牛 爽， 何忠時(shí)， 曾 煉2，， 胡鵬超△， 王 靜△

（1錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地腫瘤科，湖北 襄陽(yáng) 441000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030；3湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）是世界上第三大常見(jiàn)的腫瘤，也是世界上第二大腫瘤死亡的常見(jiàn)原因［1］。目前對(duì)結(jié)直腸癌的主要治療方法分為手術(shù)、化療和放療，靶向及免疫治療，但5年生存率仍然較低［2-3］。對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌患者來(lái)說(shuō)，化療是重要的方法之一，主要為鉑類藥物，其中順鉑（cisplatin，Cis）是醫(yī)治結(jié)直腸癌常用的化療藥物之一，而結(jié)直腸癌對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥是其化療失敗的主要原因［4-5］。順鉑耐藥性的機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜，其中包括與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)親核物種的結(jié)合，如谷胱甘肽（glutathine， GSH），一方面，可能是順鉑的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)基礎(chǔ)，從而消耗抗氧化物質(zhì)和激活氧化應(yīng)激；另一方面，親核物種作為細(xì)胞質(zhì)清除劑，限制順鉑的細(xì)胞毒性［6］。當(dāng)對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性時(shí)，體內(nèi)和體外都發(fā)現(xiàn)了GSH水平上升的現(xiàn)象，但GSH仍是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原最重要的抗氧化劑，清除細(xì)胞內(nèi)GSH有利于逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［7］。研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞在發(fā)生耐藥時(shí)會(huì)啟動(dòng)抗氧化機(jī)制，特別是GSH水平的升高和活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平的降低，使腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性［8］。Stockwell等［9］研究表明GSH在鐵死亡中發(fā)揮重要作用，GSH的合成與system xC-有關(guān)，通過(guò) system xC-抑制胱氨酸的攝取會(huì)造成GSH的消耗和GPX4的失活，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)度氧化，細(xì)胞發(fā)生死亡。

2012年Dixon等［10］提出一種新的細(xì)胞死亡方式，主要是以鐵過(guò)量、脂質(zhì)過(guò)氧化物和ROS的過(guò)度積累為特征，即鐵死亡。大量研究證實(shí)誘導(dǎo)鐵死亡可逆轉(zhuǎn)卵巢癌、頭頸鱗癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性［11-14］。最近研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡抑制腫瘤的作用是由p53介導(dǎo)的［15］。p53是一種典型的抑癌基因，在調(diào)節(jié)細(xì)胞各種代謝和鐵死亡相關(guān)基因的調(diào)控中發(fā)揮重要作用［16］，p53通過(guò)抑制溶質(zhì)載體家族7成員 11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）重組蛋白的轉(zhuǎn)錄來(lái)阻斷胱氨酸的攝入，從而限制細(xì)胞內(nèi)GSH的合成，致使細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性增加［17］。上述研究表明p53可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究主要探討p53介導(dǎo)的鐵死亡在結(jié)直腸癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機(jī)制，為結(jié)直腸癌細(xì)胞順鉑耐藥的治療提供新的思路。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

順鉑購(gòu)自江蘇豪森藥企；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma-Aldrich；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa；erastin和liproxstatin-1購(gòu)自 MedChemExpress；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；ROS檢測(cè)熒光探針2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）分析試劑盒和線粒體膜電位JC-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞亞鐵離子熒光探針購(gòu)自Dojindo；SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；細(xì)胞核染料Hoechst 33258、線粒體紅色熒光探針MitoTracker Red CMXRos、BCA試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司；抗谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）抗體和抗SLC7A11抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗p53抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；引物購(gòu)自生物生工工程（上海）有限公司，序列見(jiàn)表1。SpectraMax i3x酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；IX70倒置熒光顯微鏡（Olympus）。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

2 方法

2.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 課題組前期采用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LOVO反復(fù)短期暴露于順鉑并逐漸增加順鉑濃度的方法建立耐順鉑細(xì)胞株LOVO/DDP。用含10% FBS和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RMPI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，用胰蛋白酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行接種。

