唐瀟瀟， 汪 源， 李婷婷

（南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510510）

結直腸癌（colorectal cancer）是當今世界威脅人類健康的一大癌癥，轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因［1-2］。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）在結直腸癌遠處轉移的過程中扮演了重要的角色。EMT是細胞失去上皮特性而獲得間充質細胞特性的過程，這一過程在正常機體中通常發(fā)生于發(fā)育和傷口愈合中，但在腫瘤中則與腫瘤的發(fā)生、進展、遷移、血管內滲入和遠處轉移等各重要過程密切相關，它減弱細胞間黏附作用，增強腫瘤細胞的侵襲力［3-4］。同源盒蛋白B7（homeobox protein 7， HOXB7）屬于同源異型盒家族。同源盒基因首先在果蠅體內被發(fā)現，是在包括人在內的動物的胚胎發(fā)育和細胞分化中發(fā)揮重要作用的一類基因。許多證據顯示，HOX基因表達紊亂可能在腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用；目前已知其在黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、口腔癌、前列腺癌等腫瘤中有異常表達［5］，且與腫瘤的分級和分化有關。近年來，多個研究對HOXB7在腫瘤中的作用進行了分析，發(fā)現HOXB7在腫瘤細胞的增殖、運動和侵襲中起到重要作用。本研究探討HOXB7對結直腸癌轉移的影響。

材料和方法

1 細胞

SW480和SW620結腸腺癌細胞株為南方醫(yī)科大學病理教研室自存。

2 主要試劑

胰蛋白酶購自Gibco；瓊脂糖購自Biowest；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；EDTA抗原修復液（pH 6.0）、PBS和通用型SP試劑盒（SP-9000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；pSUPER.puro質粒購自Oligoengine；Dual-Luciferase Reporter Assay System （Promega）。

3 主要方法

3.1 細胞培養(yǎng) 細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗（含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2相對濕度飽和的培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

3.2 過表達HOXB7的SW480細胞株的構建 根據GenBank中已登錄的目的基因HOXB7序列，使用Primer Premier 5軟件輔助自行設計引物，上游引物5＇-CCCAAGCTTATCAAGGAATCTCGTAAAACCGA-3＇，下 游 引 物 5＇-ATTGCGGCCGCCCATCCTTTAGATACACACAGA-3＇。使用該引物在提取的RNA中反轉錄得到cDNA，與pSin質粒連接。最終將HOXB7/pSin質粒轉入SW480細胞。

3.3HOXB7特異性shRNA的合成 利用Invitrogen網站（http：//rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/）提供的免費軟件設計合成HOXB7基因的特異性干擾片段，shRNA正義鏈5'-CGGAGCCTTCCCAGAACAAACTTCT-3'，反 義 鏈 5'-GGAGCCTTCCCAGAACAAACTTCTT-3'。用Hind III和BglII對 shHOXB7重組質粒進行雙酶切鑒定。選擇對數生長期細胞制備SW480細胞和SW620細胞懸液及shRNA-Lipofectamine? 2000 Reagent復合物的實驗組（HBOX7干擾組）和陰性對照組，將shRNA連接到pSUPER.puro質粒然后轉染SW480細胞和SW620細胞。

3.4 Transwell小室實驗檢測HOXB7對SW480和SW620細胞遷移和侵襲的影響 用PBS洗去細胞完全培養(yǎng)基殘液后，換成RPMI-1640培養(yǎng)基進行饑餓培養(yǎng)過夜，將胰酶消化的SW480和SW620細胞經無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為1×106mL-1，并將其 200 μL 混懸液接種至 Transwell上室。遷移實驗和侵襲實驗中，下室都加入800 μL含有10%胎牛血清培養(yǎng)基，在侵襲實驗中Transwell上室還預鋪有基質膠。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除小室中培養(yǎng)液，用棉球輕擦去小室上室的細胞。使用4%多聚甲醛固定小室和下室15 min，PBS潤洗3次，每次5 min；Giemsa染色30 min，PBS潤洗3次，每次3 min，在倒置顯微鏡下計數，并采集倒置的小室下室的細胞圖像。

