肖凌云，武文韜，周沂霖，閆姿霓，周恩澤，孫明月，徐大可，王福會

表面功能化

Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金在生活環(huán)境中的抗菌性能

肖凌云，武文韜，周沂霖，閆姿霓，周恩澤，孫明月，徐大可，王福會

（東北大學 材料科學與工程學院，沈陽 110819）

利用高熵合金多主元的設計思想，添加高含量的銅制備出具有優(yōu)良機械性能的新型含銅抗菌高熵合金（Antibacterial High-entropy Alloy），探究其在多種復雜生活環(huán)境中服役時的抗菌性能。通過XRD分析高熵合金的物相組成。通過拉伸試驗研究該高熵合金的機械性能。采集多種生活環(huán)境下的微生物群落，通過平板涂布、場發(fā)射掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細菌生長與成膜形貌，對比分析高熵合金的抗菌性能。通過基因測序，經由OTU聚類分析與物種分類學分析等研究手段，統(tǒng)計和分析菌落結構與物種多樣性。通過活性氧簇分析，探究高熵合金的殺菌機理。Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金的屈服強度為(308±10) MPa，高于傳統(tǒng)抗菌不銹鋼材料。通過抗菌試驗結果得出，高熵合金的抗菌率達到99.99%以上。通過掃描電鏡分析和活死染色結果，發(fā)現AHEA表面菌落數量顯著減少且?guī)缀鯖]有任何活的微生物。此外，通過測序結果可以看出，易黏附于普通金屬樣品表面的優(yōu)勢菌種多為有害致病菌，包含細菌和真菌，而AHEA對它們有著良好的抑制作用。AHEA可以作為一種高效的抗菌材料，不僅能防止細菌在金屬材料表面繁殖生長，還能有效抑制真菌生長和生物被膜的形成，綜合性能遠優(yōu)于傳統(tǒng)抗菌合金。

抗菌材料；高熵合金；抗細菌；抗真菌；生物被膜；生活環(huán)境

微生物常見于人們的生產生活中，對人類的健康生存環(huán)境等方面均產生了重要的影響。一方面，微生物對人類保健具有積極作用，例如生存在人類腸道中的雙歧桿菌，對病人機體炎癥和免疫的調節(jié)都具有積極影響[1]。另一方面，微生物對人體的健康也有危害，例如在生產加工運輸過程中的食物由于保存不當，將極易滋生有害病菌；在醫(yī)院內常見的肺炎克雷伯菌，感染人類后可引起較嚴重的下呼吸道感染甚至死亡[2]。根據世界衛(wèi)生組織的報道，全球每年至少有1 600萬人因細菌傳染導致身患疾病而死亡[3]。此外，2019年出現的新型冠狀病毒也迅速席卷全球，至今國內仍時有接觸感染發(fā)生。在這場全民抗疫的戰(zhàn)斗中，人們對生活中公共接觸物品殺菌消毒的重視達到了空前的高度。相對于病毒，各種致病菌更容易長期附著在生活環(huán)境中的金屬制品上，其形成的生物被膜可有效抵御外部環(huán)境的變化[4-6]。生活中常用的傳統(tǒng)殺菌方式，如噴灑75%酒精，難以對真菌生物被膜起到有效的殺滅作用，導致一些常見的真菌感染疾病，例如腳氣、花斑癬等，容易反復發(fā)作，難以根除[7]。因此，如何避免諸如門把手、電梯扶手、電梯按鈕等這些頻繁接觸的金屬制品成為傳播細菌的媒介，已經成為了當下的研究熱點問題之一。

