4%多聚甲醛中固定，固定成功后梯度酒精脫水，隨后將置于二甲苯中以替換酒精。用已經(jīng)融化好的石蠟包埋脫水透明的組織，待冷卻凝固成塊后，切片、展片、烤片。將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，貼于載玻片上。使用二甲苯將石蠟切片進行脫蠟，然后再使用梯度酒精進行水化，以便染料可以進入組織。蘇木精染料進行染色，蒸餾水沖洗切片洗去染料，再用0.1%鹽酸乙醇進行分化，然后水洗去多余染料，伊紅液染色，染色完成后用流水洗去多余染料。水洗完后用從低到高濃度的梯度酒精進行脫水。隨后用二甲苯進行透明，用樹脂進行封片，上鏡觀察拍照。

3.8 肝組織上清液中TG水平檢測 稱取肝組織，加入9倍體積的無水乙醇，冰浴條件下勻漿，1 000×g離心10 min，勻漿介質(zhì)用無水乙醇提取，取上清液。采用微板法，在96孔板上按照測試盒說明書進行操作后，37 ℃溫箱孵育10 min后，酶標儀測定波長510 nm的吸光度，代入標準曲線公式算得肝組織中TG含量。

3.9 肝組織上清液中ALT檢測 稱取肝組織，加入9倍體積的生理鹽水，冰浴條件下勻漿，1 000×g離心10分鐘，取上清液，生理鹽水稀釋到適宜濃度。采用微板法，在96孔板上按照測試盒說明書進行操作后，酶標儀測定波長510 nm的吸光度，代入標準曲線公式算得肝組織中ALT活性［11-12］。

3.10 凋亡指標的檢測 （1） qRT-PCR：提取肝臟組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)為cDNA。通過Primer Bank官網(wǎng)設(shè)計目的基因引物。Bax的上游引物序列為5'-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3'，下游引物序列為5'-AATTCGCCGGAGACACTCG-3'；caspase-3的上游引物序列為5'-CTCGCTCTGGTACGGATGTG-3'，下游引物序列為5'-TCCCATAAATGACCCCTTCATCA-3。以cDNA為模板，實時熒光定量PCR擴增目的基因。（2） Western blot：提取小鼠肝組織總蛋白，統(tǒng)一蛋白濃度為5 g/L，高溫變性后，每個蛋白樣本均上樣8 μL進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，2%的脫脂奶粉封閉2 h，分別用Bax和caspase-3特異性Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，用PBST洗膜，洗3次，每次10 min。后用HRP標記的Ⅱ抗孵育2 h，同上洗膜3次，發(fā)光液孵育后，取出PVDF膜于凝膠成像分析儀上進行曝光分析，以β-actin為內(nèi)參照，Image Lab對Bax與β-actin、caspase-3與β-actin灰度的比值進行分析比較。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間均數(shù)比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠基因鑒定結(jié)果

通過PDHA1flox/flox小鼠與Lyz2-Cre+/-小鼠交配得到7只子代幼鼠，剪取小鼠腳趾并裂解提取DNA，PCR分別擴增Lyz2-Cre和flox基因，瓊脂糖凝膠電泳進行基因鑒定，Lyz2-Cre目的條帶大小為749 bp，flox目的條帶大小為279 bp，第1、3、4、5、6、7號小鼠鑒定為PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ小鼠，見圖1。

Figure 1. Identification of mouse model with macrophage PDHA1 conditional knockout. A： PDHA1-flox gene locus identification result； B： Lyz2-Cre gene identification result. M： DNA marker； 1， 3， 4， 5， 6 and 7：PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ.圖1 巨噬細胞PDHA1條件性敲除小鼠模型的基因鑒定

2 小鼠骨髓來源巨噬細胞中PDHA1蛋白表達水平

Western blot結(jié)果顯示，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ小鼠骨髓來源巨噬細胞中PDHA1蛋白表達水平顯著低于WT小鼠（P＜0.01），見圖2。由上述結(jié)果可見，我們已成功構(gòu)建PDHA1條件性巨噬細胞敲除小鼠模型。

