任 緣， 王 修， 譚麗陽， 王 威， 唐 偉

（1大連大學附屬新華醫(yī)院，2大連大學，3大連大學附屬中山醫(yī)院，遼寧 大連 116621）

睡眠在我們的生活中占有很大比例，人一生中大約有三分之一的時間是在睡覺［1］。睡眠主要用于機體維持新陳代謝平衡、神經(jīng)元激活和學習相關(guān)的突觸形成［2］。此外，睡眠對于記憶的形成來說也是必不可少的。最近的研究結(jié)果表明，睡眠在學習過程和記憶鞏固中扮演了重要的角色［3-4］。睡眠剝奪（sleep deprivation， SD）會導(dǎo)致記憶鞏固不足［5-6］，并在人腦的幾個發(fā)育階段中對大腦的發(fā)育和可塑性發(fā)揮重要作用［7-8］。因此，睡眠剝奪會導(dǎo)致認知功能的損害，特別是記憶和空間學習方面［9］。慢性睡眠剝奪在損害認知功能的同時也增加了β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein， Aβ）和β位點淀粉樣前體蛋白裂解酶 1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1， BACE1）的水平［10］。Aβ主要存在于大腦細胞間質(zhì)之間，被認為是一種代謝“廢物”［11］。其中Aβ 1-40和Aβ1-42是淀粉樣斑塊的主要存在形式，但后者Aβ1-42顯示出更大的聚集傾向，并且由于多了兩個疏水氨基酸而具有更大的神經(jīng)毒性［12］。因此，延緩Aβ的異常沉積可能作為延緩睡眠剝奪導(dǎo)致相關(guān)認知損害的一種手段。隨著認知功能的逐漸減退，晝夜節(jié)律的失調(diào)也在阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。AD是一種破壞性的、不可逆轉(zhuǎn)的認知障礙，是最常見的癡呆類型。晝夜節(jié)律系統(tǒng)紊亂和AD的發(fā)病機制之間存在一些共同的特點，這也開啟了將它們作為一個相互依賴的途徑來觀察的前景［13］。

豐富環(huán)境（enriched environment， EE）是一種具有多種認知性、社會性以及物理性刺激并且豐富的環(huán)境，它作為一種非藥物干預(yù)手段，通過增強突觸可塑性、增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和減少海馬氧化應(yīng)激，從而有效改善認知障礙［14-16］。一些實驗已經(jīng)證明，環(huán)境因素的調(diào)節(jié)顯著減弱了Aβ的穩(wěn)態(tài)水平［16-18］。同時，豐富環(huán)境也可以改善小鼠的學習和記憶能力［19-21］。然而，EE對增強學習和記憶能力的機制以及EE對Aβ相關(guān)代謝分子的影響在很大程度上仍是未知的。開發(fā)EE作為睡眠剝奪引起的學習和記憶功能改變的治療方式具有重要的潛力。因此，我們通過改良多平臺水環(huán)境法，成功構(gòu)建睡眠剝奪的小鼠模型，首先研究了EE對慢性睡眠剝奪小鼠認知功能的影響，其次，探討了EE對慢性睡眠剝奪小鼠學習記憶認知功能及其相關(guān)代謝分子BACE1表達水平的影響。

材料和方法

1 動物

由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司購得SPF級昆明種雄性小鼠40只，15周齡，體重（23±3） g，許可證號為SCXK（遼）2020-0001。所有實驗動物均給予24 h晝夜燈光照射控制，并維持在溫度24 ℃左右的條件下飼養(yǎng)，濕度控制在45%～55%之間。

2 主要試劑

兔抗小鼠Aβ1-42和BACE1 Ⅰ抗購于Abcam；山羊抗兔Ⅱ抗（Alexa Fluor Plus 594）購于Thermo；抗熒光淬滅封片劑及QuickBlockTM Western封閉液購于碧云天生物技術(shù)有限公司；裂解緩沖液Lysis Buffer購于凱基生物科技發(fā)展有限公司；Bradford蛋白測定試劑盒購于Solarbio；GAPDH抗體購于Bioworld；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購于四正柏生物科技有限公司。

