宋月月 ， 劉佳麗 ， 劉德坤 ， 闞東方 ， 李運倫 ，2， 楊雯晴 ，3△

（1山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250335；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000；3山東省心血管病中醫(yī)精準(zhǔn)治療工程實驗室，山東 濟(jì)南 250335）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis， AS）是一種慢性炎癥性疾病，是引發(fā)心血管疾病的一個重要危險因素［1］。血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了從心臟到毛細(xì)血管的整個循環(huán)系統(tǒng)，AS始于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，伴隨著動脈內(nèi)脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞和纖維基質(zhì)增生等病變，發(fā)展形成斑塊。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是以舒張功能減弱、促炎狀態(tài)和血栓形成為特征變化，被認(rèn)為是AS的重要病理學(xué)特征［2］。血流對血管壁產(chǎn)生的剪切應(yīng)力，直接作用于血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞，使血管內(nèi)膜局部受損并促進(jìn)斑塊形成，被認(rèn)為是與AS發(fā)生及斑塊破裂的關(guān)鍵力學(xué)因素［3-4］。Piezo1是一種機(jī)械敏感性非選擇性陽離子通道蛋白，且在血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在機(jī)械力與生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［5-6］。研究表明，機(jī)械敏感性離子通道Piezo1可被剪切應(yīng)力刺激，誘導(dǎo)創(chuàng)造促血栓形成和抗纖溶的微環(huán)境［7］，另外，Piezo1通過影響一氧化氮（nitric oxide，NO）的生物利用度，從而影響細(xì)胞因子分泌，降低血管舒張力，促進(jìn)AS形成［8］。然而在AS的進(jìn)展過程中Piezo1對內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用尚未見明確報道。本研究通過ApoE-/-小鼠與Piezo1基因敲除的ApoE-/-小鼠模型，觀察AS進(jìn)展過程中Piezo1的表達(dá)變化情況及Piezo1敲除對ApoE-/-小鼠AS血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。

材料和方法

1 實驗材料

雄性SPF級ApoE-/-小鼠與雄性SPF級C57BL/6J小鼠各24只，體質(zhì)量（24.0±1.5） g，8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SYXK（魯）2017-0022。8周齡SPF級Piezo1flox/floxCdh5-Cre+/ApoE-/-（以下簡稱Cre+）小鼠與Piezo1flox/floxCdh5-Cre-/ApoE-/-（以下簡稱Cre-）小鼠，體質(zhì)量（23.0±1.0） g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)李靜老師惠贈。所有小鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境設(shè)施內(nèi)，環(huán)境溫度（22±2） ℃，環(huán)境濕度（50±5）%環(huán)境，12 h明暗交替。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由攝食飲水。

2 主要藥品與試劑

油紅O購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司（7BE10110）；HE染液套裝（ZH203004）、Masson染液套裝（ZH195206）、EVG染液套裝（G1042）、EDTA抗原修復(fù)液（G1206）、CY3-TSA（G1223）、自發(fā)熒光淬滅劑（G1221）、DAPI（G1012）及抗熒光淬滅封片劑（G1401）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Piezo1兔多克隆抗體（5939-/-AP）購自 Proteintech；CD31鼠單克隆抗體（ab9498）購自Abcam；苯腎上腺素（LRAB7786）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙酰膽堿（acetylcholine， ACh； 917N011）購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（E-EL-M0456c）、前列腺素I2（prostaglandin I2， PGI2）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（EEL-0022c）、內(nèi)皮素 1（endothelin-1， ET-1）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（E-EL-M2730c）及血栓素A2（thromboxane A2， TXA2）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（E-EL-0057c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；2× SYBR Green qPCR Mix（AH0104-C）和SPARK-script II RT Plus kit（AG0304-B）均購自思科捷生物技術(shù)有限公司。