3.5 細胞劃痕實驗檢測HOXB7對SW480和SW620細胞遷移的影響 取對數生長期細胞接種到6孔板中，在恒溫孵箱中培養(yǎng)，等細胞長滿視野時進行后續(xù)實驗。使用黑色馬克筆于6孔板背后劃線。使用高溫滅菌的20 μL槍頭在孔板上垂直于線劃痕，保證槍頭劃痕時垂直。劃好后充分沖洗，將殘余懸浮細胞沖洗掉。然后向孔內加入不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，置于恒溫孵箱孵育。分別于24和48 h后在顯微鏡下取點，觀察，拍照。與0 h的初始距離（D0h）作對比，分別測量細胞遷移的距離，計算細胞的遷移率。遷移率（%）=（D48h-D0h）/D0h×100%。

3.6 Western blot檢測蛋白表達 用放射免疫沉淀測定裂解液提取各組細胞的總蛋白，測定蛋白濃度后，取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE、轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉膜2 h后，分別加入兔抗人HOXB7、E-cadherin、α-catenin、vimentin、N-cadherin、Snail和α-tubulin抗體4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的抗兔、抗鼠Ⅱ抗室溫孵育1 h后加入化學發(fā)光試劑孵育1 min，迅速用保鮮膜包好后置于暗盒內曝光1 min左右。X膠片經顯影、定影后掃描記錄。

3.7 免疫熒光染色 將經泡酸，洗滌，高壓后的蓋玻片放入24孔板內消化細胞，調整細胞濃度調整1×105mL-1，按每孔1 mL細胞懸液加入預先鋪好蓋玻片的24孔板中，入37 ℃、5% CO2濕化培養(yǎng)箱內孵育，待細胞生長至約90%，取出，洗滌，4%多聚甲醛固定過夜。每孔按實驗計劃加入E-cadherin、α-catenin、vimentin、N-cadherin、Snail和α-tubulin抗體，搖床上室溫過夜。加入相應的熒光Ⅱ抗，室溫，搖床上1 h。洗滌，吸掉液體，吹風機吹干，滴加2 μL 50%甘油與載玻片上，將蓋玻片的細胞面朝下，倒扣在載玻片的甘油上，標記，置于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

3.8 裸鼠體內實驗 將SW480/vector細胞、SW480/HOXB7細胞、SW620/scrambled細胞和SW620/shHOXB7#1細胞的皮下瘤組織進行結直腸癌原位手術移植，每組6只裸鼠，每只裸鼠接種100 μL細胞懸液，其中含有1×107個細胞。于6周后處死裸鼠，對原發(fā)灶及各臟器進行取材，測量原發(fā)腫瘤大小，計數各臟器轉移瘤個數，連續(xù)切片，HE染色觀察轉移情況。

4 統(tǒng)計學處理

各獨立實驗均重復3次。采用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計分析處理數據。數據用均數±標準差（mean±SD）表示。兩實驗組間均數比較采用t檢驗，均為雙側檢驗；多實驗組間均數比較采用單因素方差分析，選用Dunnett檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 生存分析顯示HOXB7高表達的結直腸癌患者預后不良

使用 UALCAN 網站（http：//ualcan.path.uab.edu/）對 TCGA（The Cancer Genome Atlas； https：//portal.gdc.cancer.gov/）數據進行生存分析［6-7］，如圖1所示，在279名結直腸癌患者中，高表達HOXB7組的患者長期生存率更低（P=0.034）。

Figure 1. Kaplan-Meier curve showed that colorectal cancer patients with high HOXB7 expression had poor prognosis.圖1 HOXB7高表達的結直腸癌患者預后不良

2 HOXB7靶向Wnt/β-catenin通路

在過表達HOXB7的SW480細胞系和對照組之間進行差異基因表達（differential gene expression，DGE）分析和過代表分析（over-representation analy-sis， ORA）。結果顯示，Wnt/β-catenin 通路基因在HOXB7過表達樣本中顯著過表達（P＜0.01），見圖1A。此外，基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA）同樣顯示Wnt/β-catenin通路相關基因集表達水平與HOXB7表達水平正相關（P＜0.01），見圖2B。這些結果顯示，HOXB7靶向Wnt/β-catenin通路。

Figure 2. HOXB7 targets Wnt/β -catenin pathway. A： Wnt/β -catenin pathway-related genes were significantly overexpressed in HOXB7 overexpression samples； B： gene set enrichment analysis showed that the expression level of Wnt/β-catenin pathway-related gene set was positively correlated with that of HOXB7. ES： enrichment score.圖2 HOXB7靶向Wnt/β-catenin通路

