景棋， 余逸如， Chu ChunHung， 李燕， 李明云

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都（610041）； 2.香港大學(xué)口腔醫(yī)院，香港（999077）

口腔擁有僅次于腸道的第二大多樣性微生物群，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中逐漸成為維持口腔動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵性因素?？谇唤】凳茉S多因素影響，如口腔pH 值變化、宿主飲食、營(yíng)養(yǎng)條件、藥理因素和外部環(huán)境，而口腔微生物群落在口腔微環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)中占據(jù)主導(dǎo)地位［1］，如齲齒、牙周病和口腔念珠菌病等由于微生物群和宿主之間的不平衡而引起的疾病常有發(fā)生［2］?？谇恢械奈⑸镏饕ň釉谘例X的硬組織和口腔黏膜的軟組織中，不同的微生物之間可以形成復(fù)雜的生物膜，從而加快口腔疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。

口腔免疫系統(tǒng)由三個(gè)主要部分組成：上皮層、固有層和黏膜相關(guān)淋巴組織。在口腔的免疫調(diào)節(jié)中先天免疫系統(tǒng)的作用處于戰(zhàn)略性地位，其中中性粒細(xì)胞作為第一批到達(dá)炎癥部位的先天免疫細(xì)胞［4］，以龐大的數(shù)量和快速的行動(dòng)力發(fā)揮其殺菌抗感染作用，在面對(duì)口腔微生物病態(tài)侵襲中起著至關(guān)重要的作用。中性粒細(xì)胞由骨髓細(xì)胞分化而來，離開骨髓后壽命短，常以靜止、啟動(dòng)或活躍狀態(tài)存在。通過內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子激活，或者在血管屏障受損后而激活，經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)招募到達(dá)炎癥部位或受損組織中（圖1）［5］。中性粒細(xì)胞的主要功能是通過吞噬清除病原體及其碎片［6］，相比于其他的免疫細(xì)胞還具一種獨(dú)特免疫形式，釋放一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）對(duì)快速增殖擴(kuò)散的病原體進(jìn)行捕獲，并使之滅活［7］。由于其功能的特殊性，大量產(chǎn)生可能會(huì)導(dǎo)致組織損傷，在目前的研究中發(fā)現(xiàn)NETs 形成和降解之間的失衡在炎癥、凝血功能障礙、器官損傷、免疫血栓形成和新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）重癥病例的病理生理學(xué)中起著重要作用［8］。

1 中性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)NETs 形成機(jī)制

2004 年首次報(bào)道了中性粒細(xì)胞的另一種殺死病原體的機(jī)制［9］，即中性粒細(xì)胞胞外捕獲網(wǎng)，它是由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的復(fù)雜DNA 網(wǎng)絡(luò)，由離散的DNA 和多種包括組蛋白在內(nèi)的30 多種組分構(gòu)成［10］，特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以包裹住病原體，并限制其擴(kuò)散到其他未受侵襲的組織。作為中性粒細(xì)胞的免疫路徑之一，NETs 的形成也是一個(gè)受調(diào)控的過程，但是相關(guān)的信號(hào)仍然未知，目前已知并證明的有關(guān)NETs 生成的通路主要有自殺性和非自殺性兩種，自殺性NETs 的形成過程通常伴有中性粒細(xì)胞破裂死亡（圖1），而非自殺性NETs 的形成機(jī)制可獨(dú)立于細(xì)胞死亡發(fā)生，形成分泌型核染色質(zhì)通過胞吐排出。兩者在依靠通路上有所區(qū)別，其中自殺性NETs 的形成依賴于活性氧（reactive oxygen species，ROS）通過蛋白質(zhì)肽基精氨酸脫氨酶4（peptidyl arginine deaminase 4，PAD4）進(jìn)行組蛋白瓜氨酸化，使染色質(zhì)解密集，其開始于核泡沫化和核膜的解體，并繼續(xù)伴隨著細(xì)胞極化的喪失、染色質(zhì)的解凝和質(zhì)膜的破裂，最終釋放形成NETs；而非自殺性的NETs 的形成不表現(xiàn)出核或質(zhì)膜丟失，且與ROS 和Raf/MERK/ERK 通路無關(guān)［11］。