3 實驗儀器

DMT620多通道血管張力測定儀（DMT）；立體熒光顯微鏡（Leica）；酶標(biāo)儀（BioTek）；正置光學(xué)顯微鏡（Nikon）；全自動生化分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司）；實時熒光定量PCR儀（Roche）。

4 動物分組及干預(yù)方法

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，根據(jù)實驗?zāi)康膶⒉煌荦g24只C57BL/6J小鼠分為正常對照組，24只ApoE-/-小鼠分為模型組；Piezo1基因敲除小鼠分為Cre+組和Cre-組，每組10只。各組小鼠均給予高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12周。

5 標(biāo)本采集

不同周齡小鼠于造模后第12、14、16和18周禁食不禁水12 h，以2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，各組6只；Cre+和Cre-小鼠于20周以2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，各組10只，腹主動脈取血，1 301×g離心15 min，取上層血清，分裝于1.5 mL離心管中，放置-80 ℃凍存以備用。

取血完畢后，迅速打開胸腔，充分暴露心臟及胸主動脈，快速進(jìn)行心臟灌注，灌注完畢后，快速分離心臟至髂總動脈分叉處的動脈血管，取出放入生理鹽水中沖洗干凈，并剔除主動脈上殘余的脂肪組織及結(jié)締組織，取部分組織浸泡于4%多聚甲醛中固定待檢，部分組織凍存于-80 ℃冰箱中備用于后續(xù)實驗。

小鼠處死后，迅速取出其胸主動脈，置于充有純氧的4 ℃的PBS緩沖液中，小心將其周圍結(jié)締組織剔除，剪成約2 mm長的血管環(huán)。

6 主要方法及檢測指標(biāo)

6.1 病理組織學(xué)染色 大體油紅O染色［9］：小心剝離主動脈，剔除周圍組織，取完整主動脈，置于4%多聚甲醛固定48 h，PBS浸洗2次，油紅染液中浸染60 min，直至斑塊呈紅色，血管壁白色，清洗拍照，以病變面積與主動脈面積之比評價AS程度。HE染色［10］：置于4%多聚甲醛中的血管固定5 d，脫水、石蠟包埋。腹主動脈樣本切成5 μm切片，蘇木精和伊紅染色，用光學(xué)顯微鏡觀察。Masson染色［11］：石蠟切片脫蠟至水，Masson復(fù)合染色液染色5 min，水洗后加磷鉬酸染色5 min，擦干切片表面水分，加苯胺藍(lán)染色5 min，水洗，加分化液分化2次，脫水封固。光學(xué)顯微鏡下觀察。Movat染色［12］：取石蠟切片脫蠟水化，Bouin溶液固定20 min，水洗2 min。Verhoeff染液染色15 min，10%三氯化鐵水溶液分色，水洗。切片放入堿性乙醇10 min，放入1%阿爾辛藍(lán)水溶液內(nèi)15 min，水洗。1%冰醋酸溶液5 min，水洗。藏紅花液和酸性品紅液按1∶1比例染色2 min，水洗。放入5%磷鎢酸溶液10 min，水洗。乙醇脫水，二甲苯透明封片。

6.2 血脂指標(biāo)檢測 取小鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，采用全自動生化分析儀檢測甘油三酯（triglyceride，TG）、血 清 總 膽 固 醇（total cholesterol，CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

6.3 小鼠血清中eNOS、PGI2、ET-1及TXA2檢測 取小鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明操作，將稀釋好的樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板中，并設(shè)空白孔進(jìn)行對照，加入抗體孵育，洗滌后加入顯色液進(jìn)行反應(yīng)20 min后加入終止液，酶標(biāo)儀以450 nm檢測吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度。