銅元素有著天然良好的抗菌性能，為了使普通合金也具有抑菌的能力，近些年研究者們已經將具有抗菌功能的銅加入到這些合金中，所得材料可通過直接接觸或釋放銅離子、亞銅離子殺死附著細菌[8-9]。然而對于現有的抗菌不銹鋼合金，如304含銅不銹鋼等，在保證不犧牲材料本身機械性能的同時具有良好的抗菌效果，材料中所添加的銅含量都存在極限值（不銹鋼中cu質量分數通常低于5%）[10]，但較低的銅含量會顯著影響合金材料的抗菌效果。此外，抗菌不銹鋼材料僅是通過添加銅或銀元素對合金成分進行優(yōu)化，難以集中各合金元素的優(yōu)異特性，限制了其發(fā)展應用。而高熵合金通常包含5～13種組元，且每一組元的含量介于5%～35%之間，按照等原子比或近于等原子比進行合金化形成多主元合金[11]。該多主元合金的設計理念可為多功能金屬材料的開發(fā)設計帶來一個全新的發(fā)展空間。通過優(yōu)化高熵合金的組成成分，可以使其同時擁有多種優(yōu)異特性，如高強度、高硬度、耐腐蝕、耐磨損等，因此高熵合金具備很高的研究價值與應用前景[12-14]。因此，利用具有天然抗菌性的銅元素作為抗菌高熵合金的主元素之一，可以制備出兼具優(yōu)良機械性能和抗菌性能的新型抗菌合金。但目前關于含銅高熵合金的抗菌性能研究較少，起步較晚。2016年，wu等[15]研究了CuCoCrFeNi高熵合金對大腸桿菌的抗菌性能，發(fā)現其抗菌率可達99.5%。2022年，Gao等[16]進一步利用3D打印技術制備得到具有優(yōu)異抗菌性能的CoCrCuFeNi高熵合金，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果分別達到98%和99%以上。此外，Ren等[17]的研究表明，銅的添加可以在不犧牲機械性能的情況下能提高Co0.4FeCr0.9Cu抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能。關于Al0.4CoCrCuFeNi含銅高熵合金的研究結果也表明，該合金材料對海洋銅綠假單胞菌、海洋越南芽孢桿菌、多重耐藥鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌均具有十分優(yōu)異的抑菌效果[18-19]。但是，單一菌種并不能完全反映該合金在實際復雜菌群環(huán)境中的廣譜抗菌性以及高效性。目前市場上不僅缺少有效可用的抗菌金屬材料，而且對抗菌金屬材料在實際應用過程中的抗菌效果知之甚少。

因此，為評定Al0.4CoCrCuFeNi抗菌高熵合金（Antibacterial High-entropy Alloys，AHEA）對實際生活環(huán)境中菌群的抗菌性能，本試驗收集來自3種不同生活環(huán)境中的金屬制品表面的混菌，并采用304不銹鋼（304 SS）、含銅304不銹鋼（304 Cu-SS，4.1%Cu）和純銅（Cu）樣品作為對照，研究Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金對環(huán)境微生物的實際抗菌效果。

1 試驗

1.1 抗菌高熵合金制備

Al0.4CoCrCuFeNi抗菌高熵合金的制備均選用純度為99%以上的工業(yè)級純原料（Al、Co、Cr、Cu、Fe和Ni）。原料依次經過稱量配比、混勻熔煉，最終澆鑄得到合金鑄錠，具體熔煉步驟如下。

首先按各合金元素物質的量比進行稱量配重，稱量出總質量約為2.5 kg的合金料。合金采用真空電弧爐熔煉。熔配合金時，按照Al原料在下，Co、Cr、Cu、Fe和Ni原料均勻混合在上的順序放入水冷銅坩堝，真空電弧爐抽真空至3×10?3Pa，反沖氬氣至0.05 Pa。合金熔煉前先熔煉Ti合金錠，吸收真空電弧爐內殘余氧氣。熔煉合金時，需要進行翻面熔煉，并且至少熔煉6遍，每遍熔煉1～2 min，獲得合金液并澆鑄成鑄態(tài)的Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金。

1.2 機械性能測試

利用Instron 5569測試機對合金試樣進行拉伸試驗。棒狀拉伸樣的標距長度為33 mm，直徑為6 mm，以1×10?3s?1的恒應變速率進行室溫拉伸。拉伸試樣側面逐級打磨至1000#，以消除線切割痕跡對拉伸試驗產生的影響。

