郭燕霞， 顏 敏， 李 麗， 趙 麗，2， 李 巖，2△

（1北京體育大學運動生理學教研室，北京 100084；2北京體育大學運動與體質(zhì)健康教育部重點實驗室，北京 100084）

青春期是發(fā)生酒精依賴的高峰階段。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，在全世界范圍內(nèi)有超過四分之一的15～19歲青少年是飲酒者，總量約有1.55億［1］。青春期是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵期。處于青春期的腦表現(xiàn)出對獎勵刺激過度敏感和低抑制能力的特點，促使青少年積極參與一些高風險行為，如酒精濫用等。然而，青春期發(fā)育階段的腦對酒精的傷害更加敏感，青春期酒精濫用會造成腦在結(jié)構(gòu)和功能上的持久性損傷，導致成年后的認知障礙［2］。因此，青少年酒精濫用造成了極大的社會壓力和經(jīng)濟負擔，是全世界公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要問題之一。海馬是與認知功能關(guān)系密切的腦區(qū)，海馬的神經(jīng)炎癥是導致認知障礙的重要原因［3］。諸多研究表明，青春期酒精暴露導致神經(jīng)免疫功能失衡，繼而誘發(fā)海馬神經(jīng)炎癥，導致持久性損傷。小膠質(zhì)細胞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞，可持續(xù)監(jiān)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境，維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。普通小膠質(zhì)細胞處于免疫抑制狀態(tài)，但當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到內(nèi)源性或外源性病理損傷時，小膠質(zhì)細胞表面受體可以識別病原體、細胞碎片或異常蛋白等，誘導小膠質(zhì)細胞激活。激活的小膠質(zhì)細胞具有神經(jīng)炎性損傷和神經(jīng)保護的雙重作用。但在這一過程中，小膠質(zhì)細胞常被過度激活，導致炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生和吞噬活性的加劇，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)無法維持正常的認知功能［4］。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期腦中的小膠質(zhì)細胞對酒精極為敏感，新生時［5］和青春期［6］酒精暴露均會導致海馬小膠質(zhì)細胞激活。激活的小膠質(zhì)細胞包括致炎型（M1型）和抗炎型（M2型），M1/M2表型極化在炎癥反應(yīng)和神經(jīng)修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，但青春期酒精濫用對海馬小膠質(zhì)細胞M1/M2表型極化的影響還未見文獻報道。

青春期酒精暴露誘導的認知損傷雖持久，但可逆。已有研究表明，青春期酒精暴露誘導的分子、突觸、生理和行為改變可以通過阻斷促炎基因表達來預(yù)防和逆轉(zhuǎn)［7］。研究表明，規(guī)律的運動鍛煉可以調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性，防治成癮、癡呆、抑郁癥和焦慮癥等諸多神經(jīng)精神疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，運動可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)獎賞中樞中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area， VTA）突觸可塑性，減輕成癮行為［8］。本課題組使用不同月齡的阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)運動可以調(diào)節(jié)AD小鼠海馬和皮層小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活性，減輕神經(jīng)炎癥，從而改善小鼠的學習記憶能力［3］。前人研究發(fā)現(xiàn)，運動可以緩解新生后和青春期酒精暴露誘導的神經(jīng)損傷和認知障礙［9-12］，但其中樞機制遠未明了，運動是否通過調(diào)節(jié)海馬小膠質(zhì)細胞活性和表型極化實現(xiàn)減輕酒精濫用誘導的神經(jīng)炎癥的效果更是未見報道。因此，本研究擬以大鼠為研究對象，建立青春期間歇性酒精暴露（adolescent intermittent ethanol exposure， AIE）模型，使用行為學、免疫熒光染色和ELISA技術(shù)，觀察有氧運動對AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞活性和M1/M2表型極化的影響，以期為運動緩解青春期酒精濫用導致的認知損傷提供一定的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物