6.4 小鼠離體主動脈環(huán)張力檢測 實驗方法見參考文獻(xiàn)［13］，將血管環(huán)水平懸掛于恒溫浴槽內(nèi)，恒溫浴槽內(nèi)不斷通入100% O2，加入5 mL、37 ℃ PSS液，并保持溫度在36.8～37.2 ℃。穩(wěn)定約60 min，期間每隔20 min換Krebs液1次，60 mmol/L KCl重復(fù)刺激2次，檢測血管活性。去氧腎上腺素（phenylephrine， Phe）1 μmol/L收縮達(dá)穩(wěn)態(tài)時加入10 μmol/L ACh，檢測內(nèi)皮完整性，用不同濃度的ACh刺激血管，用PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)檢測血管環(huán)張力變化。

6.5 血管細(xì)胞活力檢測 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色的結(jié)晶，這種結(jié)晶的量與活細(xì)胞的量呈正相關(guān)［14］。取一段新鮮小鼠胸主動脈，失活處理作為空白對照。將各組血管分別加入MTT液，于37 ℃的溫箱中孵育1 h，取出血管置于DMSO中洗脫細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色結(jié)晶，多功能酶標(biāo)儀于570 nm下讀取吸光度（absorbance，A），包括各組血管洗脫液A值（Ax）及空白對照組A值（A0）。稱取各組血管段的重量（Mx；單位：mg）。結(jié)果以單位重量的A值表示，即（Ax-A0）/Mx［15］，A值越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)。

6.6 免疫熒光檢測 切片脫蠟至水，于EDTA抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后，PBS洗滌3次，每次5 min，用組化筆圈住組織，放入3%過氧化氫溶液，室溫下避光孵育25 min，洗滌甩干，滴加BSA，5%山羊血清封閉30 min。加入CD31和Piezo1 Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，洗滌，在圈內(nèi)滴加與Ⅰ抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗覆蓋組織，室溫下孵育50 min，洗滌，滴加CY3-TSA，室溫避光孵育10 min，TBST洗滌3次，每次5 min。切片置于EDTA抗原修復(fù)緩沖液中加熱處理，在圈內(nèi)滴加DAPI染液，室溫避光孵育 10 min，洗滌，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，用DAPI抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

6.7 Piezo1mRNA水平的檢測 小鼠處死后，取小鼠主動脈組織，加入1 mL的Trizol試劑，研磨機(jī)研磨組織，萃取主動脈組織的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)成cRNA，4 ℃保存。使用熒光定量PCR試劑盒，通過LightCycler 480 II進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，共 40 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for real-time PCR

7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，內(nèi)皮細(xì)胞功能與Piezo1表達(dá)的相關(guān)性分析符合正態(tài)分布，采用Person相關(guān)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高脂飼料喂養(yǎng)不同時長的ApoE-/-小鼠AS進(jìn)展及Piezo1的表達(dá)變化

1.1 小鼠主動脈病理染色分析 首先我們對高脂飼料喂養(yǎng)不同時長的小鼠主動脈病理狀況進(jìn)行了觀察。主動脈全長油紅O染色顯示（圖1A），正常組小鼠主動脈管壁光滑、平整，呈半透明狀，未見明顯斑塊；高脂飼料喂養(yǎng)12周后，模型組小鼠主動脈弓部開始出現(xiàn)明顯的紅染脂質(zhì)斑塊，胸主動脈區(qū)域存在散在粥樣斑塊，且隨著喂養(yǎng)時間的延長，可在主動脈弓及血管分叉處看到較明顯的點狀和斑片狀斑塊突向管腔，邊界較清。考慮到主動脈總體面積存在個體差異，故我們對從斑塊面積占主動脈總面積比例方面進(jìn)行主動脈斑塊嚴(yán)重程度評價，結(jié)果如圖1B所示，與高脂飼料喂養(yǎng)不同時長的正常組小鼠相比，模型組小鼠主動脈斑塊面積隨時間延長顯著增加（P＜0.01）。