3 方法

3.1 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將40只小鼠分為4組，每組10只：標準環(huán)境對照（control， Ctrl）組、SD組、EE組和SD+EE組。提供充足的食物和飲用水，小鼠于動物實驗室內(nèi)同籠飼養(yǎng)1周，12 h（6：00至18：00）光照和12 h（18：00至次日6：00）黑暗條件輪替進行，溫度21～25 ℃，相對濕度45%～55%，并保持環(huán)境安靜。

3.2 模型制作 采用改良多平臺水環(huán)境法（modified multiple platform method， MMPM）制備慢性睡眠剝奪模型［22］。睡眠剝奪前將Ctrl組小鼠放在標準環(huán)境住房飼養(yǎng)至10月齡，標準環(huán)境使用標準實驗室籠子（33 cm×18 cm×14 cm）。EE組和SD+EE組小鼠放在豐富環(huán)境住房飼養(yǎng)直到10月齡；豐富環(huán)境使用大型鼠籠（55 cm×34 cm×20 cm），共有4種不同類型的豐富環(huán)境籠子，每個籠子2～3層，配備1～2個跑輪、迷宮、管道、秋千和玩具等，增加小鼠的運動空間；每周更換和重新排列豐富環(huán)境籠子以增加小鼠新奇感［23］。SD組和SD+EE組：睡眠剝奪箱尺寸大小為（39 cm×27 cm×20 cm），中央放置一直徑為3 cm，高10 cm，間隔5 cm的平臺。水面距平臺2 cm，水溫保持在（24±1） ℃。清醒時小鼠可在平臺上停留，進入睡眠時由于骨骼肌松弛使小鼠觸碰到水面或落入水中而驚醒，以此達到睡眠剝奪的目的，每天于14：00至次日9：00將小鼠置于平臺中進行19 h的睡眠剝奪，其余時間將小鼠放回相應(yīng)的標準籠子或豐富環(huán)境籠子飼養(yǎng)，水槽內(nèi)水每天更換，保證每組小鼠可自由攝取鼠糧和飲用水，共60 d，直至小鼠12月齡進行下一步實驗。Ctrl組和EE組：為排除環(huán)境應(yīng)激等影響將平臺直徑增大為10 cm，間隔2 cm，其余因素與SD組和SD+EE組一致，小鼠可在平臺上隨意活動并進入睡眠，不會落入水中。避免應(yīng)激差異對小鼠神經(jīng)病理特征和認知行為表現(xiàn)產(chǎn)生影響［24］。

3.3 神經(jīng)行為學測試

3.3.1 Y迷宮實驗 Y迷宮利用了小鼠對新異環(huán)境天然探究的習性，Y迷宮由3個臂組成，每一個臂尺寸為長30 cm，寬8 cm，高15 cm，各個臂夾角120度。正常小鼠會依次進入3個臂，不會返回前一個臂內(nèi)［25］。小鼠由Y迷宮中心放入，讓小鼠在迷宮中自由探索5 min。小鼠身體和尾巴完全進入其中一個臂內(nèi)記為一次有效探索。通過Smart 3.0軟件實時觀察和記錄各個小鼠進入3個臂的總交替數(shù)和序列，連續(xù)進入3個臂（如ACB、CAB等）記為正確。交替率的計算使用以下公式：交替正確率=正確交替數(shù)/（交替總數(shù)-2）×100%。同時，記錄小鼠進入三個臂的總臂數(shù)來檢測小鼠的活動能力。每只小鼠完成一次實驗后用酒精噴灑于3個臂內(nèi)以消除嗅覺干擾刺激。