出生后 21 d（postnatal day 21， P21）SPF級雄性Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2021-0006］，分籠飼養(yǎng)于北京體育大學動物房，國家標準嚙齒動物飼料喂養(yǎng)，晝夜節(jié)律人工控制光照（光照時間6：00～18：00），環(huán)境溫度為22～24 ℃，相對濕度為50%～65%。動物自由進食及飲水，5 d換1次墊料，以保持環(huán)境清潔干燥。動物實驗的處理方法符合北京體育大學運動科學實驗倫理委員會的相關(guān)規(guī)定（批準號2020118A）。

2 主要試劑與儀器

白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）ELISA試劑盒（ab100768）、IL-6 ELISA試劑盒（ab100772）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）ELISA試劑盒（ab46070）、IL-10 ELISA試劑盒（ab100765）和兔單克隆離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calciumbinding adapter molecule-1， Iba-1；小膠質(zhì)細胞標志物）抗體（ab178847）均購自 Abcam；RIPA裂解液（89900）和蛋白酶抑制劑（78443）均購自Thermo Fisher Scientific；BCA蛋白定量試劑盒（23227）購自Pierce； 小鼠單克隆CD16抗體（sc-52376）和CD206抗體（sc-58986）均購自Santa Cruz。大鼠八臂迷宮視頻分析系統(tǒng)（JLBehv-8ARM，上海吉量軟件科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（SP8， Leica）；微孔板吸光度分光光度計（xMark， Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 AIE模型建立及運動方案 動物建模、運動干預(yù)和指標測試流程如圖1所示。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將P28的大鼠隨機分為生理鹽水安靜（saline sedentary， SS）組、生理鹽水運動（saline exercise， SE）組、酒精安靜（alcohol sedentary， AS）組和酒精運動（alcohol exercise， AE）組。參考 Vetreno等［12］的方案，從P28到P55，AS和AE組大鼠進行酒精灌胃（200 g/L乙醇，5.0 g/kg，2 d灌胃，2 d休息，共4周），SS和SE組大鼠在同一時點接受等體積的生理鹽水灌胃。前人和本課題組研究表明，這種灌胃方法可使大鼠血液酒精濃度達到約160 mg/dL的水平［12］。從P28到P83，SE和AE組大鼠進行8周跑臺運動干預(yù)。正式訓練前，進行3 d的適應(yīng)性訓練：第1天，10 m/min，坡度為0，30 min；第2天，15 m/min，坡度為0，30 min；第3天，15 m/min，坡度為0，60 min。適應(yīng)性訓練后，進行正式訓練（參考Gomes da Silva等［13］的研究制定方案）：前10 min跑臺速度為15 m/min，后50 min跑臺速度為18 m/min，坡度為0，每天60 min，每周5 d，共8周。該運動方案已經(jīng)被前人研究證實是有氧運動方案且可有效調(diào)節(jié)青春期大鼠海馬突觸可塑性［13-14］。SS和AS組大鼠每天放入跑臺，但不開啟電源，不進行運動干預(yù)。最后一次運動24 h后進行指標測試和取材，避免最后一次運動的應(yīng)激作用。

Figure 1. Timeline of the experiment.圖1 實驗時程圖

3.2 八臂迷宮行為學測試 實驗過程分為適應(yīng)期和測試過程，實驗前各大鼠禁食24～34 h限制其體重下降至正常進食鼠的80%～85%。實驗測試期間每天限制飲食，以維持體重范圍至實驗結(jié)束。適應(yīng)期：大鼠進行為期3 d的實驗環(huán)境適應(yīng)過程，在迷宮每個臂盡頭端均放置食餌，將每只大鼠依次置于迷宮中央，讓其自由探索10 min。適應(yīng)過程結(jié)束后，將1、2、5、7臂設(shè)置為目標臂，且整個實驗過程中保持不變。測試過程：在目標臂末端的食槽中放置食餌，將大鼠放于關(guān)閉各臂門的迷宮中央?yún)^(qū)，10 s后同時將各臂門打開并進行視頻采集。大鼠在迷宮中自由搜尋并攝取食餌，當大鼠到達四個放有食餌的目標臂時停止實驗，若10 min后仍未尋找完所有目標臂，也停止實驗。實驗環(huán)境要求安靜，保持較暗光線，周圍環(huán)境標志物保持固定不變，每次實驗后用酒精擦拭去除氣味干擾。每只大鼠每天測試一次，共測試10天。測試指標如下：工作記憶錯誤，即在同一次訓練中大鼠再次進入已經(jīng)吃過食餌的臂；參考記憶錯誤，即動物進入不曾放過食餌的臂；完成時間，即動物完成測試所用的時間。