1.3 菌樣采集

使用經滅菌鍋滅菌的醫(yī)用棉簽，將其置于裝有PBS緩沖液（10.9 g/L）的50 mL離心管中，分別隨機選擇ATM機金屬按鍵（a）、實驗室金屬門把手（b）、皮膚科門診室門把手（c）3個環(huán)境刮取采集菌種。利用LB液體培養(yǎng)基對采集得到的菌種進行富集培養(yǎng)，在37 ℃搖床中培養(yǎng)12 h備用。其中，LB液體培養(yǎng)基成分為1 000 mL去離子水、10 g 氯化鈉、10 g 胰蛋白胨和5 g 酵母提取物。

1.4 抗菌測試

將AHEA對于生活環(huán)境混菌的抗菌特性與304 SS、304 Cu-SS、Cu進行比較，其中AHEA、304 Cu-SS、Cu為抗菌樣，304 SS為對照樣。表1為304 SS和304 Cu-SS的元素組成及其含量。圖1為抗菌測試試驗的示意圖，具體過程為：取出搖床中的菌樣，使用分光光度計測定菌液OD值，調整至OD600約為0.5，此時菌液濃度約為108CFU/mL；用含0.1 g/L酵母提取物的PBS緩沖液作為稀釋劑和培養(yǎng)液，將菌液稀釋到105CFU/mL，采用覆膜法將稀釋后的菌液（100 μL）接種到4種金屬試樣表面（樣品表面積均為1 cm2），將接種3種菌群環(huán)境下的試樣放在37 ℃恒溫箱中分別培養(yǎng)1、3、6 h，所有試驗均重復3次。

表1 304 SS和304 Cu-SS的化學元素成分及含量

之后將AHEA和Cu樣品（表面均含100 μL菌液）輕輕取出置于裝有900 μL PBS緩沖液的離心管內，充分震蕩搖勻后，取其中100 μL含菌液（即稀釋10倍后）進行平板涂布。此外，對304 SS和304 Cu-SS的覆膜液再次稀釋10倍接種于LB固體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，拍攝培養(yǎng)基中菌落的照片并統(tǒng)計菌落數，每個試驗至少進行3次?？咕视墒剑?）計算得到。

式中：為抗菌率；為對照樣活菌數（CFU/mL）；為抗菌樣活菌數（CFU/mL）。

1.5 掃描電鏡分析

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM，Ultra- Plus，Zeiss，Germany）觀察經前述相同方法覆膜6 h后的樣品。首先，將樣品在去離子水中清洗，輕輕洗去表面的覆膜液，將樣品連同附著的生物被膜一同放入4%戊二醛溶液中，在4 ℃冰箱中進行2 h的固定處理。戊二醛是一種滲透快的雙交聯劑，交聯能力強，可以將細胞中的蛋白質固定且不破壞細胞骨架的結構[19]。接下來，分別以50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液逐級梯度脫水，每個濃度梯度下放置的時間為7 min。100%乙醇脫水結束后將樣品取出吹干。最后，使用導電膠將樣品固定于鋁板表面，利用離子濺射儀對樣品進行噴金處理，以確保樣品表面有良好的導電性，然后再在FESEM高倍數目鏡下進行形貌觀察。同時利用掃描電鏡對本試驗中的高熵合金表面進行金相觀察。

圖1 抗菌試驗流程圖

1.6 活死細胞染色

采用與抗菌測試中同樣的方法在37 ℃覆膜6 h后，使用LIVE/DEAD?（Invitrogen，USA）細菌活死染色試劑盒，在暗室（23 ℃）中對樣品進行染色。綠色熒光SYTO-9染料染色活細胞。紅色熒光碘化丙啶（PI）染料染色死細胞。著色后使用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）（C2 Plus，Nikon，Japan）以3-D模式觀察細菌生長與生物被膜厚度[21-22]。

1.7 基因測序

分別對細菌液體樣品和在304 SS試樣表面培養(yǎng)6 h后的生物被膜樣品，進行16S基因測序。根據OTU聚類（ASV去噪）分析結果，檢測OTU（ASV）多樣性指數和測序深度；根據分類信息，對每個分類級別的群落結構進行統(tǒng)計分析。