小鼠主動脈根部斑塊石蠟切片的HE、Masson和Movat染色結(jié)果顯示（圖2），正常組小鼠可見主動脈根部三瓣膜及血管中內(nèi)膜連續(xù)、平滑，無纖維性增厚，隨著喂養(yǎng)時間的延長未見粥樣硬化斑塊的出現(xiàn)，血管結(jié)構(gòu)正常。高脂飼料喂養(yǎng)12周后模型組小鼠可見明顯粥樣斑塊沉積，斑塊內(nèi)膠原含量增多，隨喂養(yǎng)時間延長管腔逐漸狹窄，斑塊面積顯著增大，膠原纖維含量增多。

1.2 血清脂質(zhì)含量測定 分別于高脂飼料喂養(yǎng)的第12、14、16及18周檢測小鼠血脂含量，檢測到模型組小鼠TG、CHOL、HDL-C及LDL-C含量顯著高于正常組（P＜0.01），但不同時點之間小鼠血脂變化不顯著（圖3）。

1.3 小鼠血清中eNOS、PGI2、ET-1及TXA2檢測 為評價AS發(fā)展過程中小鼠內(nèi)皮功能的變化，我們檢測了eNOS、PGI2、ET-1及 TXA2的變化（圖4）。結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)的第12、14、16及18周模型組小鼠血清中eNOS和PGI2表達(dá)顯著低于正常組小鼠（P＜0.01），ET-1和TXA2表達(dá)顯著高于正常組小鼠（P＜0.05）。且隨著周齡的增加，小鼠血清中eNOS和PGI2逐漸降低，ET-1和TXA2逐漸升高。

Figure 1. Aortic plaque in mice fed with high-fat diet for different time （oil red O staining， scale bar=500 μm）. Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖1 高脂飼料喂養(yǎng)不同時長小鼠主動脈斑塊情況

1.4 斑塊組織中內(nèi)皮細(xì)胞完整性與Piezo1的表達(dá)為進(jìn)一步觀察高脂飼料喂養(yǎng)不同時長的小鼠斑塊組織中內(nèi)皮細(xì)胞完整性與Piezo1的表達(dá)變化，我們對主動脈斑塊組織進(jìn)行了CD31與Piezo1熒光染色。通過圖5可見，正常組小鼠主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，而ApoE-/-小鼠隨著高脂干預(yù)時間的延長小鼠主動脈CD31表達(dá)下調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性受損，出現(xiàn)缺失。與正常組相比，ApoE-/-小鼠Piezo1的表達(dá)顯著升高，但隨著高脂干預(yù)時間的延長而逐漸減弱。結(jié)果顯示ApoE-/-小鼠主動脈斑塊組織中Piezo1的含量較正常小鼠增多，但隨著小鼠周齡的延長，Piezo1的含量顯著減少（P＜0.01），小鼠主動脈組織中Piezo1 mRNA的表達(dá)也呈現(xiàn)同樣的變化趨勢（圖6）。

Figure 2. Pathological staining of aortic root in mice fed with high-fat diet for different time（scale bar=200 μm）. A： HE staining；B： Masson staining； C： Movat staining.圖2 高脂飼料喂養(yǎng)不同時長小鼠主動脈根部病理染色

Figure 3. Changes of TG， CHOL， HDL-C and LDL-C in mice fed with high-fat diet for different time. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs control group.圖3 高脂飼料喂養(yǎng)不同時長小鼠TG、CHOL、HDL-C及LDL-C的變化

Figure 4. The levels of eNOS， PGI2， ET-1 and TXA2 in serum of mice fed with high-fat diet for different time. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group.圖4 高脂飼料喂養(yǎng)不同時長小鼠血清中eNOS、PGI2、ET-1和TXA2水平

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞功能與Piezo1表達(dá)的相關(guān)性分析為了解AS進(jìn)展過程中小鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能與Piezo1表達(dá)相關(guān)性情況，我們對小鼠血清中eNOS、ET-1、PGI2及TXA2的含量與Piezo1 mRNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析（圖7）。結(jié)果顯示小鼠Piezo1 mRNA水平與eNOS含量呈正相關(guān)（r=0.975，P＜0.01），與ET-1含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.889，P＜0.01）、與PGI2含量呈正相關(guān)（r=0.977，P＜0.01），與 TXA2含 量呈 負(fù) 相關(guān)（r=-0.973，P＜0.01）。