2.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞接種到96孔板中，密度為5×107/L，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常LOVO細(xì)胞經(jīng)順鉑（0.5、1、2、4和8 mg/L）處理48和72 h，耐順鉑細(xì)胞株LOVO/DDP經(jīng)順鉑（1、2、4、8和16 mg/L）處理48和72 h以及順鉑（2 mg/L）聯(lián)合鐵死亡激活劑erastin（1 μmol/L）或抑制劑 liproxstatin-1（10 μmol/L）處理48 h，并設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)處理組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，加入含有上述藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度，并計(jì)算順鉑的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 ROS檢測(cè) 把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度為5×107/L，設(shè)置對(duì)照組、順鉑（0.5、1和2 mg/L）組、順鉑（2 mg/L）聯(lián)合鐵死亡激活劑erastin（1 μmol/L）及順鉑（2 mg/L）聯(lián)合鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（10 μmol/L）組。培養(yǎng)48 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，PBS洗2遍，使用ROS綠色熒光探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞中的ROS，放入培養(yǎng)箱中孵育15 min，用PBS洗2遍，在熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.4 MitoTracker檢測(cè) 把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度為5×107/L，分組處理同上，培養(yǎng)48 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用線粒體紅色熒光探針MitoTracker Red CMXRos標(biāo)記線粒體，加入200 μL工作液，放入培養(yǎng)箱中孵育15 min，在熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.5 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度為5×107/L，分組處理同上，培養(yǎng)48 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加入的線粒體膜電位JC-1工作液200 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育15 min后，用1× Incubation Buffer洗滌2遍，再加入4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞，室溫下固定30 min，用PBS洗2遍，然后加入Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核，室溫染色15 min，PBS洗2 遍，在熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.6 亞鐵離子的檢測(cè) 把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞密度為5×107/L，分組處理同上，培養(yǎng)48 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，用無(wú)血清的培養(yǎng)液洗3遍，按照1∶1 000，將1 mol/L FerroOrange溶液配成終濃度為1 μmol/L的工作液，加入200 μL的FerroOrange工作液，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7 Western blot 按照上述分組處理細(xì)胞，將加入RIPA裂解液的6孔板放在冰上15 min，用槍頭刮取細(xì)胞，并在超聲破碎儀下破碎細(xì)胞，然后在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，將膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h；用TBST溶液按照1∶1 000（SLC7A11 和 GPX4）、1∶3 000（p53）和 1∶2 000（GAPDH）稀釋Ⅰ抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min；Ⅱ抗（山羊抗兔IgG，1∶2 000）室溫孵育2 h；TBST洗3次，每次5 min；用Gene Gnome XRQ化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)灰度值進(jìn)行定量。

2.8 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 按照上述分組處理細(xì)胞，在6孔板中加入Trizol試劑裂解細(xì)胞，再加入氯仿和異丙醇提取細(xì)胞RNA并檢測(cè)RNA濃度。將RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系： 2 μL cDNA、10 μL 2×SYBR Green Super Mix、上下游引物各 1 μL 和 6 μL ddH2O，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～40 s）。根據(jù)Ct值使用公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)性獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用t檢驗(yàn)比較兩組間的差異；采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較多組間的差異，用SNK法進(jìn)行多組間的兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 調(diào)控鐵死亡影響結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

如圖1A所示，與對(duì)照組相比，LOVO細(xì)胞在順鉑（0.5、1、2、4和8 mg/L）處理48 h和72 h后，細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），呈劑量依賴性，48 h及72 h的IC50分別為1.822 mg/L和1.398 mg/L；如圖1B所示，耐順鉑細(xì)胞株LOVO/DDP在順鉑（1、2、4、8和16 mg/L）作用下細(xì)胞活力下降幅度低于LOVO細(xì)胞，48 h及72 h的IC50分別為4.091 mg/L和2.763 mg/L。順鉑（2 mg/L）單獨(dú)及聯(lián)合鐵死亡激活劑erastin（1 μmol/L）或鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（10 μmol/L）處理后，在LOVO細(xì)胞中，與單獨(dú)順鉑組比較，順鉑聯(lián)合erastin組細(xì)胞活力下降，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組細(xì)胞活力升高，見(jiàn)圖1C；在LOVO/DDP細(xì)胞中，與單獨(dú)順鉑組比較，順鉑聯(lián)合erastin組細(xì)胞活力由78.13%下降至40.25%（P＜0.05），順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組細(xì)胞活力升高至85.97%（P＜0.05），見(jiàn)圖1D。