1.8 活性氧簇分析

選用實驗室細菌，通過覆膜1、3、6 h后，使用活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）檢測試劑盒（碧云天，中國），在暗室（23 ℃）中對樣品進行染色30 min。用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察AHEA、304 SS、304 Cu-SS、Cu 4種金屬表面ROS的產量，即綠色熒光強度。

1.9 XRD分析

利用X射線衍射儀（XRD，Shimadzu XRD-6000）進行物相組成分析，采用Cu靶，掃描速度為4 (°)/min，2掃描范圍為20°～100°。

2 結果及分析

2.1 材料組織與機械性能分析

通過圖2可以明顯看出，304不銹鋼和304 Cu-SS均為典型的奧氏體結構，內部存在少量的馬氏體。但在添加銅的不銹鋼樣品中沒有檢測到富銅相的存在，這可能是因為奧氏體相和析出的富銅相結構相似，均為面心立方結構（FCC），因此富銅相衍射峰與奧氏體相衍射峰接近被覆蓋，也表明了此時含銅不銹鋼銅含量較少，形成的富銅相體積分數難以檢測得到。純銅是FCC結構，其衍射峰為(111)、(200)、(220)，不存在其他衍射峰，表明試驗所用銅樣品的純度較高，雜質較少。XRD結果也表明，高熵合金主要是FCC結構。進一步利用SEM觀察高熵合金的金相組織可發(fā)現，該抗菌高熵合金具有粗枝晶區(qū)域（）和枝晶間結構（）。通過能譜儀分析枝晶和枝晶間的化學成分，結果見表2。從化學元素分布結果可以看出，該合金的枝晶區(qū)富含Co、Cr、Fe和Ni元素，枝晶間富含Cu元素，表明合金材料表面彌散均勻分布著大量的Cu元素，可能有利于增強材料的抗菌能力。

圖2 幾種金屬材料的組織結構分析

表2 抗菌高熵合金的化學元素成分及含量

經測試，未經過軋制變形或熱處理等增強手段，鑄態(tài)AHEA的屈服強度仍優(yōu)于304不銹鋼（圖3）。鑄態(tài)AHEA的屈服強度為(308±10) MPa，高于304不銹鋼(278±8) MPa以及304 Cu-SS (225±8) MPa的屈服強度。純銅的屈服強度同樣遠低于Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金材料。Xi等[23-24]報道的316/317 Cu-SS的屈服強度約為230 MPa，也低于該鑄態(tài)AHEA，表明該高熵合金比傳統(tǒng)抗菌不銹鋼材料具有更優(yōu)異的屈服強度。

2.2 抗菌性能分析

采用微生物平板計數法（圖1）評估AHEA、304 Cu-SS和Cu的抗菌性能，抗菌結果如圖4所示?？梢钥吹?，各環(huán)境的304 SS與304 Cu-SS樣品的培養(yǎng)基上均長出了較多菌株（稀釋100倍）。其中，ATM機金屬按鍵環(huán)境（a）中的菌在與金屬接觸初期（1 h）生長緩慢，隨接觸時間的延長，微生物開始迅速繁殖，培養(yǎng)6 h后樣品表面黏附菌株數量可達到約50 000 CFU/cm2；實驗室金屬門把手環(huán)境（b）中，開始培養(yǎng)時（1、3 h）僅有少量菌株，而與金屬接觸6 h后，在培養(yǎng)基上可以觀察到大量成蛛網狀的真菌（直徑 2～3 cm），但具體真菌種類還需通過16s基因測序進行進一步鑒定分析；醫(yī)院皮膚科門診室門把手環(huán)境（c）所示結果與（a）中類似，在培養(yǎng)6 h后存在有大量微生物。不過經過試驗對比可以看出，在2種金屬表面培養(yǎng)6 h后存活菌數量相差不大，304 Cu-SS雖然在普通304 SS的基礎上添加了一定量的銅元素，但并沒有表現出良好的抗菌性能。