3.3.2 新物體識別實驗 新物體識別實驗利用了嚙齒動物的自發(fā)行為，自然地接近和探索新物體的天然習性［26］。實驗開始前2 d，每天將小鼠放入不透明空箱（50 cm×50 cm×60 cm）中10 min適應(yīng)環(huán)境。第3天進入訓練階段，將無氣味，足夠重，小鼠在測試中不能隨意推動的A和B兩相同物體分別置于空箱兩端，將小鼠背朝兩物體放入箱內(nèi)，且確保小鼠鼻尖與A和B距離相等，使用錄像機記錄5 min內(nèi)小鼠鼻尖距兩物體1 cm以內(nèi)的探究時間，小鼠將前爪放在物體上，嗅或舔物體視為有效探索；擺姿勢或攀爬視為無效探索。每只小鼠訓練結(jié)束休息1 h后繼續(xù)進行下一次測試。將空箱中的B物體換為不同的C物體，其余條件不變，觀察小鼠5 min內(nèi)探索情況。采用Smart 3.0軟件分析相機收集的圖像，并記錄小鼠與兩物體的接觸。分別計算訓練、測試階段的總探索時間及測試階段的識別指數(shù)（recognition index，RI）=探索C物體時間/總探索時間，以此判斷小鼠的認知功能。

3.4 小鼠前額葉皮層與海馬淀粉樣斑塊沉積測定 用4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，開胸，充分暴露心臟，用4%多聚甲醛進行心臟灌流，斷頭取腦并置于4%多聚甲醛中固定24 h，取固定后的腦組織進行石蠟包埋，切片（4 μm）。每只小鼠腦切片隔三取一，挑選3張截面。腦組織切片用1×PBS于搖床上漂洗3 min脫蠟后滴加封閉液放置室溫孵育1 h。隨后滴加兔抗小鼠Aβ1-42 Ⅰ抗（1：200），4 ℃孵育過夜。次日1×PBS沖洗3 min×3次后滴加山羊抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附Ⅱ抗 Alexa Fluor Plus 594（1∶100），室溫孵育2 h，1×PBS沖洗3 min×3次，最后滴加帶Hoechst的防淬滅封片劑，刷指甲油封片。每個鼠腦選取3張切片用Olympus顯微鏡觀察、采集圖片并拍照。Image J軟件分析小鼠前額葉皮層與海馬中Aβ1-42陽性區(qū)域百分比率。

3.5 小鼠前額葉皮層和海馬組織BACE1蛋白測定 取-80 ℃液氮保存的前額葉皮層和海馬組織，加入裂解液研磨，用玻璃勻漿器勻漿，離心后取上清液，Bradford法測定各組蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)。1×TBST 溶液漂洗 5 min×3次后，加入5%脫脂牛奶置于搖床上室溫封閉2 h，1×TBST 溶液漂洗 5 min×5 次后滴加兔抗鼠BACE1（1∶1 000），GAPDH抗體（1∶5 000）被用作內(nèi)參照蛋白，4 ℃下孵育過夜。次日用1×TBST溶液漂洗10 min×3次后滴加相應(yīng)的Ⅱ抗（1∶10 000），室溫下孵育2 h，1×TBST溶液漂洗10 min×3次后滴加ECL發(fā)光進行曝光顯影，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照。用Image J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組之間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）結(jié)合LSD事后多重檢驗進行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)行為學檢測結(jié)果

1.1 Y迷宮實驗結(jié)果 Y迷宮實驗結(jié)果如圖1所示，4組小鼠進臂總數(shù)相近，活動能力相似，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與Ctrl組小鼠相比， SD組小鼠的交替率降低（P＜0.01），EE組小鼠的交替率增高（P＜0.01）。與SD組相比，EE+SD組小鼠的交替率增高（P＜0.01）。

Figure 1. Comparison of Y maze arm accuracy and total number of arms in each group of mice. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs Ctrl group； ##P＜0.01 vs SD group.圖1 各組小鼠的Y迷宮入臂正確率和進臂總數(shù)比較

1.2 新物體識別實驗結(jié)果 新物體識別實驗結(jié)果如圖2所示，與Ctrl組小鼠相比，SD組小鼠辨別指數(shù)降低（P＜0.01），EE組小鼠辨別指數(shù)增高（P＜0.05）；與SD組相比，EE+SD組小鼠辨別指數(shù)增高（P＜0.01）。

