吳江立， 賈玉濤， 田雨卿， 崔清卓， 周勇杰， 武若愚， 李愛英

（1河北中醫(yī)學院科研中心，河北 石家莊 050035；2石家莊學院化工學院，河北 石家莊 050035；3河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200）

阿霉素（adriamycin；又稱多柔比星， doxorubicin， DOX）是一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，常用來治療各種實體腫瘤。但是其劑量依賴的心臟毒性限制了其臨床應用，其導致心肌損傷的機制仍未完全明了，氧化應激被認為是影響DOX心臟毒性嚴重程度的關(guān)鍵途徑［1］。核因子 E2 相關(guān)因子 2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）信號通路是機體內(nèi)一條重要的抗氧化通路。雛菊葉龍膽酮（bellidifolin， Bel）是從龍膽科植物中提取出的一類口山酮類化合物，其具有抗氧化和保護心血管系統(tǒng)等作用［2］，但是其對DOX誘導的心肌細胞是否有保護作用尚不得知。有研究報道，雛菊葉龍膽酮可能通過激活血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1， HO-1）和谷氨酰半胱氨酸連接酶亞基（glutamate cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）的表達對H2O2誘導的H9c2細胞起到保護作用［3］。本研究擬利用DOX誘導大鼠H9c2心肌細胞模擬DOX心臟損傷模型，通過體外實驗觀察雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2心肌細胞的作用，并探討其可能的機制。

材料和方法

1 細胞

大鼠心肌細胞系H9c2由河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室惠贈。

2 主要試劑

DOX為Biotech產(chǎn)品；抗Nrf2抗體、抗caspase-3抗體、抗Bcl-2抗體，抗GAPDH抗體購自Proteintech；Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1， Keap1）抗體購自Abcam；抗tubulin抗體、抗谷氨酰半胱氨酸連接酶修飾亞基（glutamate cysteine ligase modifier subunit， GCLM）抗體、抗HO-1抗體、抗NAD（P）H醌氧化還原酶1［NAD（P）H-quinone exidoreductase 1， NQO1］抗體、抗 Bax抗體及TUNEL檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco；胰酶購自Thermo；胎牛血清購自BI。

3 主要儀器

FUSION FX多功能成像（VILBER LOURMAT）及多功能微孔板讀數(shù)儀（Thermo Scientific）。

4 主要方法

4.1 H9c2心肌細胞的培養(yǎng) H9c2大鼠心肌細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱，每2～3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

4.2 DOX造模濃度的篩選 取對數(shù)生長期的H9c2細胞，以每孔5×103個接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，分別設(shè)置采用0、0.5、1、2、5、10、20和40 μmol/L的DOX作用細胞24 h，選擇最接近IC50值的DOX用藥濃度，作為后續(xù)實驗中DOX的給藥濃度。同時設(shè)置空白組（只加入培養(yǎng)液，不加細胞）。上述每組細胞設(shè)置6個復孔，CCK-8法檢測細胞活力。

4.3 CCK-8法檢測細胞活力 培養(yǎng)在96孔板中的H9c2細胞達到處理時間后，每孔加入用空培養(yǎng)液配置的10% CCK-8試劑100 μL，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，在450 nm波長下檢測其吸光度（absorbance，A）。細胞活力（%）=（A實驗-A空白）/（A對照-A空白）×100%

4.4 雛菊葉龍膽酮濃度的篩選 取對數(shù)生長期的H9c2細胞，以每孔5×103個接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，分別以0、3.125、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L的雛菊葉龍膽酮處理H9c2細胞24 h，CCK-8法檢測細胞活力，篩選出對細胞無毒性的給藥濃度。

4.5 雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2細胞的作用 將H9c2細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，分別用12.5、25、50 μmol/L雛菊葉龍膽酮預處理H9c2細胞10 h后，再加入5 μmol/L的DOX共同作用 24、48、72 h，同時設(shè)置模型組（只加入培養(yǎng)液和5 μmol/L的DOX），CCK-8法檢測細胞活力，選取最佳給藥濃度和時間。后續(xù)實驗分別設(shè)置正常對照（control）組、DOX組，DOX和雛菊葉龍膽酮聯(lián)合給藥（DOX+Bel）組。

4.6 TUNEL染色檢測細胞凋亡 將H9c2細胞以每孔3×105個接種于6孔板，根據(jù)實驗要求設(shè)置不同的分組，采用4%多聚甲醛固定細胞，隨后加入Triton X-100破膜，PBS清洗后按照TUNEL試劑盒說明書進行細胞凋亡染色，最后用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