圖3 金屬材料的應力-應變曲線

圖4 不同環(huán)境下各金屬抗菌性能測試結果

而觀察AHEA的抗菌效果，可以發(fā)現在剛開始進行培養(yǎng)時（1、3 h），部分樣品稀釋10倍涂板后上雖然也顯示生長出少量菌落，但數量相較于304 SS與304 Cu-SS上的已有顯著降低；而當培養(yǎng)時間到達6 h后，培養(yǎng)基上的菌落幾乎完全消失。與此同時，Cu中的菌落數量極少或者并沒有觀察到菌落。由抗菌率的計算公式結合試驗結果可以得出，37 ℃時AHEA對于在前述3種環(huán)境中所采集到的環(huán)境混菌大約只需要3～6 h，便可以達到99.99%的殺菌率。這些結果表明，AHEA可以作為一種高效的抗菌材料在實際環(huán)境中進行應用。

2.3 成膜性能分析

2.3.1 微生物形態(tài)分析

利用FESEM進一步研究4種金屬對固著微生物細胞的影響。如圖5所示，在覆膜6 h后，304 SS表面存在大量形態(tài)完好的微生物群落，表明微生物的生長較好；304 Cu-SS的表面形貌與304 SS相差無幾，表明304 Cu-SS并未表達出良好的抗菌性能；而相較于304 SS和304 Cu-SS，AHEA表面已經幾乎沒有任何附著的生物被膜，AHEA對于附著生物被膜的抑制幾乎達到了100%；Cu表面可以觀察到大量析出物，這可能與Cu容易被氧化有關，使得對Cu表面的觀察難度被進一步提高，也難以觀察到Cu表面有明顯附著的生物被膜，但結合平板數據可知Cu樣品表面并不存在活細菌。細胞染色技術將有利于進一步確定Cu以及其他合金表面的細菌黏附情況和活死狀態(tài)。這些結果說明AHEA在抑制生物被膜附著上的性能要顯著優(yōu)于304 SS和304 Cu-SS。相關研究表明，AHEA合金的抗菌性能來自內部銅相的直接接觸和釋放的銅離子，實現了對浮游和固著微生物的抑制和殺滅[25-26]。而304 Cu-SS雖然也會析出一定量的銅離子，但是并不足以對生物被膜形成起到有效的抑制效果。

圖5 覆膜6 h后不同金屬試樣表面的微生物群落形貌圖

2.3.2 活死細胞染色

使用活死細胞染色技術觀察6 h后4種不同類型金屬上的混菌生長狀態(tài)。如圖6所示，觀察結果與平板計數所展現出的規(guī)律相似。在Cu樣品上幾乎看不到任何活細菌和死細菌的存在，結合平板涂板結果，表明Cu能快速有效殺滅細菌以防止其黏附。在304 SS樣品上仍能觀察到大量存活的厚生物被膜，平均厚度為(56.2±2.5) μm；而在AHEA表面觀察到的生物被膜幾乎都已經被殺死，并且其平均厚度為(29.5± 0.5) μm，約為304 SS表面生物被膜厚度的一半；304 Cu-SS表面生物被膜的平均厚度為(42.8±1.0) μm，同樣遠高于AHEA。這一結果表明，AHEA對表面形成的生物被膜的抑制能力和殺滅效率都要顯著高于304 Cu-SS。

2.4 基因測序

在前文中已經證明了Al0.4CoCrCuFeNi新型含銅抗菌高熵合金對在3個環(huán)境中所采集到的混菌有著卓越的抗菌效果，但是由于尚不確定采集到的混菌的組成成分，所以無法判斷AHEA究竟對哪種或哪幾種菌甚至是真菌都有著良好抗菌效果，所以對混菌樣品進行了16S rDNA測序分析，通過得到環(huán)境中各物種的相對豐度來說明AHEA抗菌性能的積極意義。

2.4.1 細菌

對來自前述3種環(huán)境上的混菌樣品進行16S rDNA測序分析，得到優(yōu)勢細菌物種的相對豐度如表3所示。圖7為表3所對應的柱狀圖。樣本中豐度占比小于1%的物種歸為Others，其余的作為優(yōu)勢物種進行分析。