3.3 免疫熒光染色 大鼠用異氟烷麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦，進行后固定。蔗糖溶液梯度脫水，OCT包埋后，使用冰凍切片機進行全腦冠狀切片，制備30 μm的海馬腦片。腦片水化后用蛋白酶K進行抗原修復(fù)和10%的山羊血清封閉，加入Ⅰ抗（Iba-1抗體，1∶200；CD16或CD206抗體，1∶100），4 ℃孵育2 d后復(fù)溫1 h，滴加Ⅱ抗（Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG或Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG，1∶600）孵育1 h后封片，使用激光共聚焦顯微鏡拍照。每組隨機選取6個視野，進行數(shù)據(jù)分析。使用ImageJ軟件對Iba-1陽性細胞數(shù)和DAPI數(shù)目進行自動計數(shù)，計算兩者比值（Iba-1/DAPI）。分別使用小膠質(zhì)細胞M1表型細胞表面標志物CD16和M2表型細胞表面標志物CD206與小膠質(zhì)細胞特異性標志Iba-1進行免疫熒光共染檢測小膠質(zhì)細胞極化的情況。使用Image-Pro Plus軟件進行單通道細胞分割，創(chuàng)建選取區(qū)添加到ROI Manager中，隨后用自動計數(shù)的方法計算CD16或CD206分別與Iba-1共染的細胞數(shù)目。

3.4 ELISA檢測炎癥因子表達 大鼠用異氟烷麻醉，斷頭取腦，分離海馬組織。每100 mg海馬組織中加入1 mL含有蛋白酶抑制劑的裂解液進行充分勻漿。勻漿液于4 ℃、13 000×g離心30 min，提取上清液。隨后用BCA法測定總蛋白濃度。按照試劑盒說明書檢測各組小鼠海馬腦區(qū)組織液中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平，用酶標儀讀取吸光度，在標準品濃度和吸光度之間建立回歸/擬合模型，并根據(jù)待測樣品反應(yīng)的吸光度計算待測樣品濃度。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結(jié)果均以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。在滿足方差齊性的條件下，八臂迷宮實驗數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，其它數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學顯著性。

結(jié) 果

1 有氧運動對AIE大鼠成年期學習記憶能力的影響

八臂迷宮實驗結(jié)果如圖2所示。對工作記憶錯誤次數(shù)進行重復(fù)測量方差分析（圖2A），結(jié)果顯示時間主效應(yīng)顯著（P＜0.01），組別主效應(yīng)顯著（P＜0.05），時間與組別的交互效應(yīng)不顯著（P＞0.05），各組工作記憶錯誤次數(shù)均隨時間顯著下降。多重比較結(jié)果顯示，在第1天和第4天，AS組工作記憶錯誤次數(shù)顯著多于SS組（第1天，P＜0.05；第4天，P＜0.01）；在第2天，AE組工作記憶錯誤次數(shù)顯著少于AS組（P＜0.01）。對參考記憶錯誤次數(shù)進行重復(fù)測量方差分析（圖2B），結(jié)果顯示時間主效應(yīng)顯著（P＜0.01），組別主效應(yīng)顯著（P＜0.05），時間與組別的交互效應(yīng)不顯著（P＞0.05），各組參考記憶錯誤次數(shù)均隨時間顯著下降。多重比較結(jié)果顯示，在第4天，AS組工作記憶錯誤次數(shù)顯著多于SS組（P＜0.05）。對完成時間進行重復(fù)測量方差分析（圖2C），結(jié)果顯示時間主效應(yīng)、組別主效應(yīng)及時間與組別的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01），各組完成時間均隨時間顯著下降。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，在第1、3和4天，AS組完成時間顯著多于SS組（均P＜0.01）；在第1～4天，AE組完成時間顯著少于AS組（第1、2和3天，均P＜0.01；第4天，P＜0.05）。以上結(jié)果提示，AIE大鼠成年期出現(xiàn)認知功能障礙；8周有氧運動緩解AIE大鼠成年期認知障礙。