Figure 1. Effects of ferroptosis regulation on the viability of colorectal cancer cells. A and B： CCK-8 assay was used to detect the viability of LOVO and LOVO/DDP cells treated with cisplatin （Cis） at different concentrations for 48 and 72 h； C and D：CCK-8 assay was used to detect the viability of LOVO and LOVO/DDP cells treated with Cis alone or Cis combined with ferroptosis activator erastin （Era） or inhibitor liproxstatin-1 （Lip） for 48 h. Mean±SD. n=5. *P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 mg/L or control group； #P＜0.05 vs Cis group.圖1 調(diào)控鐵死亡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力的影響

2 調(diào)控鐵死亡影響順鉑敏感/耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞的ROS合成

比較順鉑作用前后LOVO及LOVO/DDP細(xì)胞中ROS的合成，在LOVO細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，隨著順鉑濃度的增加，ROS的綠色熒光強(qiáng)度顯著增加，呈劑量依賴性（P＜0.01），順鉑（2 mg/L）作用48 h后平均熒光密度升高3.94倍，見(jiàn)圖2A；在LOVO/DDP細(xì)胞中，順鉑誘導(dǎo)ROS增加平緩，順鉑（2 mg/L）作用48 h后平均熒光密度僅升高1.47倍，見(jiàn)圖2B。順鉑單獨(dú)及聯(lián)合使用erastin或liproxstatin-1處理LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞，在LOVO細(xì)胞中，與單獨(dú)順鉑組比較，順鉑聯(lián)合erastin組ROS的熒光強(qiáng)度增加，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組熒光減弱，見(jiàn)圖2C；在LOVO/DDP細(xì)胞中，順鉑聯(lián)合erastin組ROS的平均熒光強(qiáng)度較單獨(dú)順鉑組升高3.79倍（P＜0.05），順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組ROS熒光信號(hào)與單獨(dú)順鉑組差異不顯著（P＞0.05），見(jiàn)圖2D。

Figure 2. Effects of ferroptosis regulation on intracellular ROS synthesis in colorectal cancer cells. Intracellular ROS were labeled with H2DCFDA. A and B： the LOVO and LOVO/DDP cells were treated with different concentrations of cisplatin（Cis） for 48 h； C and D： the LOVO and LOVO/DDP cells were treated with Cis alone or Cis combined with ferroptosis activator erastin （Era） or inhibitor liproxstatin-1 （Lip） for 48 h. The scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs Cis group.圖2 調(diào)控鐵死亡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS合成的影響

3 調(diào)控鐵死亡影響順鉑敏感/耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞的線粒體功能

比較順鉑作用前后LOVO及LOVO/DDP細(xì)胞的線粒體功能，線粒體MitoTracker熒光染色結(jié)果顯示：順鉑誘導(dǎo)的LOVO細(xì)胞線粒體功能障礙，與對(duì)照組相比，線粒體紅色熒光探針的信號(hào)強(qiáng)度隨順鉑濃度增加下降明顯，順鉑（2 mg/L）作用48 h后平均熒光強(qiáng)度下降65.2%（P＜0.01），見(jiàn)圖 3A；在 LOVO/DDP細(xì)胞中，順鉑（2 mg/L）作用48 h后平均熒光強(qiáng)度僅下降32.9%，見(jiàn)圖3B。順鉑單獨(dú)及聯(lián)合使用erastin或liproxstatin-1處理LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞，在LOVO細(xì)胞中，順鉑聯(lián)合erastin組線粒體紅色熒光強(qiáng)度較單獨(dú)順鉑組下降，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組紅色熒光強(qiáng)度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3C；在LOVO/DDP細(xì)胞中，與單獨(dú)順鉑組比較，順鉑聯(lián)合erastin組線粒體紅色熒光強(qiáng)度下降，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組紅色熒光強(qiáng)度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3D。