從試驗數據中可以觀察到，在ATM機金屬按鍵上采集到的混菌樣品的菌液（a）中豐度最高的為芽孢桿菌屬（）；而在304 SS樣品表面培養(yǎng) 6 h后（d），克雷伯氏菌屬（）成為了生物被膜中的優(yōu)勢菌種。多數芽孢桿菌屬細菌是無害的，只有少數對人和動物具有致病性，例如蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，臨床表現為嘔吐或腹瀉[27]；而當人感染克雷伯氏菌屬后，則會引起較嚴重的下呼吸道感染甚至死亡[2]。更為嚴重的是，近年來由于抗菌藥物的濫用，使得克雷伯氏菌對常用抗菌藥物呈現出嚴重的多重耐藥性，常常使臨床抗感染治療陷入困境，對臨床和公共衛(wèi)生健康產生巨大威脅[28]。

圖6 覆膜6 h后不同金屬試樣表面的微生物群落活死染色圖

表3 不同環(huán)境下的細菌組成和豐度

notes: 16S rDNA sequencing was performed after centrifugation and enrichment of bacterial solution and biofilm from three environments, including (a) ATM metal key bacterial solution, (b) laboratory metal door handle bacterial solution, (c) dermatology outpatient door handle bacterial solution, (d) ATM metal key biofilm, (e) laboratory metal door handle biofilm and (f) dermatology outpatient door handle biofilm.

圖7 表3所對應的柱狀圖

在實驗室金屬門把手上采集到的混菌樣品的菌液（b）中豐度最高的是克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬，此外還有少量的葡萄球菌屬（）和魏斯氏菌屬（）；經過6 h的培養(yǎng)后（e），葡萄球菌屬成為生物被膜中的優(yōu)勢菌種。少數葡萄球菌屬可導致疾病，是最常見的化膿性球菌，也是醫(yī)院交叉感染的重要來源之一，可以對人類和畜牧業(yè)造成嚴重的危害[29]。尤其是最廣為人知的金黃色葡萄球菌，可以引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等局部化膿感染，同時也可以引起敗血癥甚至是膿毒癥等全身感染[30]。魏斯氏菌屬則沒有那么嚴重的致病性，主要用途為發(fā)酵以及生物研究[31]。

在皮膚科門診室門把手上所采集的樣品的結果與其他2種環(huán)境類似，混菌菌液（c）中的優(yōu)勢菌種為葡萄球菌屬；培養(yǎng)6 h（f）后生物被膜中的優(yōu)勢菌種被克雷伯氏菌屬所取代，值得一提的是，因這種菌致病的病例中，有95%的患者是在醫(yī)院受到感染[2]。由此可見，這是一種不可忽視且危害極大的醫(yī)院中常見的致病細菌。

2.4.2 真菌

對來自前述3種環(huán)境下的混菌樣品進行16S rDNA測序分析，未能檢測到ATM機金屬按鍵以及皮膚科門診室門把手存在真菌物種。從實驗室金屬門把手得到優(yōu)勢真菌物種相對豐度如表4所示。圖8為表4所對應的柱狀圖。樣本中豐度占比小于1%的物種歸為Others，其余的作為優(yōu)勢物種進行分析。