Figure 2. The cognitive performance of rats in eight-arm radial maze test. A： the working memory errors； B： the reference memory errors； C： the finish time. Mean±SEM. n=6. *P＜0.05， **P＜0.01 vs SS group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs AS group.圖2 各組大鼠八臂迷宮行為學測試結(jié)果

2 有氧運動對AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞激活水平的影響

海馬Iba-1免疫熒光染色結(jié)果如圖3所示。對海馬小膠質(zhì)細胞數(shù)量進行雙因素方差分析（圖3B），結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)、運動主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組海馬小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著多于SS組（P＜0.01），AE組海馬小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著少于AS組（P＜0.01）。對海馬小膠質(zhì)細胞形態(tài)指數(shù)（胞體面積/分枝面積）進行雙因素方差分析（圖3C），結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)、運動主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組海馬小膠質(zhì)細胞形態(tài)指數(shù)顯著大于SS組（P＜0.01），AE組海馬小膠質(zhì)細胞形態(tài)指數(shù)顯著小于AS組（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞激活水平增加；8周有氧運動降低AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞激活水平。

3 有氧運動對AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞極化表型的影響

圖4和圖5A中的CD16和Iba-1共定位免疫熒光染色為M1型小膠質(zhì)細胞，各組海馬M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量如圖5B所示。對CD16+/Iba-1+的小膠質(zhì)細胞數(shù)量進行雙因素方差分析（圖5B），結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)、運動主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，SE組海馬CD16+/Iba-1+小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著少于SS組（P＜0.01），AS組海馬CD16+/Iba-1+小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著多于SS組（P＜0.01），AE組海馬CD16+/Iba-1+小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著少于AS組（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞M1型極化增加；8周有氧運動減少AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞 M1型極化。

Figure 3. The activition of microglia in the hippocampus of rats. A： immunofluorescence staining of Iba-1 in the hippocampus （scale bar=10 μm）； B： the number of microglia in the hippocampus； C： the morphological index （soma area/arborization area） of microglia in the hippocampus. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs SS group； ##P＜0.01 vs AS group.圖3 各組大鼠海馬小膠質(zhì)細胞激活水平

Figure 4. Immunofluorescence staining of M1 microglia in the hippocampus of rats （scale bar=25 μm）.圖4 各組大鼠海馬M1型小膠質(zhì)細胞

圖6和圖7A中的CD206和Iba-1共定位免疫熒光染色為M2型小膠質(zhì)細胞，各組海馬M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量如圖7B所示。對CD206+/Iba-1+的小膠質(zhì)細胞數(shù)量進行雙因素方差分析（圖7B），結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)、運動主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組海馬CD206+/Iba-1+小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著多于SS組（P＜0.01），AE組海馬CD206+/Iba-1+小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著多于AS組（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞M2型極化增加；8周有氧運動增加AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞M2型極化。

4 有氧運動對AIE大鼠成年期海馬神經(jīng)炎癥的影響

Figure 5. The number of M1 microglia in the hippocampus of rats. A： co-immunofluorescence staining of CD16/Iba-1 in the hippocampus （scale bar=75 μm； representative CD16/Iba-1 positive cells were indicated by the arrows）； B： the number of CD16/Iba-1 positive cells. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs SS group； ##P＜0.01 vs AS group.圖5 各組大鼠海馬M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量

Figure 6. Immunofluorescence staining of M2 microglia in the hippocampus of rats （scale bar=25 μm）.圖6 各組大鼠海馬M2型小膠質(zhì)細胞