為進(jìn)一步探討鐵死亡對(duì)順鉑敏感/耐藥細(xì)胞株線粒體功能的影響，采用JC-1熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平。在LOVO細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，單獨(dú)順鉑組中紅色熒光強(qiáng)度下降，JC-1聚合體減少，線粒體膜電位降低；與單獨(dú)順鉑組相比，順鉑聯(lián)合erastin組紅色熒光強(qiáng)度下降，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組紅色熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4A。在LOVO/DDP細(xì)胞中，單獨(dú)順鉑組紅色熒光強(qiáng)度與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；與單獨(dú)順鉑組相比，順鉑聯(lián)合erastin組的紅色熒光明顯下降，紅色熒光與綠色熒光信號(hào)的比值顯著減少，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組紅色熒光強(qiáng)度升高，紅色熒光與綠色熒光信號(hào)的比值增加（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。

4 調(diào)控鐵死亡影響相關(guān)基因在順鉑敏感/耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞中的差異表達(dá)

比較順鉑處理前后LOVO及LOVO/DDP細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，RT-qPCR結(jié)果顯示：以LOVO細(xì)胞作為對(duì)照，促鐵死亡相關(guān)基因（ACSL1、ACSL4、NCOA4和VDAC3）在LOVO/DDP細(xì)胞中低表達(dá)，順鉑（2 mg/L）處理48 h后，上述基因在敏感細(xì)胞系（LOVO細(xì)胞）中表達(dá)升高，而耐藥細(xì)胞系（LOVO/DDP細(xì)胞）中未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖5A；鐵死亡抑制基因（GPX4、FTH1、NQO1和Nrf2）在LOVO/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，順鉑（2 mg/L）處理48 h后，上述基因在敏感細(xì)胞系中表達(dá)升高，而耐藥細(xì)胞系中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5B。

5 調(diào)控鐵死亡影響順鉑敏感/耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞亞鐵離子含量及p53和鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

順鉑單獨(dú)及聯(lián)合使用鐵死亡激活劑erastin（1 μmol/L）或鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（10 μmol/L）處理LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞48 h后，亞鐵離子熒光探針FerroOrange熒光染色結(jié)果顯示：在LOVO細(xì)胞中，單獨(dú)順鉑組熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增加，聯(lián)合鐵死亡激活劑erastin處理后，紅色熒光信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組升高2.25倍，聯(lián)合鐵死亡抑制劑liproxstatin-1處理，紅色熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6A、B；在LOVO/DDP細(xì)胞中，單獨(dú)順鉑組熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），聯(lián)合erastin處理后，紅色熒光明顯增強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度較單獨(dú)順鉑組升高2.52倍（P＜0.05），聯(lián)合liproxstatin-1處理后，平均熒光強(qiáng)度與單獨(dú)順鉑組相比差異不顯著（P＞0.05），見(jiàn)圖7A、B。順鉑單獨(dú)及聯(lián)合使用鐵死亡激活劑erastin（1 μmol/L）或鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（10 μmol/L）處理 LOVO和 LOVO/DDP細(xì)胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示：在LOVO細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，隨著順鉑濃度的增加SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)逐漸降低，p53蛋白表達(dá)逐漸升高，與單獨(dú)順鉑組相比，順鉑聯(lián)合erastin組SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），p53蛋白表達(dá)略升高，順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)略升高（P＞0.05），p53蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6C～F；在LOVO/DDP細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，隨著順鉑濃度的增加SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)逐漸降低，p53蛋白表達(dá)逐漸升高，與單獨(dú)順鉑組相比，順鉑聯(lián)合erastin組SLC7A11蛋白表達(dá)略降低，GPX4蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），p53蛋白表達(dá)略升高（P＞0.05），順鉑聯(lián)合liproxstatin-1組的SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)略升高（P＞0.05），p53蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖7C～F。