4.7 Western blot檢測細胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達水平 各組細胞用PBS洗滌2次后，按照試劑盒說明書提取總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度，將蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉1.5 h，TBST清洗后加入Ⅰ抗（抗 Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM、NQO1、Bcl-2、Bax和caspase-3抗體），4 ℃孵育過夜，洗滌之后加入相應的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST清洗后采用ECL試劑在多功能成像系統(tǒng)下采集圖像。

5 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析以及LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 DOX造模濃度的確定

與正常對照組相比，0.5、1、2、5、10、20、40 μmol/L的DOX分別作用H9c2細胞24 h，均可使細胞活力顯著降低（P＜0.05）。DOX的給藥濃度不斷加大，細胞活力持續(xù)降低，見圖1。后續(xù)實驗選取DOX使細胞活力接近IC50時的作用濃度，即5 μmol/LDOX作用24 h建立DOX誘導的H9c2細胞損傷模型。

Figure 1. Effects of different concentrations of DOX on the viability of H9c2 cells. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 μmol/L DOX group.圖1 不同濃度的DOX對H9c2細胞活力的影響

2 雛菊葉龍膽酮濃度的確定

與正常對照組比較，3.125、6.25、12.5、25和50 μmol/L的雛菊葉龍膽酮作用24 h對細胞活力均無顯著影響（P＞0.05），100 μmol/L的雛菊葉龍膽酮可以顯著降低H9c2細胞活力（P＜0.05），因此后續(xù)實驗選擇濃度0～50 μmol/L作為雛菊葉龍膽酮的給藥區(qū)間，見圖2。

Figure 2. Effects of different concentrations of bellidifolin（Bel）on the viability of H9c2 cells. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 μmol/L Bel group.圖2 不同濃度的雛菊葉龍膽酮對H9c2細胞活力的影響

3 雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2心肌細胞損傷的作用

與正常對照組相比，DOX處理24 h、48 h、72 h后，細胞活力均顯著降低（P＜0.05），經(jīng)12.5、25、50 μmol/L的雛菊葉龍膽酮預處理后細胞活力提升，且DOX作用24 h時，雛菊葉龍膽酮提升細胞活力效果最顯著（P＜0.05）。三個劑量組中50 μmol/L的雛菊葉龍膽酮效果最好（圖3），故采用50 μmol/L雛菊葉龍膽酮預處理10 h，DOX造模24 h進行后續(xù)實驗。

4 雛菊葉龍膽酮對Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，DOX刺激后，H9c2心肌細胞的Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM和NQO1表達顯著降低（P＜0.05），而經(jīng)雛菊葉龍膽酮預處理后，Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM和NQO1的蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖4。

5 雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果顯示，DOX誘導的模型組心肌細胞凋亡較正常對照組顯著增多（P＜0.05），雛菊葉龍膽酮預處理可以減少細胞凋亡（P＜0.05），見圖5。

Figure 3. Effects of bellidifolin （Bel） on the viability of H9c2 cells induced by DOX. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.圖3 雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2心肌細胞活力的影響

Figure 4. Effects of bellidifolin （Bel） on the expression levels of Nrf2/HO-1 signaling pathway-related proteins in H9c2 cells induced by DOX. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.圖4 雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2心肌細胞中Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示DOX刺激后，H9c2心肌細胞Bcl-2/Bax比值降低，cleaved caspase-3蛋白表達升高，而雛菊葉龍膽酮預處理可以提高DOX誘導的H9c2細胞中Bcl-2/Bax比值，降低cleaved caspase-3表達，見圖6。

討 論

隨著全球腫瘤患者生存率的提高，心血管疾病目前是腫瘤幸存者長期發(fā)病率和死亡率升高的第二大原因。DOX是蒽環(huán)類抗生物的代表性藥物，臨床上常用來治療各種腫瘤，但會引起嚴重的心臟毒性，臨床表現(xiàn)為不可逆的心肌病，最終導致心力衰竭，從而限制了其應用［4］。目前，右丙亞胺為FDA批準的唯一用于DOX心臟毒性的藥物，然而其會降低腫瘤細胞對化療的敏感性，并加劇骨髓抑制［5］，因此，迫切需要開發(fā)安全有效的藥物來減輕DOX等蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性。