炎癥是由多因素導(dǎo)致的，其中可以誘導(dǎo)NETs生成的炎癥刺激因子的類型分為無菌性炎癥、微生物性炎癥及病毒性炎癥。微生物性炎癥是最為常見炎癥類型，能引起炎癥的微生物種類繁多，其中較為典型病原微生物類有白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌，均受到NETs 及其組分的影響。NETs 在免疫中的作用是一把雙刃劍，雖然限制病原體的擴(kuò)散，但其強(qiáng)大且復(fù)雜的作用機(jī)制，使病原體可能通過NETs 對(duì)其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用［12］，同時(shí)NETs 的過量表達(dá)會(huì)對(duì)生物體造成損害［13］。NETs 空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)成與DNA 密切相關(guān)，細(xì)菌可通過釋放DNA 酶來降解NETs 中的DNA 結(jié)構(gòu)從而達(dá)到逃離其捕獲的作用。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)使用DNA 酶能對(duì)炎癥過程中過量產(chǎn)生的NETs 進(jìn)行降解，能夠減緩組織損傷［14］，這也反向證明了NETs 具有的負(fù)面作用。

Figure 1 Diagram of NETs induced by Candida albicans invading tissue(a case of suicidal NETs formation)圖1 白色念珠菌侵襲組織誘導(dǎo)NETs 示意圖（以自殺性NETs 形成為例）

2 口腔中的中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞是終末分化的先天性免疫細(xì)胞，由骨髓中的造血干細(xì)胞分化而來，在轉(zhuǎn)化初期作為循環(huán)性中性粒細(xì)胞（cyclical polymorphonuclear leukocyte，cPMN）在外周血循環(huán)中轉(zhuǎn)運(yùn)［15］。傳統(tǒng)效應(yīng)過程中，受到炎癥因子刺激后cPMN 離開血管系統(tǒng)，遷移到組織損傷、炎癥和感染的部位，執(zhí)行各種保護(hù)和抗菌功能，有助于消除病原體和受損細(xì)胞。中性粒細(xì)胞作為免疫中的重要細(xì)胞，為更好地對(duì)各部位進(jìn)行合理調(diào)控，其產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子在各部位表達(dá)上也有所不同?？谇蛔鳛橐粋€(gè)富有各種微生物的開放性消化器官，在健康狀態(tài)下，每分鐘約有30 000 個(gè)口腔中性粒細(xì)胞（oral polymorphonuclear leukocyte，oPMN）通過齦溝液到達(dá)口腔。在面臨各種外來的病原體時(shí)，維持口腔微環(huán)境平衡的oPMN 通過產(chǎn)生NETs 限制并消滅病原體。由于作用環(huán)境的特殊性，oPMN 相較于cPMN增加了對(duì)各種微生物的黏附性和吞噬作用，且無論是否受到刺激，oPMN 形成的NETs 是cPMN 的13 倍［16］。在慢性炎癥的情況下，如牙周炎［17］發(fā)生過程中有過度活躍表型的oPMN 大量涌入口腔［18］，這種現(xiàn)象一定程度反映了牙周病的嚴(yán)重程度和治療的具體情況［17］。與其他部位的炎癥情況相類似，口腔招募中性粒細(xì)胞也是通過各種內(nèi)源性和外源性化學(xué)誘導(dǎo)因子進(jìn)行介導(dǎo)的，如白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、細(xì)菌源脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和n-甲?；琢蝓；?亮氨酸-苯丙氨酸（N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine，fMLP）。

oPMNs 在口腔生態(tài)系統(tǒng)的高度活躍［19］和特化特點(diǎn)能使它們?cè)谶M(jìn)入口腔后仍有較強(qiáng)能力將微生物連同oPMNs 產(chǎn)生大量NETs 一起吞噬，所以對(duì)維持口腔生態(tài)系統(tǒng)的平衡有至關(guān)重要的作用。

研究表明，口腔黏膜屏障的破壞可能有助于口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展［20］，同時(shí)口腔微生物失調(diào)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)會(huì)引起牙齦屏障破壞，導(dǎo)致牙周炎患者骨質(zhì)流失［21］。作用于口腔黏膜屏障的口腔中性粒細(xì)胞對(duì)維持口腔微環(huán)境平衡至關(guān)重要。

3 口腔感染性疾病相關(guān)微生物與NETs

3.1 白色念珠菌與NETs

口腔黏膜是最有可能受到后天系統(tǒng)性疾病損害的組織［22］。很多疾病最初的病理現(xiàn)象出現(xiàn)在口腔黏膜中，并且口腔黏膜疾病是部分系統(tǒng)性疾病的并發(fā)癥?？谇荒钪榫∈侨祟愖畛Ｒ姷目谇徽婢腥荆?3］?？谇荒钪榫】赡馨殡S或繼發(fā)于其他口腔黏膜疾病或系統(tǒng)性疾病［24］。