2 前額葉皮層和海馬Aβ1-42免疫熒光染色結(jié)果

通過對小鼠海馬與皮層組織分別進行免疫熒光染色，評估正常和慢性睡眠剝奪小鼠在EE干預(yù)和不干預(yù)后Aβ1-42表達水平的變化。免疫熒光結(jié)果如圖3所示，與Ctrl組小鼠相比，SD組小鼠前額葉皮層和海馬中的Aβ1-42表達水平均有不同程度的升高（P＜0.01），而EE組小鼠前額葉皮層和海馬中的Aβ1-42表達減少（P＜0.05）；與SD組小鼠相比，SD+EE組小鼠前額葉皮層和海馬中的Aβ1-42表達顯著減少（P＜0.01）。

3 前額葉皮層和海馬組織中BACE1蛋白表達結(jié)果

Western blot實驗結(jié)果如圖4所示，與Ctrl組相比，SD組小鼠前額葉皮層和海馬BACE1蛋白表達升高（P＜0.01）；EE組前額葉皮層BACE1蛋白與Ctrl組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但海馬組織中BACE1蛋白表達減少（P＜0.01）。與SD組相比，SD+EE組小鼠前額葉皮層和海馬中BACE1蛋白的表達均顯著降低（P＜0.01）。

討 論

隨著智能手機的應(yīng)用［27］以及工作壓力、生活壓力不斷增加［28］，睡眠不足現(xiàn)象在現(xiàn)代社會越來越常見，有研究表明，73%的成年人每天睡眠不足7 h［29］。長時間的睡眠剝奪會影響人的認知、記憶和執(zhí)行能力［30］，誘發(fā)突觸和神經(jīng)元水平的大腦結(jié)構(gòu)變化［31］。當前睡眠剝奪的治療方式主要是基于藥物治療和使用興奮劑，如褪黑素［32］，咖啡因，右旋苯丙胺和莫達非尼［33-34］。近年來，有一些研究通過老年動物或動物模型提出并強調(diào)了非藥物治療的EE對記憶獲取和認知缺陷恢復(fù)的有益影響［20-21，35-37］。為了評估 EE能否作為延緩慢性睡眠剝奪相關(guān)損害的一種新方式，本實驗通過將小鼠飼養(yǎng)在裝有不同互動物體（隧道、巢穴、玩具和跑步輪）的籠子里營造豐富環(huán)境，從而模擬人類的一些生活方式行為等，增強感覺、認知、運動和社會刺激。本實驗結(jié)果表明，EE干預(yù)后的小鼠Y迷宮實驗中交替率和新物體識別實驗中物體辨別指數(shù)顯著提高，說明豐富環(huán)境可改善慢性睡眠剝奪小鼠學習、記憶能力和認知功能。然而，在許多關(guān)于豐富環(huán)境化的研究中，研究者集中在EE和隔離環(huán)境（isolation environment， IE）動物的比較上［33-34，38-39］。值得注意的是，社會隔離本身可能導(dǎo)致一系列神經(jīng)元和行為的改變，已經(jīng)證明這種類型的環(huán)境條件是一種應(yīng)激因素［40］。本實驗在開始前將各組小鼠置于相應(yīng)環(huán)境中飼養(yǎng)七個月，有效減小了這種因素帶來的實驗誤差。

Figure 2. Comparison of discrimination indexes for new object recognition experiments in various groups of mice.Mean±SD. n=10. *P＜0.05， **P＜0.01 vs Ctrl group；##P＜0.01 vs SD group.圖2 各組小鼠的新物體識別實驗的辨別指數(shù)比較

Figure 3. Effects of enrichment on Aβ1-42 expression in chronic sleep deprivation mice. Immunofluorescence staining of Aβ1-42（red） and DAPI （blue） of the prefrontal cortex（A） and hippocampal （B） in each group. Scale bar=50 μm. Mean±SD. n=6. *P＜0.05，**P＜0.01 vs Ctrl group； ##P＜0.01 vs SD group.圖3 豐富環(huán)境對慢性睡眠剝奪小鼠Aβ1-42表達的影響