Figure 5. Immunofluorescence staining of mouse aorta. The scale bar=200 μm.圖5 小鼠主動脈免疫熒光染色

2 Piezo1敲除對AS小鼠血管內(nèi)皮功能的影響

2.1 小鼠主動脈病理染色分析 為進(jìn)一步明確Piezo1敲除對小鼠主動脈斑塊形成的影響，對小鼠主動脈進(jìn)行大體油紅O染色（圖8A），可見脂質(zhì)斑塊在大體油紅O中被染成紅色。對Piezo1敲除的ApoE-/-小鼠主動脈斑塊的面積進(jìn)行觀察，如圖8B所示，與Cre-模型組小鼠相比，Cre+模型組小鼠主動脈斑塊面積顯著減少（P＜0.01）。

為觀察Piezo1敲除對ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊的影響，對小鼠主動脈根部斑塊石蠟切片進(jìn)行HE、Masson和Movat染色，觀察斑塊面積、膠原纖維和彈力纖維含量變化。結(jié)果顯示（圖9），Cre-模型組小鼠與Cre+模型組小鼠均可見明顯粥樣斑塊沉積，與Cre-模型組小鼠相比，Cre+模型組小鼠主動脈根部斑塊的相對管腔面積減?。≒＜0.01），斑塊內(nèi)膠原纖維含量減少（P＜0.01），彈力纖維含量有所增加（P＞0.05）。

Figure 6. The mRNA expression of Piezo1 in mouse aorta. Mean±SEM. n=3. **P＜0.01 vs control group.圖6 小鼠主動脈Piezo1的mRNA表達(dá)水平

2.2 小鼠血管內(nèi)皮功能變化 為評價Piezo1敲除對ApoE-/-小鼠內(nèi)皮功能的變化，我們檢測了eNOS、PGI2、ET-1和TXA2的變化、血管細(xì)胞活力以及小鼠離體主動脈環(huán)張力情況，從而評價Piezo1敲除后是否會加重小鼠血管內(nèi)皮的損傷。結(jié)果顯示與Cre-模型組小鼠相比，Cre+模型組小鼠血清中eNOS和PGI2含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），TXA2含量顯著增加（P＜0.01），ET-1變化不顯著（P＞0.05）（圖10）。小鼠血管細(xì)胞活力檢測顯示（圖11），Cre+模型組的A值顯著低于Cre-模型組，細(xì)胞活力減弱（P＜0.01）。離體主動脈環(huán)實驗結(jié)果顯示（圖12、13），與Cre-模型組相比，利用單劑量Phe誘導(dǎo)主動脈收縮反應(yīng)時，Cre+組小鼠主動脈環(huán)的收縮功能顯著比Cre-組低；利用單劑量Phe誘導(dǎo)主動脈收縮，累計劑量ACh誘導(dǎo)主動脈舒張反應(yīng)時，Cre+模型組小鼠主動脈環(huán)的舒張作用受到了顯著的抑制（P＜0.05）。

2.3 小鼠主動脈斑塊組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的變化 為進(jìn)一步觀察Piezo1敲除對ApoE-/-小鼠內(nèi)皮細(xì)胞完整性的影響，我們對主動脈斑塊組織進(jìn)行了CD31與Piezo1熒光染色。通過圖14可見，與Cre-模型組相比，Cre+模型組主動脈CD31表達(dá)下調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性受損，出現(xiàn)缺失。

討 論

Figure 7. Correlation analysis between Piezo1 and functional indexes of mouse endothelial cells. A： correlation analysis between Piezo1 and eNOS； B： correlation analysis between Piezo1 and ET-1； C： correlation analysis between Piezo1 and PGI2； D：correlation analysis between Piezo1 and TXA2.圖7 Piezo1表達(dá)與小鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)間的相關(guān)性分析