各組海馬炎癥因子的表達如表1所示。對海馬IL-1β的表達進行雙因素方差分析，結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01），運動主效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組IL-1β表達顯著高于SS組（P＜0.01），AE組IL-1β表達顯著低于AS組（P＜0.05）。對海馬IL-6的表達進行雙因素方差分析，結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.01），運動主效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組IL-6表達顯著高于SS組（P＜0.01），AE組IL-6表達顯著低于AS組（P＜0.05）。對海馬TNF-α的表達進行雙因素方差分析，結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)、運動主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.05或P＜0.01）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組TNF-α表達顯著高于SS組（P＜0.01），AE組TNF-α表達顯著低于AS組（P＜0.01）。對海馬IL-10的表達進行雙因素方差分析，結(jié)果顯示酒精暴露主效應(yīng)及酒精暴露和運動的交互效應(yīng)均顯著（P＜0.05或P＜0.01），運動主效應(yīng)不顯著（P＞0.05）。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，AS組IL-10表達顯著低于SS組（P＜0.01），AE組IL-10表達顯著高于AS組（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，AIE大鼠成年期海馬促炎因子表達增加，抗炎因子表達減少，出現(xiàn)神經(jīng)炎癥；8周有氧運動使AIE大鼠成年期海馬促炎因子表達降低，抗炎因子表達增加，神經(jīng)炎癥減輕。

表1 各組大鼠海馬炎癥因子水平Table 1. The levels of inflammatory cytokines in the hippocampus of rats in each group ［ng/（g protein）. Mean±SEM］

討 論

Figure 7. The number of M2 microglia in the hippocampus of rats. A： co-immunofluorescence staining of CD206/Iba-1 in the hippocampus （scale bar=75 μm； representative CD206/Iba-1 positive cells were indicated by the arrows）； B： the number of CD206/Iba-1 positive cells. Mean±SEM. n=6. **P＜0.01 vs SS group； ##P＜0.01 vs AS group.圖7 各組大鼠海馬M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量

運動對成癮物質(zhì)導致的腦損傷具有修復(fù)作用［8］。諸多研究表明，運動可以改善青春期酒精濫用導致的認知損傷，但其神經(jīng)生物學機制遠未明了。本研究發(fā)現(xiàn)，8周有氧運動調(diào)控AIE大鼠成年期海馬小膠質(zhì)細胞極化表型，使抗炎的M2型極化增加，降低小膠質(zhì)細胞過度激活，改善海馬神經(jīng)炎癥，提高AIE大鼠成年期認知功能。

長期酒精濫用會造成動物模型出現(xiàn)學習記憶能力下降、抑郁、焦慮等行為學改變，這也是評價建模成功與否的標準之一［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，AS組大鼠成年期工作記憶錯誤、參考記憶錯誤和完成時間顯著高于SS組（圖2），這再次證實青春期酒精濫用會導致持續(xù)至成年的認知障礙，也說明本研究AIE大鼠建模成功。前人關(guān)于AIE對學習記憶能力影響的報道存在差異，多個研究均發(fā)現(xiàn)青春期酒精濫用模型出現(xiàn)工作記憶能力下降［17-19］，但參考記憶能力無變化［17］。Mews等［20］認為酒精暴露造成的認知損傷在于酒精暫時性阻斷長期記憶的形成，即酒精濫用主要影響短期記憶到長期記憶轉(zhuǎn)換和存儲，而對短期記憶的形成和原本儲存在腦內(nèi)長期記憶的回憶沒有影響或者影響有限。也有部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)青春期酒精濫用對認知功能沒有影響，如Matthews等［21］未發(fā)現(xiàn)AIE大鼠的Morris水迷宮測試結(jié)果有顯著性差異；Silvers等［22］在AIE模型的青春期末期也未觀察到工作記憶和參考記憶出現(xiàn)差異。本研究發(fā)現(xiàn)AIE大鼠的工作記憶和參考記憶都出現(xiàn)損傷，但工作記憶的損傷程度更嚴重，而相比于工作記憶和參考記憶，完成測試的總時間體現(xiàn)出的損傷程度最為嚴重，這一定程度上與前人得出的青春期酒精濫用對學習記憶能力的影響具有選擇性的觀點相一致［23］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AIE大鼠工作記憶錯誤和參考記憶錯誤的增加主要出現(xiàn)在測試初期，這和AD模型的表現(xiàn)不同［24］，說明酒精濫用導致的認知損傷與AD具有顯著差異。以上結(jié)果說明酒精濫用造成的認知損傷十分復(fù)雜，實驗動物月齡、性別、酒精濫用造模范式和認知功能評價方法的選擇均可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，青春期酒精濫用對腦損傷的影響需進行進一步深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)8周有氧運動可以減少AIE大鼠八臂迷宮測試的工作記憶錯誤（圖2A）和完成時間（圖2C），說明運動對AIE大鼠的認知損傷具有改善作用。本研究發(fā)現(xiàn)運動對AIE大鼠的參考記憶錯誤無影響（圖2B），這可能與參考記憶或長期記憶 損 傷 對 酒 精 濫 用 不 敏 感 有 關(guān)［17，19-20］。 Hamilton等［11］使用追蹤性眨眼條件反射和條件性恐懼等行為學測試發(fā)現(xiàn)運動改善青春期酒精濫用導致的海馬相關(guān)的學習記憶能力損傷，結(jié)果與本研究一致。但也有結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動對酒精濫用大鼠的學習記憶能力無影響［18，25］，這可能與動物月齡、性別、酒精濫用造模范式和認知功能評價方法的不同有關(guān)，也可能與運動干預(yù)方式（自主跑輪、游泳或跑臺）、運動干預(yù)時間和運動強度的不同有關(guān)。