睡眠剝奪會引起過度磷酸化的tau聚集體和Aβ斑塊的積累［41］。腦脊液中的Aβ水平也隨著Aβ水平在腦中的沉積而降低［42-43］，重要的是，血漿中的Aβ水平平行地降低［42］。其中血漿 Aβ 水平為 AD 的發(fā)病前生物標志物，升高的 Aβ1-42 水平與轉(zhuǎn)化為 AD 的風險增加有關(guān)［44］。有研究表明，AB1-42 的沉積可能先于和促進血漿中可檢測到的 Aβ 水平升高［45-46］，并且Aβ1-42在Aβ1-40之前沉積［46］。近年來，人們對EE影響的研究逐漸增加［47-49］，但EE如何治療睡眠剝奪引起大腦變化的分子基礎(chǔ)仍不清楚。本實驗通過對小鼠海馬與皮層組織分別進行免疫熒光染色評估正常和慢性睡眠剝奪小鼠在EE干預(yù)和不干預(yù)后Aβ1-42表達水平的變化。實驗結(jié)果表明， EE干預(yù)后，SD小鼠前額葉皮層和海馬中Aβ1-42表達顯著降低；相反，未接受EE干預(yù)的SD小鼠前額葉皮層和海馬中Aβ1-42表達均有不同程度的升高，提示慢性睡眠剝奪可能會引起海馬中Aβ1-42的沉積，而EE干預(yù)可有效改善慢性睡眠剝奪小鼠前額葉皮質(zhì)和海馬Aβ1-42的沉積。

Figure 4. Effect of enrichment on expression levels with BACE1 was detected by Western blot. Mean±SD. n=6. *P＜0.01 vs Ctrl group； ##P＜0.01 vs SD group.圖4 豐富環(huán)境對與BACE1表達水平的影響

但近年來的實驗多側(cè)重于探究EE對Aβ以及突觸可塑性的影響［50-53］，而EE對Aβ相關(guān)代謝分子的影響仍需進一步探索。本實驗首次探討EE對Aβ相關(guān)代謝分子BACE1表達水平的影響，從而進一步研究豐富環(huán)境減少慢性睡眠剝奪小鼠Aβ產(chǎn)生的機制。BACE1切割代表Aβ生成的第一步，并啟動導(dǎo)致AD神經(jīng)變性的淀粉樣蛋白級聯(lián)反應(yīng)［54］，BACE1表達的增加促進了β淀粉樣前體蛋白被β分泌酶途徑加工，導(dǎo)致更多的有神經(jīng)毒性的Aβ1-42產(chǎn)生［55］。有研究表明睡眠剝奪小鼠模型的腦組織中，特別是顳葉皮質(zhì)和海馬中 BACE1活性顯著升高［54，56-57］。本實驗通過Western blot法檢測BACE1的表達水平來研究豐富環(huán)境減少慢性睡眠剝奪小鼠Aβ產(chǎn)生的機制，從而評估豐富環(huán)境對慢性睡眠剝奪小鼠Aβ生成的影響。本實驗結(jié)果表明，EE干預(yù)后，SD小鼠前額葉皮層和海馬中BACE1蛋白表達被抑制；未接受EE干預(yù)的SD小鼠前額葉皮層和海馬中BACE1表達水平升高，提示豐富環(huán)境可改善慢性睡眠剝奪后BACE1蛋白的表達升高。

綜上所述，EE可以降低慢性睡眠剝奪小鼠前額葉皮層和海馬中Aβ1-42的沉積及BACE1蛋白的表達，同時改善慢性睡眠剝奪后小鼠學習、記憶以及認知功能。我們研究的Aβ代謝相關(guān)分子僅涉及BACE1方面，而對Aβ其他相關(guān)代謝途徑的具體機制仍需進一步研究。