Figure 8. Effect of Piezo1 knockout on aortic plaque in ApoE-/- mice （oil red O staining， scale bar=500 μm）. Mean±SEM. n=3. **P＜0.01 vs Cre- group.圖8 Piezo1基因敲除對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊的影響

Figure 9. Pathological staining of aortic root in ApoE-/- mice with Piezo1 knockout. A： HE， Masson and Movat staining（scale bar=200 μm）； B： relative lumen area of aortic plaque（PA： plaque area； LA： lumen area）； C： collagen fiber； D： elastic fiber. Mean±SEM. n=3. **P＜0.01 vs Cre- group.圖9 Piezo1基因敲除對ApoE-/-小鼠主動脈根部病理染色的影響

Figure 10. Effect of Piezo1 knockout on serum eNOS， PGI2， ET-1 and TXA2 levels in mice. Mean±SEM. n=10. *P＜0.05， **P＜0.01 vs Cre- group.圖10 Piezo1敲除對小鼠血清中eNOS、PGI2、ET-1及TXA2水平的影響

Figure 11. Vascular cell viability in mouse thoracic aorta. The cell viability in Cre+ group was decreased. In addition， the viability of vascular cells in Cre+ mice was lower than that in Cre- mice under the same conditions. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs Cre- group.圖11 小鼠胸主動脈血管細(xì)胞活力

Figure 12. Tension in isolated mouse aorta preconstriction.圖12 小鼠離體主動脈預(yù)收縮的張力

Figure 13. Tension in isolated mouse aorta relaxation. Mean±SEM. n=4. *P＜0.05 vs Cre- group.圖13 小鼠離體主動脈舒張的張力

Figure 14. Expression CD31 and of Piezo1 in aorta of Cre- and Cre+ mice detected by immunofluorescence staining（scale bar=200 μm）.圖14 小鼠主動脈免疫熒光染色

AS是動脈內(nèi)膜層形成的粥樣性斑塊，大動脈管壁的功能障礙是AS性心血管疾病的重要病理因素［16］。血管內(nèi)皮細(xì)胞主要構(gòu)成心血管系統(tǒng)的血管內(nèi)壁，作為血管系統(tǒng)的最內(nèi)層，參與液體之間的滲透交換過程，同時參與細(xì)胞中的物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信息交換［17］。內(nèi)皮細(xì)胞在不同病理因素刺激下，包括高膽固醇血癥、衰老、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及感染性因素等，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生非適應(yīng)性改變，從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)止血/血栓平衡、血管局部張力、氧化還原平衡以及急性和慢性炎癥反應(yīng)之間的平衡的正常生理功能［18-19］。內(nèi)皮細(xì)胞在基礎(chǔ)水平上產(chǎn)生NO有助于調(diào)節(jié)血管舒張和保持血管內(nèi)膜的非血栓形成行為，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時，eNOS分泌下調(diào)從而降低NO的合成。ET-1表達(dá)上調(diào)會降低eNOS的表達(dá)和活化［20］，導(dǎo)致血管的防御功能下降，誘導(dǎo)脂質(zhì)沉積、細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移［21-23］，PGI2和TXA2是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)，PGI2/TXA2的失衡是影響血管壁張力的重要因素［24-25］。血脂升高導(dǎo)致脂質(zhì)沉積，動脈壁中有毒脂蛋白降解產(chǎn)物的積累增加，內(nèi)皮細(xì)胞明顯受損，這種損傷會促進(jìn)AS進(jìn)程［26-27］。本研究通過構(gòu)建高脂飼料喂養(yǎng)不同時長的小鼠模型，檢測到小鼠血脂升高，AS程度隨周時增加逐漸加重，內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷也逐漸加重，小鼠血清中的eNOS、ET-1、PGI2和TXA2表達(dá)出現(xiàn)紊亂。提示ApoE-/-小鼠隨著周時延長，AS程度逐漸加重，血管內(nèi)皮功能的損傷逐漸加重。同時，我們檢測發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠Piezo1的表達(dá)較正常小鼠顯著增加，但隨著周時的增長，Piezo1的表達(dá)逐漸減低，提示AS進(jìn)展過程中Piezo1表達(dá)的減少對小鼠血管內(nèi)皮功能有一定的損傷作用。