討 論

Figure 3. Effects of ferroptosis regulation on mitochondrial function in colorectal cancer cells. Mitochondria were labeled with Mito-Tracker Red CMXRos. A and B： the LOVO and LOVO/DDP cells were treated with different concentrations of cisplatin（Cis） for 48 h； C and D： the LOVO and LOVO/DDP cells were treated with Cis alone or Cis combined with ferroptosis activator erastin （Era） or inhibitor liproxstatin-1 （Lip） for 48 h. The scale=50 μm. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs Cis group.圖3 調(diào)控鐵死亡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞線粒體功能的影響

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率逐漸上升［18］。順鉑是現(xiàn)代臨床防治結(jié)直腸癌常用的化療藥劑，DNA是順鉑細(xì)胞毒性的重要靶點(diǎn)，主要與DNA上的嘌呤堿基配對(duì)進(jìn)行鏈內(nèi)交聯(lián)，產(chǎn)生順鉑-DNA復(fù)合體，誘導(dǎo)DNA雙鏈發(fā)生斷裂，進(jìn)而起到細(xì)胞毒性效應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。然而，由于結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性下降，導(dǎo)致順鉑的臨床應(yīng)用受到限制。因此，提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性是目前亟待解決的問(wèn)題。研究證實(shí)腫瘤對(duì)順鉑耐藥的主要機(jī)制包括DNA修復(fù)能力增強(qiáng)、藥物積累減少，解毒的增強(qiáng)和凋亡逃逸［20］。Guo等［21］研究發(fā)現(xiàn)順鉑治療腫瘤時(shí)會(huì)引起細(xì)胞凋亡和鐵死亡，而順鉑耐藥機(jī)制可以影響順鉑引起的細(xì)胞凋亡，但不影響順鉑引起的鐵死亡。有文獻(xiàn)表明鐵死亡在逆轉(zhuǎn)卵巢癌、肺癌和胃癌順鉑耐藥性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而鐵死亡在逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌順鉑耐藥中的作用機(jī)制尚未完全清楚。張麗媛等［22］在2015年首次提出p53與鐵死亡密切相關(guān)，認(rèn)為p53通過(guò)轉(zhuǎn)錄的方式抑制SLC7A11的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究結(jié)果顯示，與順鉑單藥相比，順鉑聯(lián)合erastin組LOVO/DDP細(xì)胞p53蛋白表達(dá)升高， SLC7A11蛋白表達(dá)下將及GPX4蛋白表達(dá)明顯下降，順鉑聯(lián)合Lip組p53蛋白表達(dá)降低，SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)升高，上述結(jié)果證實(shí)了p53的上調(diào)誘導(dǎo)LOVO/DDP細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而增強(qiáng)LOVO/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。提示p53可能通過(guò)介導(dǎo)鐵死亡增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

Figure 4. Effects of ferroptosis regulation on mitochondrial membrane potential in colorectal cancer cells. Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 probe. A： the LOVO cells were treated with cisplatin （Cis） alone or Cis combined with ferroptosis activator erastin （Era） or inhibitor liproxstatin-1 （Lip） for 48 h； B： the LOVO/DDP cells were treated with Cis alone or Cis combined with Era or Lip for 48 h. The scale=50 μm. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs Cis group.圖4 調(diào)控鐵死亡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