海馬出現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)是導致突觸損傷和認知障礙的重要原因。越來越多的證據(jù)表明酒精濫用導致的海馬小膠質(zhì)細胞過度激活和過度神經(jīng)炎癥是導致突觸損傷和認知功能障礙的重要原因［26-28］。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的吞噬細胞，在正常生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)為靜息態(tài)小膠質(zhì)細胞，胞體細長或橢圓，表面具有分枝狀的突起，這些突起可不斷伸縮以監(jiān)控腦內(nèi)微環(huán)境的變化。當小膠質(zhì)細胞受到酒精等刺激時被激活，胞體體積增大，分枝縮短，轉(zhuǎn)化為阿米巴樣小膠質(zhì)細胞。適度激活的小膠質(zhì)細胞吞噬作用增強，有助于維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但過度激活的小膠質(zhì)細胞會引起級聯(lián)炎癥反應(yīng)，進而導致神經(jīng)毒性作用和突觸損傷。本研究發(fā)現(xiàn)AIE大鼠海馬的小膠質(zhì)細胞在成年期（酒精戒斷30天后）依然保持大量活化的狀態(tài)，小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，胞體體積增大，分枝面積減小，轉(zhuǎn)化為阿米巴樣形態(tài)（圖3）。8周有氧運動減少AIE大鼠海馬小膠質(zhì)細胞數(shù)量，減小胞體體積，增大分枝面積，降低小膠質(zhì)細胞過度激活（圖3），這可能是運動改善AIE大鼠認知障礙的機制之一。