機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1是內(nèi)皮細(xì)胞膜上對機(jī)械刺激敏感的傳感器［28］。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙表現(xiàn)在主動脈內(nèi)壁的彎曲或分叉處，血流產(chǎn)生的機(jī)械力刺激直接作用于管壁內(nèi)層內(nèi)皮細(xì)胞，刺激Piezo1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞周轉(zhuǎn)和衰老，氧化應(yīng)激增加，改變細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間的蛋白組織［29-30］。Piezo1是血管發(fā)育的重要因素， Piezo1的缺失會導(dǎo)致在妊娠中期小鼠胚胎發(fā)育出現(xiàn)血管重構(gòu)缺陷。Piezo1在小鼠發(fā)育的血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，機(jī)械和生化刺激能觸發(fā)Piezo1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，從而激活基質(zhì)金屬蛋白酶-2和膜型1基質(zhì)金屬蛋白酶，協(xié)同促進(jìn)新生血管生成［31］。在AS的發(fā)展過程中，Piezo1參與了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞排列［32-33］，誘導(dǎo)ATP釋放，內(nèi)皮釋放ATP被認(rèn)為是機(jī)械傳導(dǎo)信號級聯(lián)的關(guān)鍵上游步驟［34-35］，隨后在下游信號通路激活導(dǎo)致AKT和eNOS磷酸化，Piezo1是eNOS誘導(dǎo)NO形成、誘導(dǎo)血管擴(kuò)張以及維持基礎(chǔ)血壓所必需的［36］。Piezo1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)缺失或降低，會導(dǎo)致細(xì)胞剪切應(yīng)力的反應(yīng)缺陷，使血管內(nèi)皮細(xì)胞呈排列不規(guī)則的多角型，分泌縮血管活性物質(zhì)、促血管內(nèi)皮增殖和凋亡的活性物質(zhì)等，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞［37-39］。本研究為探討Piezo1在AS進(jìn)展中與內(nèi)皮功能變化的關(guān)系，通過成功構(gòu)建了Piezo1flox/floxCdh5-Cre+/ApoE-/-小鼠，觀察到敲除Piezo1后能影響小鼠主動脈脂質(zhì)斑塊的形成，血清中eNOS、PGI2和TXA2含量變化顯著，血管張力顯著降低，細(xì)胞活力損傷加重，提示Piezo1的缺失會導(dǎo)致小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能逐漸損傷，因而Piezo1在ApoE-/-小鼠的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。

綜上所述，本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)不同周時的ApoE-/-小鼠，觀察到AS進(jìn)程中小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度逐漸加重，Piezo1表達(dá)增加，且Piezo1表達(dá)隨周時的延長而逐漸降低，提示Piezo1表達(dá)情況與小鼠血管內(nèi)皮損傷程度有較強(qiáng)的相關(guān)性；進(jìn)一步研究ApoE-/-小鼠內(nèi)皮細(xì)胞敲除Piezo1后，發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)皮功能出現(xiàn)障礙，對AS發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定的影響，提示小鼠內(nèi)皮細(xì)胞Piezo1的缺失會促進(jìn)AS的進(jìn)展。本研究證明了Piezo1在ApoE-/-小鼠內(nèi)皮功能中的重要作用，Piezo1的異常表達(dá)會影響AS的進(jìn)展，以Piezo1為靶點采取治療措施或?qū)⒊蔀橹委烝S的新方向。但在疾病早期或進(jìn)展階段如何通過調(diào)控Piezo1來延緩甚至逆轉(zhuǎn)AS的病理進(jìn)程仍需進(jìn)一步探索。