鐵死亡是一種依賴鐵的細(xì)胞死亡形式，在基因、生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)上不同于其他細(xì)胞死亡方式，包括凋亡、壞死和自噬［22］。其主要特征為細(xì)胞內(nèi)ROS的積累、GSH水平的降低及GPX4的失活［23］。Yu等［24］研究表明鐵死亡激活劑可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，減輕腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥并增加化療效果，如erastin可以增強(qiáng)HL60細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷和多柔比星的敏感性。Gao等［25］研究發(fā)現(xiàn)順鉑聯(lián)合erastin可以增強(qiáng)人骨肉瘤MG63/DDP和Saos-2/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。隨著對(duì)鐵死亡機(jī)制的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， erastin可以增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的水平和誘導(dǎo)線粒體功能障礙，致使腫瘤細(xì)胞激活氧化應(yīng)激，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［26］。最近的一項(xiàng)研究表明線粒體代謝通過(guò)促進(jìn)膜電位超極化和脂質(zhì)過(guò)氧化積累［27］調(diào)節(jié)鐵死亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑聯(lián)合erastin相比順鉑單藥，LOVO/DDP細(xì)胞活力顯著下降，ROS水平顯著增加及誘導(dǎo)線粒體功能障礙，結(jié)果表明誘導(dǎo)結(jié)直腸癌LOVO/DDP細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，可以增強(qiáng)順鉑耐藥株LOVO/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鐵積累可產(chǎn)生ROS，通過(guò)Fenton反應(yīng)引起氧化應(yīng)激，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，最終觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［23］。本研究證實(shí)順鉑聯(lián)合erastin相比順鉑單藥，LOVO/DDP細(xì)胞內(nèi)的亞鐵離子明顯增加，結(jié)果表明LOVO/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性使細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平較低致使鐵死亡受到抑制，在聯(lián)合鐵死亡激活劑后，LOVO/DDP細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子明顯增加誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生，從而增強(qiáng)LOVO/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

Figure 5. Effects of cisplatin （Cis） on the mRNA expression of ferroptosis-related genes. RT-qPCR assay was used to detect the mRNA expression levels of genes promoting （A） or inhibiting （B） ferroptosis in LOVO and LOVO/DDP cells treated with 2 mg/L Cis for 48 h. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs LOVO group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs LOVO/DDP group.圖5 順鉑對(duì)鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

Figure 6. Effects of ferroptosis regulation on ferrous ion content， and p53 and ferroptosis-related protein expression in LOVO cells. A and B： the ferrous ion content of LOVO cells treated with cisplatin （Cis） alone or Cis combined with ferroptosis activator erastin （Era） or inhibitor liproxstatin-1 （Lip） for 48 h was detected by ferrous ion fluorescent probes （scale bar=50 μm）；C to F： the protein expression levels of p53， SLC7A11 and GPX4 in LOVO cells were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； #P＜0.05 vs Cis group.圖6 調(diào)控鐵死亡對(duì)LOVO細(xì)胞亞鐵離子含量及p53和鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 7. Effects of ferroptosis regulation on ferrous ion content， and p53 and ferroptosis-related protein expression in LOVO/DDP cells. A： the ferrous ion content of LOVO/DDP cells treated with cisplatin （Cis） alone or Cis combined with ferroptosis activator erastin（Era） or inhibitor liproxstatin-1（Lip） for 48 h was detected by ferrous ion fluorescent probes（scale bar=50 μm）； C to F： the protein expression levels of p53， SLC7A11 and GPX4 in LOVO/DDP cells were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs Cis group.圖7 調(diào)控鐵死亡對(duì)LOVO/DDP細(xì)胞亞鐵離子含量、p53和鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本研究證實(shí)耐順鉑人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LOVO/DDP對(duì)順鉑的耐藥性與鐵死亡受到抑制有關(guān)，通過(guò)應(yīng)用鐵死亡激活劑，證實(shí)了激活鐵死亡可以增強(qiáng)LOVO/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)激活LOVO/DDP細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后，細(xì)胞內(nèi)SLC7A11和GPX4表達(dá)降低，p53表達(dá)升高，提示p53可能通過(guò)下調(diào)SLC7A11和GPX4蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)LOVO/DDP細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，進(jìn)而增強(qiáng)LOVO/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。但p53調(diào)控鐵死亡的通路網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜多樣，需要進(jìn)一步深入探究p53在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感性的具體信號(hào)通路及機(jī)制，找到特定的信號(hào)通路作為研究靶點(diǎn)，為結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的治療提供新的研究依據(jù)。