在實驗室金屬門把手上采集到的混菌樣品的菌液（a）中，各種類的真菌豐度較為均勻，除了能導致植物根腐病[32]和人類肺真菌病[33]的鐮刀菌屬（）之外并沒有明顯的優(yōu)勢菌種。但是當在304 SS樣品表面培養(yǎng)6 h（b）后，依薩酵母屬（）、曲霉菌屬（）、帚枝霉屬（）以及威克漢姆酵母屬（）的相對豐度明顯高于其他物種。其中，依薩酵母屬可以在果蠅體表攜帶，這種酵母菌在致病性測定試驗中被證實為能夠引發(fā)葡萄酸腐病的致病菌，已經成為葡萄生長中后期重要的病害之一，造成葡萄果穗大量腐爛，嚴重影響葡萄的品質與產量[34]；曲霉菌屬則可以導致人體患多種疾病，例如感染性心內膜炎[35]、曲霉菌性脊柱炎[36]等；常見于霉變糧食中的黃曲霉菌也是曲霉菌屬的一種，其分泌的黃曲霉素在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構公布的一類致癌物清單中，對人體有著極大的危害；帚枝霉屬感染水稻后會引起水稻鞘腐病，造成20%～85%的產量損失[37]；威克漢姆酵母屬盡管屬于酵母菌屬，但也會感染人類引起真菌血癥[38]。這4種真菌在生物被膜樣品中的總相對豐度之和超過了60%，并且任何一種感染動物或植物后都能引起嚴重的疾病，會對生產或是生活產生重大影響。

除了上述4種可以感染人體或植物導致發(fā)病的真菌外，在非優(yōu)勢物種中，還有一些真菌同樣可以引起各種疾病，例如假絲酵母菌屬（）在一定條件下可侵犯皮膚、黏膜、內臟和血液，引起繼發(fā)性感染，表現為急性、亞急性或慢性炎癥[39]，并且假絲酵母菌外陰陰道炎是育齡期女性的常見病和多發(fā)病，其長期反復發(fā)作、難以根治的特點嚴重影響患者的日常生活及身心健康[40]；生絲畢赤酵母屬（）長期以來雖然只被用作生物研究，但是近期也被發(fā)現同樣可以感染人類[41]；根毛霉屬（）會引起皮膚接合菌病，且發(fā)生率正在逐年增加[42]；絕大多數木霉（）對人類無害，但有些種類能夠感染人類造成木霉病，表現形式多樣，臨床極易誤診，臨床表現中以腹膜炎最多見[43]；喙枝孢霉屬（）在2020年被發(fā)現是導致免疫能力差的患者患腦真菌病的致病菌[44]；短梗霉屬（）引發(fā)的感染在臨床上多表現為真菌血癥，腹膜炎或者皮膚感染[45]。

表4 實驗室門把手的真菌豐度和組成

notes: 16S rDNA sequencing was carried out after centrifugation and enrichment of bacterial solution and biofilm from laboratory door handle, including (a) laboratory metal door handle bacterial solution, (b) laboratory metal door handle biofilm.

圖8 表4所對應的柱狀圖

2.5 ROS分析

選用實驗室環(huán)境下的微生物菌群覆膜于不同金屬表面，觀察其在不同時間節(jié)點下產生的活性氧（ROS），如圖9所示。與AHEA和純銅相比，304不銹鋼以及304 Cu-SS樣品上幾乎沒有綠色熒光，表明304 Cu-SS在短時間內幾乎沒有ROS產生，因此沒有抗菌性。相比之下，AHEA表面在3 h后便觀察到高水平的ROS（高熒光強度），純Cu材料表面ROS產量最高。結合合金組織與成分分析（圖2）可知，合金中的Cu含量越多，微生物菌群中的ROS產量越高。而ROS的高表達也證明了抗菌高熵材料與微生物（包含細菌和真菌）的直接接觸會引發(fā)接觸式殺菌反應，從而催化ROS表達，破壞細菌結構。

圖9 實驗室菌液覆膜1、3、6 h后不同金屬試樣表面的活性氧染色圖

3 結論

通過抗菌測試、活死細胞染色、微生物形態(tài)分析、活性氧分析，證明了Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金對于多種生活環(huán)境中常見的、可能引起人或各種動植物患病的細菌或真菌都有良好的、接近純銅的抗菌性能，對環(huán)境微生物的抑制效果顯著高于304 SS與304 Cu-SS。這一結論有利于更好地將此種新型合金材料應用于各種生活環(huán)境，拓展其相關應用，為開發(fā)兼具抗菌性能等綜合性能優(yōu)異的生活用金屬新材料提供新思路及數據支撐，為未來的金屬防護提供新的有效的材料。

