盛小飛， 王淑遠， 王新雨， 王肖婷， 田云娜， 宋正陽，徐俊鵬， 劉秀潔， 王萬鐵△

（1杭州市臨安區(qū)第一人民醫(yī)院消化內科，浙江 臨安 311300；2溫州市人民醫(yī)院呼吸內科，浙江 溫州325000；3溫州醫(yī)科大學缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035）

肺缺血-再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury， LIRI）是肺移植、肺溶栓治療、心臟外科手術和心肺復蘇后綜合征等疾病中常見的引起不良后果的危險因素。肺極易受到損傷，盡管在外科治療和免疫抑制方面取得了進展，但肺移植的結果是所有實體器官移植中最差的。肺移植的成功受限于高比例的原發(fā)性移植功能障礙，這是由于缺血-再灌注（ischemia-reperfusion， IR）損傷所致，其特征是強烈的氧化應激介導的組織損傷［1］。以往研究表明，氧化應激是引起脂質過氧化的主要病理機制之一，也是鐵死亡的特征之一［2-3］。脂質活性氧（reactive oxygen species， ROS）積累是鐵死亡的標志性特征。

缺血預處理（ischemia pre-conditioning， I-pre-C）作為一種經典的保護缺血-再灌注損傷的治療手段，有著明確的效應，但其機制一直未被明晰［4］。本研究從鐵死亡角度出發(fā)，初步探討鐵死亡是否在早期參與LIRI以及I-pre-C是否通過抑制鐵死亡發(fā)揮保護效應，為I-pre-C保護LIRI研究提供一種新的參考見解，對后續(xù)LIRI保護藥物的開發(fā)提供新的靶點。

材料和方法

1 實驗材料

6～8周齡SPF級雄性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，許可證號為SCXK（浙）2020-0184。所有大鼠都被置于恒溫和恒濕的條件下，晝夜循環(huán)12 h，并自由獲得食物和水。實驗前，大鼠被禁食過夜。所有動物實驗均經溫州醫(yī)科大學實驗動物中心機構動物倫理與使用委員會批準。丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及組織鐵檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、Triton X-100和Wester blot Ⅰ抗稀釋液均購自碧云天生物技術研究所。

2 實驗動物分組與處理

將實驗大鼠進行隨機分組4組：（1）對照（control）組：無特殊處理，術中僅暴露左肺，但不進行血流阻斷和再灌注，此組作為陰性對照組；（2）肺缺血-再灌注30 min手術組（IR組）：進行大鼠左肺門阻斷30 min后再灌注30 min，再灌注后麻醉狀態(tài)下處死大鼠；（3）鐵死亡抑制劑去鐵胺（deferoxamine， DFO）組（IR+DFO組）：術前1 h 腹腔注射100 mg/kg DFO，再進行大鼠肺缺血-再灌注手術（同IR組）；（4）I-pre-C組：進行大鼠左肺門阻斷前，夾閉左肺門5 min再灌注5 min，重復3次后，再進行左肺門夾閉30 min后再灌注30 min。

3 實驗方法

3.1 檢測肺損傷相關指標GSH、MDA和組織鐵按照試劑盒所提供的說明書所述步驟進行操作。

3.2 肺組織病理學觀察 將大鼠肺組織固定在4%多聚甲醛固定24～48 h，然后流水沖洗過夜，進行常規(guī)脫水、包埋入塊、制備組織切片，厚約5 μm，再進行HE染色，于熒光顯微鏡觀察獲取免疫熒光圖像，由ImageJ量化；處死小鼠并用預冷的PBS（pH 7.4）漂洗肺臟，取出部分肺組織并在含有2.5%戊二醛的0.1 mol/L PBS（pH 7.4）中浸泡過夜，使用振動刀將目標組織切成50 μm厚的切片，選定區(qū)域在1%四氧化鋨中后固定1 h，在分級乙醇系列中脫水，并嵌入環(huán)氧樹脂中，聚合在80 ℃下進行24 h，切割超薄切片（100 nm），用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，并在JEM2000EX透射電子顯微鏡下觀察。