義齒性口炎、口腔念珠菌病是白色念珠菌定植導(dǎo)致的口腔黏膜性疾病，兩者都常見于免疫力低下的人群。其中義齒性口炎是由于活動(dòng)義齒為微生物的黏附提供了依附表面，可使白色念珠菌為主的病原菌生成生物膜，其形成會(huì)使致病因子的表達(dá)增加，從而使免疫系統(tǒng)抗菌作用和免疫細(xì)胞的吞噬作用的敏感性急劇下降［25］，為黏附在口腔黏膜表面以及口炎的發(fā)生提供了條件［26］。口咽念珠菌病則是接受大劑量癌癥化療患者的常見感染。該患者群體發(fā)病和死亡的主要原因是黏膜損傷加上化療對(duì)骨髓中免疫細(xì)胞的抑制作用，通過黏膜屏障促進(jìn)細(xì)菌和真菌移位，導(dǎo)致血液感染。在健康宿主中，未受干擾的常住共棲細(xì)菌群落在限制白色念珠菌在黏膜部位的定植方面起著重要作用［27］。

白色念珠菌誘導(dǎo)NETs 的路徑既有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH）相關(guān)的路徑，也有與NADPH 無關(guān)的路徑［28-29］。有研究表明未被調(diào)理素作用過的白色念珠菌通過dectin-2 及其下游信號(hào)通路誘發(fā)不依賴于NADPH 氧化酶的NETs 的形成，而dectin-2 介導(dǎo)的NETs 有助于抑制真菌的傳播［28］。白色念珠菌作為雙形態(tài)真菌，致病性主要體現(xiàn)在其菌絲相，而酵母相一般不引發(fā)NETs，這種現(xiàn)象與中性粒細(xì)胞能通過中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶感知微生物的大小并選擇性地釋放NETs 有關(guān)。dectin-1 受體作為廣泛存在于免疫細(xì)胞表面的主要模式識(shí)別受體，可識(shí)別真菌相關(guān)成分如β-葡聚糖、分泌的天冬氨酸蛋白酶和甘露聚糖［30］，dectin-1 缺陷會(huì)導(dǎo)致感染期間異常的NETs 釋放和過度生成導(dǎo)致的組織損傷［31］。

3.2 金黃色葡萄球菌與NETs

金黃色葡萄球菌相較于白色念珠菌毒性更強(qiáng)，但是相較于絲狀白色念珠菌，金黃色葡萄球菌更難直接依附在口腔黏膜表面，常在義齒性口炎中和白色念珠菌被共同檢出。鑒于義齒性口炎的特殊性，金黃色葡萄球菌會(huì)黏附在義齒材料的裂紋和缺口處，使假牙成為病原體的宿主，提供更進(jìn)一步黏膜暴露的機(jī)會(huì)。佩戴假牙后的宿主環(huán)境可能使金黃色葡萄球菌的毒性更強(qiáng)，同時(shí)在假牙上定植的金黃色葡萄球菌可能會(huì)擴(kuò)散傳播到身體的其他部位。已發(fā)表的證據(jù)表明，義齒表面的生物膜碎片可能會(huì)被送到肺部，導(dǎo)致系統(tǒng)性感染［32］。

引發(fā)膜性口炎的球菌主要是金黃色葡萄球菌，并常伴有其他的球狀細(xì)菌，正常情況金黃色葡萄球菌很難單獨(dú)致病，只有生物體遭受生物化學(xué)物理的特殊刺激，導(dǎo)致生物體的免疫功能降低時(shí)才會(huì)引發(fā)此病。