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Antibacterial Properties of Al0.4CoCrCuFeNi High Entropy Alloy in Living Environment

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(School of Materials Science and Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China)

By using the multi principal component design idea of high entropy alloy and adding high content of copper, the work aims to prepare the new antibacterial high-entropy alloy (AHEA, Al0.4CoCrCuFeNi) containing copper with excellent mechanical properties and to explore the antibacterial performance of it in a variety of complex living environments. The phase composition of high-entropy alloys is analyzed through XRD. Taking of the tensile test to study the mechanical properties of high entropy alloy, and collect microbial communities in various living environments. Furthermore, by plate coating, using field emission scanning electron microscope (FESEM) and confocal laser scanning microscope (CLSM) to observe the bacterial growth and film morphology, and to compare and analyze the antibacterial properties of the high entropy alloy. Through gene sequencing, OTU cluster analysis and species taxonomy analysis were carried out to statistically analyze community structure and species diversity. Through the analysis of reactive oxygen species clusters, the sterilization mechanism of high entropy alloys was explored. The gauge length of the rod tensile specimen is 33 mm and the diameter is 6 mm. A constant strain rate of the room temperature tensile test is executed 1×10?3s?1. And the final yield strength result is (308±10) MPa, which is higher than that of traditional antibacterial stainless steel. In this experiment, a medical cotton swab sterilized in a sterilizer was placed in a 50 mL centrifuge tube containing 10.9 g/L PBS buffer. Three environments are randomly selected: the metal button of ATM (a), the metal door handle of laboratory (b) and the door handle of dermatology clinic (c). Then the collected strains are enriched and cultured with LB liquid medium and cultured in a shaking table at 37 ℃ for 12 hours waiting to be used. Through the calculation formula of antibacterial rate and the experimental results (- the antibacterial rate;- the number of viable bacteria in the control (CFU/ml);- the number of viable bacteria in antibacterial sample (CFU/ml), it is concluded that the antibacterial rate of high entropy alloy is more than 99.99%. The results of scanning electron microscope (FESEM) analysis and live and dead staining results shows that the number of colonies on the surface of AHEA decrease significantly and there are almost no living microorganisms, cause the stained image is basically in red and it sparsely distributes. In addition, the sequencing results shows that the dominant bacteria that are easy to adhere to the surface of common metal samples are mostly harmful pathogens, including bacteria and fungi, after consulting the data, it shows that the collected dominant bacteria will cause serious diseases or have a great impact on production and life, but fortunately, AHEA inhibits them nicely. The above results indicate that AHEA can be used as a long-term broad-spectrum antibacterial material. It can prevent the reproduction and growth of bacteria and fungi on the metal surface and the formation of biofilm. The comprehensive performance is much better than that of traditional antibacterial alloys. The application prospect of copper containing high entropy alloy in daily living environment is confirmed, which provides a new idea for the further development of unique antibacterial metal materials with high antibacterial efficiency and mechanical properties.

antibacterial alloys; high-entropy alloys; anti-bacterial; anti-fungal; biofilm; living-environment

tg172

A

1001-3660(2023)01-0266-12

10.16490/j.cnki.issn.1001-3660.2023.01.027

2022–01–12；

2022–03–05

2022-01-12；

2022-03-05

遼寧省興遼英才計劃項目（XLYC1907158）

Liaoning Revitalization Talents Program (XLYC1907158)

周恩澤（1991—），男，博士，主要研究方向為微生物腐蝕。

ZHOU En-ze (1991-), Male, Doctor, Research focus: microbiologically influenced corrosion.

肖凌云, 武文韜, 周沂霖, 等. Al0.4CoCrCuFeNi高熵合金在生活環(huán)境中的抗菌性能[J]. 表面技術, 2023, 52(1): 266-277.

XIAO Ling-yun, WU Wen-tao, ZHOU Yi-lin, et al. Antibacterial Properties of Al0.4CoCrCuFeNi High Entropy Alloy in Living Environment[J]. Surface Technology, 2023, 52(1): 266-277.

責任編輯：萬長清