雛菊葉龍膽酮作為天然的口山酮類化合物，在龍膽科藥用植物中分布廣泛，研究報道其具有抗氧化、改善心律失常、抑制凋亡［6-7］等功效。本課題利用DOX誘導大鼠H9c2心肌細胞模擬心臟損傷，探究雛菊葉龍膽酮對心臟的保護作用。DOX刺激后，H9c2細胞活力降低，雛菊葉龍膽酮預處理可以提高細胞活力，說明其對DOX誘導的H9c2心肌細胞損傷有一定抑制作用。另外，有文獻報道雛菊葉龍膽酮對人A549肺癌細胞的增殖具有抑制作用，而不會抑制正常肺上皮細胞的增殖［8］。雛菊葉龍膽酮可減輕DOX誘導的H9c2細胞損傷，同時還具有抑制肺癌腫瘤細胞增殖的作用，有可能應用于蒽環(huán)類化療藥物的心臟保護，其心肌保護的具體機制值得深入探究。

研究顯示，細胞凋亡參與DOX誘導的心臟損傷，減少心肌細胞凋亡可以減輕DOX誘導的心臟損傷［9-10］。本研究利用TUNEL染色和Western blot檢測H9c2細胞凋亡程度，結(jié)果顯示DOX誘導的H9c2心肌細胞中Bcl-2/Bax的比值減少，cleaved caspase-3表達升高，細胞凋亡比例增多，與文獻報道一致［9］。雛菊葉龍膽酮預處理可上調(diào)H9c2心肌細胞中Bcl-2/Bax的比值，降低cleaved caspase-3的表達，降低細胞凋亡比例，本結(jié)果提示雛菊葉龍膽酮可通過抑制凋亡蛋白的表達，減輕DOX誘導的H9c2大鼠心肌細胞損傷。

Figure 5. TUNEL staining was used to detect the effects of bellidifolin on apoptosis of H9c2 cells induced by DOX. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.圖5 TUNEL染色檢測雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2細胞凋亡的影響

氧化應激是DOX誘導心臟毒性發(fā)生發(fā)展的主要機制之一［11-12］。DOX誘導的心臟損傷中，活性氧（reactive oxygen species， ROS）的積累伴隨著心臟抗氧化防御系統(tǒng)的紊亂，抗氧化劑有助于改善與DOX相關(guān)的心肌?。?3-14］。Nrf2是一種細胞保護轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細胞內(nèi)的氧化還原動態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1結(jié)合存在于細胞質(zhì)中，機體處于氧化應激狀態(tài)時，Nrf2從Keap1分離并易位到細胞核中，調(diào)控下游抗氧化酶的表達［15］。研究報道Nrf2激動劑可預防DOX誘導的大鼠慢性心力衰竭［16］，敲除Nrf2基因的小鼠，DOX誘導的ROS生成增多，心臟損傷更為嚴重［17］，激活Nrf2可通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白（Bcl-2，Bax）抵抗凋亡［18］，減輕DOX誘導的心臟毒性［19-20］。雛菊葉龍膽酮由于其帶有的3個酚羥基，使其具有強的抗氧化活性。文獻報道雛菊葉龍膽酮通過激活Nrf2通路下游的抗氧化蛋白酶HO-1從而對H2O2誘導的H9c2細胞起到抗氧化保護作用［3］。本研究結(jié)果顯示DOX刺激后，Keap1、Nrf2蛋白表達下降，Nrf2的信號通路被抑制，與Zhao等［20］在DOX心臟病實驗中的結(jié)果一致，表明DOX誘導的活性氧化劑的產(chǎn)生大于抗氧化劑的作用，導致DOX處理后H9c2心肌細胞的氧化應激損傷，雛菊葉龍膽酮預處理后增加了Keap1、Nrf2以及下游的HO-1、NQO1和GCLM蛋白的表達。提示雛菊葉龍膽酮可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，提高細胞抗氧化能力，抑制細胞凋亡、減輕DOX處理的H9c2心肌細胞損傷。

Figure 6. Effects of bellidifolin on the expression levels of Bcl-2， Bax （A） and cleaved-caspase 3 （B） in H9c2 cells induced by DOX.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs DOX group.圖6 雛菊葉龍膽酮對DOX誘導的H9c2細胞中Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3蛋白表達的影響

綜上所述，本研究結(jié)果提示，雛菊葉龍膽酮可能通過激活Nrf2/HO-1通路、增加Nrf2、HO-1等保護因子的水平，減輕氧化應激、抑制細胞凋亡，對DOX誘導的H9c2大鼠心肌細胞起到保護作用。本研究通過細胞體外實驗，為雛菊葉龍膽酮抑制蒽環(huán)類藥物心臟毒性作用提供了參考。