完整形態(tài)的金黃色葡萄球菌主要誘導(dǎo)非溶解形式的NETs 產(chǎn)生［33］，金黃色葡萄球菌釋放的有關(guān)毒力因子同樣也可誘導(dǎo)NETs 的形成，有研究證明殺白細(xì)胞素（panton-valentine leucocidin，PVL）是自殺形式NETs 形成的主要誘導(dǎo)物［34］，金黃色葡萄球菌通過核酸酶和腺苷合酶的協(xié)同作用，將網(wǎng)中的DNA 轉(zhuǎn)化為脫氧腺苷，從而逃避宿主的防御。脫氧腺苷反過來殺死巨噬細(xì)胞，防止其滲入金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的膿腫，從而降低抗菌作用［35］；同時(shí)金黃色葡萄球菌也會(huì)產(chǎn)生生物膜，與中性粒細(xì)胞接觸時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)NETs 病變并阻斷其抗菌活性。金黃色葡萄球菌生物膜會(huì)釋放PVL 使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs 和形成胞漿體即無核的中性粒細(xì)胞，生成的無核中性粒細(xì)胞雖然仍能滲透生物膜結(jié)構(gòu)并吞噬細(xì)菌，但不能有效清除生物膜。同樣，誘導(dǎo)的NETs 不足以清除金黃色葡萄球菌生物膜。這些結(jié)構(gòu)的低效性歸因于白細(xì)胞毒素GH，一種在吞噬過程中促進(jìn)金黃色葡萄球菌存活的毒素，同時(shí)由金黃色葡萄球菌核酸酶介導(dǎo)的降解NETs 作用能夠讓包裹在NETs 中的生物膜相關(guān)細(xì)菌的持久性得到提升。金黃色葡萄球菌（和其他細(xì)菌物種）可能從誘導(dǎo)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和利用這些結(jié)構(gòu)損傷宿主組織中獲益，導(dǎo)致細(xì)菌的擴(kuò)散和慢性感染的持久性，而不是阻斷NETs 結(jié)構(gòu)的抗菌活性［36］。金黃色葡萄球菌能夠定植在白色念珠菌生物膜上，引起致病性［35］，同時(shí)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時(shí)水解酶、分泌天冬氨酸蛋白酶（aspartic acid protease，SAP）的分泌增強(qiáng)。SAP 是白色念珠菌的毒力因子之一，有助于其蛋白水解，并在宿主組織黏附和定植中發(fā)揮重要作用［36］。有研究表明白色念珠菌生物膜可促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并且抗真菌靶向治療可有效減少金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)［37］。

3.3 牙齦卟啉單胞菌與NETs

牙周炎紅色復(fù)合體有6 種微生物：伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌、牙齦類桿菌、中間普氏菌、梭形桿菌和螺旋體等，其中牙齦卟啉單胞菌是牙周炎的主要病原體，可通過產(chǎn)生牙齦蛋白酶和膠原酶等干擾細(xì)胞間連接。牙周炎患者的口腔比健康人的口腔更容易檢測(cè)到NETs［38］。中性粒細(xì)胞對(duì)病原體反應(yīng)和中性粒細(xì)胞凋亡的平衡對(duì)維持口腔健康非常重要，打破這種平衡會(huì)導(dǎo)致牙周炎的發(fā)展［39］。一方面，過度活躍的中性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞釋放的破壞性酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶或活性氧）和NETs 的局部積累可導(dǎo)致組織破壞，從而導(dǎo)致牙周炎［5］；另一方面，抑制中性粒細(xì)胞的抗菌反應(yīng)也可導(dǎo)致牙周炎的發(fā)展增快［40］，而且高水平的NET可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并為牙周病原菌提供合適的環(huán)境。

與口腔鏈球菌和放線菌相比，牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞減少了NETs 形成和基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，可能是為了逃避中性粒細(xì)胞的抗菌機(jī)制［41］。此外，牙齦卟啉單胞菌逃避中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷，可能有助于其在組織中的定植和入侵［42］。因此，中性粒細(xì)胞可能無法完全清除牙齦卟啉單胞菌，這種病原體的持續(xù)存在可能引起感染后期中性粒細(xì)胞持續(xù)募集和激活，隨后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞過度激活，產(chǎn)生大量NETs 并破壞組織，為牙齦卟啉單胞菌提供營(yíng)養(yǎng)［43］。

4 小 結(jié)

口腔中存在功能特異化的口腔中性粒細(xì)胞，它在一些特性上與常見的針對(duì)于其他身體炎癥的中性粒細(xì)胞有一定差異，口腔感染性疾病的發(fā)生群體較為廣泛，NETs 作為一種特殊的具有雙面性的效應(yīng)物質(zhì)，可從口腔內(nèi)的NETs 機(jī)制探索其與各種病原體的相互作用。

【Author contributions】 Jing Q collected the references and wrote the article. Yu YR, Chu CH, Li Y, Li MY revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.