3.3 肺組織超氧陰離子水平檢測 冷凍肺臟切片（8 μm）置于玻片上，用二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）在37 ℃的黑暗容器中孵育30 min。PBS沖洗3次后，熒光顯微鏡觀察并采集圖像，由ImageJ軟件量化。

3.4 Western blot檢測肺組織?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4， ACSL4）、轉鐵蛋白受體 1（transferrin receptor 1， TFR1）、鐵蛋白重鏈 1（ferritin heavy chain 1， FTH1）和谷胱甘肽過氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4， GPX4）蛋白水平 150 mg肺組織經研磨機研磨后，加入900 μL含PMSF的RAPI裂解液（VPMSF∶VRAPI=1∶100），研磨結束后每隔10 min漩渦15 s，置于冰上，共3次。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測所收集的上清液的蛋白總濃度，酶標儀測量吸光度。將測量好的蛋白樣品以每孔10 μg的蛋白上樣量進行SDS-PAGE，并轉膜至PVDF膜后將其置于5%脫脂牛奶中室溫下?lián)u床封閉1 h。加Ⅰ抗，4 ℃過夜孵育，第2天取出PVDF膜，TBST漂洗5 min×4次后，加Ⅱ抗于室溫下孵育2 h后，TBST漂洗5 min×4次。配制化學發(fā)光液，將漂洗后的PVDF膜置于曝光儀中，滴加發(fā)光液，利用熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraghPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。所有的計量資料均以均數±標準差（mean±SD）表示。多組樣本間的比較應用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較首先進行正態(tài)性檢驗，根據方差齊性檢驗結果選擇不同組間比較方法，方差齊性，選擇Student-test，方差不齊選擇Mann-Whitney-U-test。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 鐵死亡參與了大鼠LIRI

Western blot結果顯示，與control組相比，IR組TFR1和ACSL4水平上升，SLC7A11、FTH1和GPX4水平下降；與IR組相比，DFO能夠顯著降低TFR1和ACSL4的水平并且增加SLC7A11、FTH1和GPX4的水平（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. TFR1， ACSL4， SLC7A11， FTH1 and GPX4 protein levels in the lungs of rats in each group. Mean±SD.n=5. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs IR group.圖1 各組大鼠肺部TFR1、ACSL4、SLC7A11、FTH1和GPX4蛋白水平

2 抑制鐵死亡可有效緩解大鼠缺血-再灌注引起的肺損傷

二氫乙啶（dihydroethidium， DHE）染色結果提示，IR能夠引起大量ROS的產生，但可被DFO抑制，并具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2A、B；透射電子顯微鏡結果顯示，IR組線粒體外膜破裂，線粒體嵴減少，DFO組線粒體較IR組線粒體形態(tài)更完整，見圖2A。

3 缺血預處理對缺血-再灌注損傷大鼠肺鐵死亡相關指標的影響

與control組相比，IR組MDA和Fe水平升高，GSH水平下降（P＜0.05）；與IR組相比，I-pre-C降低了大鼠肺臟MDA和Fe水平，同時GSH水平回升（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

4 缺血預處理可有效緩解大鼠缺血-再灌注引起的肺損傷

HE染色顯示，與IR組相比，I-pre-C能抑制缺血-再灌注引起肺臟結構的紊亂、肺泡破損以及紅細胞聚集，見圖4A；DHE染色可見，與IR相比，I-pre-C能夠抑制IR引起的ROS產生（P＜0.01），見圖4A、B。

5 缺血預處理抑制大鼠肺缺血-再灌注引起的鐵死亡

Western blot結果顯示，與IR組相比，I-pre-C能夠顯著降低TFR1和ACSL4的水平，并且增加SLC7A11、FTH1和GPX4的水平（P＜0.01），見圖5。

Figure 2. Dihydroethidium（DHE） staining and transmission electron microscope （TEM） of rat lung tissue in each group （A） and DHE statistical results （B）. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； ##P＜0.01 vs IR group.圖2 各組大鼠肺組織DHE染色和透射電子顯微鏡觀察

Figure 3. MDA， Fe and GSH levels in lung tissue of rats in each group. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs IR group.圖3 各組大鼠肺組織MDA、Fe和GSH水平