3 小鼠血清Hcy水平比較

高Hcy飲食后，WT+Hcy組血清Hcy水平高于正常飲食組，且巨噬細胞PDHA1特異性敲除后，血清Hcy水平比WT組升高（P＜0.05），見圖3。由此可見，小鼠高Hcy血癥模型構(gòu)建成功。

Figure 2. Verification of PDHA1 conditional knockout in mouse macrophages. The protein expression of PDHA1 in bone marrow macrophages was detected by Western blot. Mean±SD. n=6. **P＜0.01 vs WT group.圖2 小鼠巨噬細胞PDHA1條件性敲除的效果驗證

Figure 3. The serum level of Hcy in mice. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs WT group； #P＜0.05 vs WT+Hcy group.圖3 小鼠血清Hcy水平比較

4 小鼠肝組織TG水平比較

在給予12周高Hcy飲食后，WT+Hcy組和PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ+Hcy組小鼠肝組織上清液 TG 濃度顯著高于給予普通飲食的WT組和PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ組（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The concentration of TG in the liver tissue supernatant of mice. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs WT group； #P＜0.05 vs PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ group.圖4 各組小鼠肝組織上清液中TG濃度

5 小鼠肝臟血清及肝組織ALT水平比較

在給予 12 周高 Hcy飲食后，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ+Hcy組小鼠血清及肝組織上清液中ALT水平均高于WT+Hcy組（P＜0.05），見圖5。

6 小鼠肝組織切片HE染色結(jié)果

WT正常飲食組小鼠，肝細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常；與WT正常飲食組相比，高Hcy飲食導(dǎo)致小鼠肝組織內(nèi)肝細胞排列紊亂，且有脂肪空泡出現(xiàn)及少量炎性細胞浸潤；與WT正常飲食組小鼠相比，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ正 常 飲 食 組 小 鼠 肝 竇 排 列 較 紊 亂 ；PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ組小鼠經(jīng)高 Hcy飲食飼養(yǎng)后，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，且有大量脂肪空泡，中央靜脈周圍有大量炎性細胞浸潤，有肝細胞發(fā)生壞死，見圖6。

7 肝組織中Bax和caspase-3的mRNA表達水平

qRT-PCR 結(jié)果顯示，正常飲食下，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ組與WT組相比Bax和caspase-3的mRNA表達水平無顯著差異（P＞0.05）；但經(jīng)過高Hcy飲食飼養(yǎng)后，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ+Hcy 組較 WT+Hcy組 Bax和 caspase-3的mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05），見圖7。

8 肝組織中Bax和caspase-3的蛋白表達水平

Western blot結(jié)果顯示，正常飲食下，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ組與WT組相比Bax和caspase-3的蛋白表達水平無顯著差異（P＞0.05）；但經(jīng)過高Hcy飲食飼養(yǎng)后，PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ+Hcy組 Bax和 caspase-3蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），見圖8。

Figure 5. The ALT levels in serum（A） and liver tissue （B） of the mice. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs WT+Hcy group.圖5 小鼠血清及肝組織中ALT水平

討 論

NAFLD已逐漸成為主要的慢性肝病和嚴重的全球健康負擔(dān)，影響高達25%的世界人口。在中國，2018年NAFLD患病率達到32.9%，發(fā)病率大幅上升。NAFLD的特征是肝臟中脂肪沉積過多伴部分組織損傷或炎癥，最終導(dǎo)致肝硬化和與之相關(guān)的終末期肝病和肝細胞癌的風(fēng)險。肝臟作為蛋氨酸和脂質(zhì)代謝的主要部位，幾種蛋氨酸代謝產(chǎn)物，包括SAM、SAH和Hcy，是決定肝臟脂質(zhì)水平的關(guān)鍵因素［3］。