3 Western blot驗證SW480和SW620細胞中HOXB7過表達或敲減

如圖3所示，HOXB7在SW480細胞中過表達，在SW620中被敲減。

Figure 3. HOXB7 was overexpressed in SW480 cells and knocked down in SW620 cells.圖3 HOXB7在SW480細胞中過表達，在SW620細胞中被敲減

4 HOXB7過表達增強SW480細胞的遷移和侵襲能力

Transwell實驗結果顯示，在遷移實驗中，過表達HOXB7組進入下室的細胞數量明顯多于陰性對照組，侵襲實驗中過表達HOXB7組穿透基質膠進入下室的細胞數量同樣明顯多于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。這一結果表明，HOXB7過表達可以增強SW480細胞的侵襲能力。

5 敲減HOXB7減弱SW620細胞的遷徙和侵襲能力

Transwell實驗結果顯示，在遷移實驗中，敲減HOXB7組進入下室的細胞數量明顯少于對照組，侵襲實驗中敲減HOXB7組穿透基質膠進入下室的細胞數量同樣明顯少于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖5。這一結果表明，敲減HOXB7可以減弱SW620細胞的侵襲能力。

6 相差顯微鏡觀察HOXB7過表達或敲減后細胞形態(tài)的變化

相差顯微鏡觀察（圖6）可見，HOXB7過表達的SW480細胞伸出偽足，而HOXB7被敲減的SW620細胞偽足消失，提示HOXB7上調可增強結直腸癌細胞的侵襲能力。

7 細胞劃痕實驗驗證HOXB7過表達或敲減對結直腸癌細胞遷移的影響

48 h細胞劃痕實驗（圖7）中，過表達HOXB7組愈合率顯著高于空載體組，敲減HOXB7組愈合率顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

8 Western blot測定HOXB7過表達或敲減對結直腸癌細胞中EMT相關蛋白表達的影響

Figure.4. The effect of HOXB7 overexpression on the migration and invasion ability of SW480 cells detected by Transwell assays（scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector.圖4 Transwell小室實驗檢測HOXB7過表達對SW480細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure.5. The effect of HOXB7 knockdown on the migration and invasion ability of SW620 cells detected by Transwell assays（scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs scrambled.圖5 Transwell小室實驗檢測HOXB7敲減對SW620細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure.6. Morphological changes of colorectal cancer cells after overexpression or knockdown of HOXB7 were observed under phasecontrast microscope （scale bar=8 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector； ##P＜0.01 vs scrambled.圖6 相差顯微鏡觀察HOXB7過表達或敲減后結直腸癌細胞形態(tài)的變化

Figure.7. The effects of overexpression or knockdown of HOXB7 on the migration of SW480 and SW620 cells were detected by scratch test （scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector； ##P＜0.01 vs scrambled.圖7 劃痕實驗檢測HOXB7過表達或敲減對SW480和SW620細胞遷移的影響

E-cadherin可通過調節(jié)各種信號通路以維持細胞的上皮特征［8-9］；α-catenin在細胞-細胞黏附中發(fā)揮關鍵作用［10］。如圖8所示，兩者在HOXB7過表達時下調，在HOXB7敲減時上調，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與之相反，與細胞的間充質特性高度相關的 vimentin［11］和 N-cadherin［9］以及可抑制 E-cadherin基因表達的Snail蛋白［12-13］的表達在HOXB7過表達時顯著上升，在HOXB7被敲減時下調，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結果表明，HOXB7過表達可促進結直腸癌細胞的EMT，敲減HOXB7則正好相反。

9 免疫熒光染色檢測HOXB7過表達或敲減對結直腸癌細胞中EMT相關蛋白表達的影響

如圖9所示，與細胞上皮特性相關的E-cadherin和α-catenin的表達在HOXB7過表達時下調，在HOXB7敲減時上調。而與細胞間充質特性相關的vimentin、N-cadherin及Snail蛋白的表達在HOXB7過表達時顯著上升，在HOXB7被敲減時下調。這一結果同樣表明，HOXB7過表達可促進結直腸癌細胞的EMT，而敲減HOXB7則抑制結直腸癌細胞的EMT。

10 裸鼠體內實驗證明HOXB7過表達或敲減對結直腸癌轉移的影響

如圖10所示，使用皮下瘤組織進行結直腸癌原位手術移植，在6周后處死裸鼠，對各臟器進行取材，連續(xù)切片觀察，可見移植了HOXB7過表達的SW480細胞的裸鼠腸的原位瘤數量和肝肺轉移瘤數量均較對照組顯著增加（P＜0.01）。