Figure 4. The HE and dihydroethidium （DHE） staining of rat lungs in each group （A） and DHE staining statistical results （B）.Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs IR group.圖4 各組大鼠肺部HE和DHE染色結果

Figure 5. The protein levels of TFR1， ACSL4， SLC7A11， FTH1 and GPX4 in the lungs of rats in each group. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vs IR group.圖5 各組大鼠肺部TFR1、ACSL4、SLC7A11、FTH1和GPX4蛋白水平

討 論

LIRI是一種急性肺缺血-再灌注引發(fā)的臨床常見病，如心肺復蘇、肺移植、單肺通氣、心肺旁路和肺栓塞［5-7］。LIRI是一種急性無菌性肺損傷，發(fā)病率高，發(fā)病機制復雜，涉及多種途徑和病理生理氧化應激損傷，鈣超載、內質網應激損傷、炎癥損傷、自噬和凋亡等［8-9］。鐵死亡是一種依賴鐵的、p53介導的、非凋亡形式的細胞死亡，其部分通過促進致死性脂質ROS 的積累來介導其作用［10-11］，它涉及多種人類疾病，其抑制作用可有效減輕I/R誘導的腎功能衰竭和心臟損傷實驗模型中的臨床癥狀［12-13］。氧化應激的介質，包括GPX4，已被確定為鐵死亡的抑制劑，影響GPX4功能的機制可臟器影響功能和活力。谷胱甘肽、谷胱甘肽GSH是鐵死亡過程中氨基酸代謝的核心物質，由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸合成［14］。胱氨酸進入細胞后被還原為半胱氨酸，參與GSH的合成。GPX4是清除脂質氧自由基的重要酶。一旦GPX4被激活，GSH可以將有毒的脂質過氧化氫還原為無毒的脂質醇，表明GSH是一種重要的保護性代謝物，可防止鐵死亡。研究發(fā)現(xiàn)，GPX4表達下調的細胞對鐵死亡更敏感，而GPX4表達上調則抑制鐵死亡。RSL3是一種鐵死亡誘導劑，直接作用于GPX4并抑制其活性，從而降低細胞的抗氧化能力并積累ROS，導致鐵死亡。本實驗結果表明，DFO組線粒體較IR組線粒體形態(tài)更完整，與IR組相比，DFO+IR組MDA水平降低，GSH水平回升，DFO能夠顯著降低TFR1和ACSL4的水平并且增加SLC7A11、FTH1和GPX4的水平，這些結果提示抑制鐵死亡能夠有效緩解缺血-再灌注引起的肺損傷。

目前的研究對于I-pre-C的信號轉導途徑有了初步的認識。在大鼠實驗中，I-pre-C使部分基因上調以對抗氧化應激，包括Hadhsc、Prdx4、Fabp4和Hsp73，同時也抑制部分促炎癥基因的表達，如Egr-1、Dusp1和Dusp6［15-18］。此外，部分獨立激酶（如p38 MAPK）在缺血處理中的作用尚待深入研究［14］。I-pre-C是在組織缺血前采取的多個循環(huán)短暫的缺血/再灌注處理的干預措施。本實驗應用在肺缺血-再灌注前，給予3個周期的5 min缺血、5 min再灌的I-pre-C對LIRI進行干預。本實驗結果顯示：與IR組相比，光鏡下顯示I-pre-C組大鼠肺間質的水腫減輕，毛細血管輕度擴張，肺泡內紅細胞滲出較少，炎癥細胞浸潤較少，肺泡較完整，I-pre-C降低了大鼠肺臟MDA和Fe水平，GSH水平回升，同時I-pre-C能夠顯著降低TFR1和ACSL4的水平并且增加SLC7A11、FTH1和GPX4的水平。我們從I-pre-C的大鼠身上獲得的數據顯示出了對LIRI誘導的鐵死亡的保護作用。

綜上所述，鐵死亡參與了大鼠的LIRI；抑制鐵死亡能夠有效緩解缺血-再灌注引起的肺損傷；I-pre-C可通過抑制鐵死亡從而減輕LIRI。這些發(fā)現(xiàn)為研究LIRI和I-pre-C保護機制提供了重要的證據，也為進一步的機制研究提供了數據參考。