蛋氨酸代謝在肝細胞中高度活躍，且血清蛋氨酸及蛋氨酸代謝產(chǎn)物的水平影響著肝臟蛋氨酸的代謝活性［13］。因此，血清蛋氨酸代謝產(chǎn)物可作為肝臟蛋氨酸代謝的指標［14］。本研究觀察到給予高蛋氨酸飲食后，巨噬細胞特異性PDHA1敲除小鼠血清蛋氨酸代謝中間產(chǎn)物Hcy水平升高，而Hcy升高導(dǎo)致細胞脂質(zhì)代謝發(fā)生改變，促進肝臟脂肪堆積，從而使肝組織上清液TG水平升高［15］。因此，巨噬細胞PDHA1特異性缺乏可進一步加重NAFLD中肝臟脂質(zhì)堆積，使肝臟結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生損傷，影響其功能。

Figure 6. Pathomorphological changes of mice liver tissue sections （scale bar=50 μm）. In WT group （A）， the liver structure was normal. The arrangement of hepatic sinusoids in PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ group （B） was disordered. In WT+Hcy group （C）， a number of fat vacuoles and inflammatory cells infiltrated the mouse liver tissue. In PDHA1iΔMΦ/iΔMΦ +Hcy group （D）， the hepatic lobule structure was destroyed and some hepatocytes were necrotic.圖6 小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化

Figure 7. The mRNA expression levels of Bax （A） and casepase-3（B） in mouse liver tissues were detected by qRT-PCR. Mean±SD. n=6. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT+Hcy group.圖7 小鼠肝臟組織中Bax和caspase-3的mRNA表達水平比較

Figure 8. The protein expression levels of Bax （A） and casepase-3 （B） in mouse liver tissues were detected by Western blot. Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs WT+Hcy group.圖8 小鼠肝臟組織中Bax和caspase-3蛋白表達水平比較

在NAFLD的多因素發(fā)病機制中，肝細胞脂毒性和免疫介導(dǎo)的炎癥都起著關(guān)鍵作用。一些免疫細胞在疾病發(fā)生發(fā)展過程起重要作用，如肝星狀細胞的激活是應(yīng)激或凋亡的肝細胞和巨噬細胞發(fā)出信號的結(jié)果［16］。在其中，巨噬細胞是調(diào)控NAFLD發(fā)展的重要細胞亞群［17-18］。通過上述結(jié)果，我們觀察到，巨噬細胞PDHA1基因特異性敲除后給予高Hcy飲食，血清及肝組織上清液中ALT水平均升高，即肝臟損傷加重。而相同的巨噬細胞可能具有不同的功能，取決于局部組織環(huán)境，而糖代謝重編程是影響微環(huán)境的主要因素之一［19］。PDHA1是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的關(guān)鍵E1亞單位，在細胞能量代謝過程中起著重要的作用［20］。有研究證明，通過耗盡PDHA1使乳酸堆積誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活［21］。而炎癥激活將刺激巨噬細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，已有研究用體外實驗將極化的人和小鼠巨噬細胞重新編程，然后進行條件培養(yǎng)液實驗，誘導(dǎo)凋亡，比較巨噬細胞表型轉(zhuǎn)換前后的人和小鼠肝細胞抗凋亡能力［22］。通過檢測，我們觀察到在NAFLD小鼠模型中，巨噬細胞PDHA1特異性敲除后，可引起凋亡相關(guān)標志物表達增加。因此，我們將繼續(xù)探尋抑制巨噬細胞中PDHA1表達，是否通過調(diào)節(jié)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變，使巨噬細胞功能發(fā)生變化，從而導(dǎo)致肝細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，小鼠肝臟巨噬細胞中PDHA1的缺失可通過促進高Hcy飲食誘導(dǎo)的NAFLD中肝細胞的凋亡，這為進一步研究高Hcy誘導(dǎo)的NAFLD的發(fā)病機制提供了參考資料。