討 論

結直腸癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，并且仍然是全球癌癥相關發(fā)病率和死亡率的第三大原因。遠處侵襲和轉移是導致高達90%的結直腸癌相關死亡率的重要原因之一。盡管臨床診斷和綜合治療的巨大進步在一定程度上延長了生存期，但轉移性結直腸癌患者的預后仍然很差［14-16］。因此，研究如何抑制結直腸癌的遠處轉移、如何改善其預后，迫在眉睫。

Figure 9. Expression of EMT-related proteins in SW480 cells with HOXB7 overexpression and in SW620 cells with HOXB7 knockdown was determined by immunofluorescence staining （scale bar=20 μm）.圖9 免疫熒光染色檢測HOXB7過表達或敲減對EMT相關蛋白表達的影響

EMT是指上皮細胞獲得間充質表型的細胞重編程過程。EMT在發(fā)育、傷口愈合和惡性腫瘤進展中發(fā)揮著非常重要的作用，癌細胞通過這些進展獲得與更具侵襲性表型相關的特性［17］。在EMT被激活后，腫瘤細胞會發(fā)生一系列物理變化，包括緊密連接溶解、頂端-基底畸形的破壞和細胞骨架結構的重組，所有這些都促進細胞從其原發(fā)部位擴散、侵入周圍組織，在循環(huán)中存活，最后導致遠處器官轉移。此外，有研究將對化療和免疫治療的耐藥性增加歸因于EMT，因為它促進與腫瘤相關基質細胞的相互作用，以其促腫瘤特性而聞名［18-20］。現已有使用二甲雙胍（metformin）、齊多夫定（zidovudine）等藥物通過Akt-GSK3β通路和Wnt通路靶向該過程對抗腫瘤化療耐藥的基礎研究［21-23］。

HOXB7屬于同源盒基因，它在癌癥的發(fā)生與進展過程中被認為是一種主調控基因，可以協(xié)調多種靶分子以激活各種致癌途徑，并與人們熟知的與癌癥進展關系密切的TGFβ、EGFR、MAPK、p53等通路都相關［23-24］?，F有研究表明，HOXB7在結直腸癌中，可通過磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路和MAPK通路介導其發(fā)生、增殖和抗凋亡作用［25］。此前，有學者報道過HOXB7可以靶向Wnt/β-catenin通路促進膠質瘤、食管癌的增殖和轉移［26-27］，敲減HOXB7則可導致皮膚鱗狀細胞癌的侵襲力下降［6］。Wnt/β-catenin通路是結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵通路，但是在結直腸癌中，HOXB7與Wnt/β-catenin通路的作用機制尚不很明確［28-30］。本文首先通過DGE、ORA、GSEA等方法證明HOXB7可以靶向Wnt/β-catenin通路，然后使用結直腸癌的代表性細胞株SW480和SW620，在體內外研究了HOXB7在結直腸癌中的作用。實驗結果證明，過表達HOXB7導致結直腸癌細胞的侵襲、遷移和EMT均較對照組顯著增強，而敲減HOXB7則導致結直腸癌的侵襲、遷移和EMT較對照組顯著下降。

Figure.10. The effect of overexpression of HOXB7 on colorectal cancer metastasis was demonstrated in nude mice. The gross specimens， representative microscopic images （HE staining） and the number of metastatic tumors in the intestine （A）， liver（B） and lung （C） of nude mice after 6 weeks of orthotopic transplantation of colorectal cancer. In the photos of the intestine， liver and lung gross specimens， the red arrows indicate the metastasis of the tumors. Scale bar=50 μm in A； scale bar=20 μm in B and C. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector.圖10 裸鼠體內實驗證明HOXB7過表達對結直腸癌轉移的影響

綜上所述，本研究揭示了HOXB7對結直腸癌細胞的侵襲、遷移的影響，其機制可能是靶向Wnt/β-catenin通路調控腫瘤細胞EMT從而介導結直腸癌的進展，揭示出HOXB7作為結直腸癌治療靶點的潛力。靶向HOXB7以抑制結直腸癌的發(fā)生、增殖、侵襲和EMT過程、對抗結直腸癌的化療耐藥或可成為治療結直腸癌的新思路?；诖?，后續(xù)我們可以開展有關HOXB7通過干擾EMT從而控制結直腸癌的遷移、侵襲以及其聯合用藥的研究，尋找對抗結直腸癌耐藥機制的新途徑。