小膠質(zhì)細胞活化后，根據(jù)其極化方向不同而表現(xiàn)為神經(jīng)毒性或神經(jīng)保護性作用，其中M1型小膠質(zhì)細胞活化后釋放多種促炎因子，誘導神經(jīng)損傷，M2型小膠質(zhì)細胞可以通過產(chǎn)生抗炎因子和組織修復(fù)活性因子抑制過度的神經(jīng)炎癥，恢復(fù)腦內(nèi)平衡以抑制神經(jīng)損傷，因此小膠質(zhì)細胞活化在神經(jīng)免疫過程中發(fā)揮雙刃劍的作用［29］。本研究分別選用CD16和CD206作為M1型小膠質(zhì)細胞和M2型小膠質(zhì)細胞的標志物，觀察運動對AIE大鼠海馬成年期小膠質(zhì)細胞極化表型的影響。研究結(jié)果表明AIE大鼠成年期海馬腦區(qū)M1型和M2型小膠質(zhì)細胞的數(shù)量均出現(xiàn)增加，且M1型極化的數(shù)量多于M2型極化的數(shù)量（圖5、7）。Peng等發(fā)現(xiàn)酒精暴露誘導成年大鼠內(nèi)嗅皮層和海馬的M1型和M2型小膠質(zhì)細胞均增加［30］，他們在使用青春期大鼠建立的酒精依賴模型上也觀察到M1型小膠質(zhì)細胞和M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量的增加，且增加的持續(xù)時間比成年大鼠長［27］。Jiang等也觀察到酒精暴露會使小鼠M1和M2型小膠質(zhì)細胞的炎性標志物均出現(xiàn)增加［28］。本研究選用出生后28天的大鼠進行AIE模型的建立，同樣觀察到M1型和M2型小膠質(zhì)細胞均出現(xiàn)增加（圖5、7），本研究一方面豐富了酒精濫用導致腦損傷的理論基礎(chǔ)；另一方面，本研究從小膠質(zhì)細胞極化表型的角度再一次證實處于青春期的腦對酒精暴露極為敏感。小膠質(zhì)細胞M1型極化后分泌大量促炎因子，介導神經(jīng)損傷。本研究發(fā)現(xiàn)AIE大鼠海馬內(nèi)的IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子釋放增加（表1），這可能歸因于M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量的增加。小膠質(zhì)細胞M2型極化后抑制促炎因子的釋放并促進IL-10等抗炎因子的釋放，發(fā)揮認知保護作用，有趣的是，在本研究中AIE大鼠小膠質(zhì)細胞M2型極化增加，但IL-10釋放卻減少（表1）。我們推測這可能與兩方面的因素有關(guān)：（1）腦內(nèi)IL-10分泌的調(diào)控機制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明。從來源看，小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞均可分泌IL-10，M1型小膠質(zhì)細胞誘導星形膠質(zhì)細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，M2型小膠質(zhì)細胞誘導星形膠質(zhì)細胞分泌IL-4和IL-10［31］。本研究中AIE大鼠M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量少于M1型，因此推測星形膠質(zhì)細胞可能主要以分泌促炎因子為主，分泌IL-10較少。（2）M2型小膠質(zhì)細胞分泌的神經(jīng)保護因子除IL-10外，還有IL4、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β， TGF-β）等，且不同亞型（M2a、M2b和M2c）的M2小膠質(zhì)細胞功能存在差異［32］，因此推測本研究中AIE大鼠M2型極化增加和IL-10釋放減少可能與M2型小膠質(zhì)細胞的不同亞型有關(guān)，但本研究并沒有進一步檢測不同亞型的數(shù)量，這是本研究的不足之處。本研究通過進行8周有氧運動干預(yù)，觀察到運動使AIE大鼠海馬M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，即運動有效誘導小膠質(zhì)細胞從M1促炎表型向M2抗炎表型極化（圖5、7）。此外，我們觀察到運動使AIE大鼠海馬IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放減少，IL-10的釋放增加，改善了AIE大鼠海馬的神經(jīng)炎癥（表1）。Vetreno等［26］的研究表明運動可減輕AIE模型海馬的神經(jīng)炎癥。本研究在前人研究基礎(chǔ)上證實，運動改善AIE模型海馬神經(jīng)炎癥的機制可能是運動誘導小膠質(zhì)細胞極化表型轉(zhuǎn)向M2型，降低小膠質(zhì)細胞過度激活。因此，本研究是已有研究的深入，突出了小膠質(zhì)細胞活化水平和極化表型在青春期酒精濫用導致腦損傷及其運動干預(yù)中的潛在作用，為青春期酒精濫用所致認知障礙的治療提供了潛在靶點。但本研究并未對運動調(diào)控小膠質(zhì)細胞激活和極化表型的分子機制進行探索，這是本研究的不足之處。已有文獻報道，AIE可導致腦內(nèi)的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂［33］，而大麻素1型受體和2型受體在小膠質(zhì)細胞激活和極化表型調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用［34］。運動可以促進內(nèi)源性大麻素釋放［35］，因此推測運動通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)抑制AIE大鼠海馬小膠質(zhì)細胞激活，誘導極化表型轉(zhuǎn)向M2型，但其具體機制仍待進一步深入研究。

綜上所示，本研究結(jié)果提示運動誘導海馬小膠質(zhì)細胞M2型極化增加，降低小膠質(zhì)細胞激活，抑制神經(jīng)炎癥。本研究為運動改善青春期酒精濫用導致的認知障礙提供了一定實驗依據(jù)。