楊天為，黃詩(shī)宇，張尚文，高曼熔，張向軍，李 婷，庾韋花，蒙 平，石 前

（1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 南寧 530007； 2.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 南寧 530004）

赤蒼藤（Erythropalum scandensBlume）為鐵青樹(shù)科赤蒼藤屬多年生常綠大型木質(zhì)藤本植物，又稱牛耳藤、萎藤、勾華、側(cè)莧、細(xì)綠藤，主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)，主產(chǎn)地位于華南地區(qū)以及貴州、云南等地的中低海拔區(qū)域。赤蒼藤作為一種藥用植物被收錄在《廣西藥用植物名錄》[1]中，它也是一種藥食兼用的天然野生植物，嫩葉可作鮮食蔬菜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、口味鮮美、清香獨(dú)特；莖、根可作藥材，莖可利尿醫(yī)黃疸、治療風(fēng)濕骨痛，根可祛水腫，治療跌打損傷[2]。近年來(lái)，隨著赤蒼藤的食用和藥用價(jià)值獲得人們認(rèn)可，市場(chǎng)需求也日益增長(zhǎng)，而我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)具有豐富的赤蒼藤野生資源，有很大的開(kāi)發(fā)潛力，目前，有關(guān)赤蒼藤的研究主要是生產(chǎn)栽培技術(shù)[3-4]、品種選育[5]、化學(xué)成分分析[6-7]與藥理作用[8]等方面，而有關(guān)赤蒼藤種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與分類、遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此，對(duì)赤蒼藤開(kāi)展種質(zhì)間遺傳特性的深入研究可以為赤蒼藤種質(zhì)資源的收集與保護(hù)、品種選育與改良提供理論依據(jù)，對(duì)推進(jìn)產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展具有重要意義。

分子標(biāo)記已經(jīng)成為研究生物個(gè)體間遺傳多樣性的重要手段之一，較常用的分子標(biāo)記方法有SSR、ISSR、SCoT 和AFLP 等[9-10]，其中SCoT 標(biāo)記是根據(jù)基因組中ATG 翻譯起始位點(diǎn)的側(cè)翼有一段短的保守序列的原理進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，是一種通過(guò)單引物擴(kuò)增目的基因的功能性分子標(biāo)記[11]，正是因?yàn)檫@一原理，其與許多功能基因能夠形成較多的引物結(jié)合位點(diǎn)，擴(kuò)增的序列介于外顯子與內(nèi)含子之間，大幅度提升了引物的多態(tài)性。SCoT 與其他分子標(biāo)記手段相比，SCoT 標(biāo)記技術(shù)與供試材料的功能基因密切相關(guān)，更能反映相關(guān)功能性狀的多態(tài)性，且所用引物簡(jiǎn)單、通用性強(qiáng)、擴(kuò)增的條帶穩(wěn)定且多態(tài)性高，擴(kuò)增產(chǎn)物能夠通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單方便、成本低，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在植物的遺傳多樣性、親緣關(guān)系研究、種質(zhì)資源鑒定與指紋圖譜的構(gòu)建等方面的研究中[10]。目前，SCoT 分子標(biāo)記已經(jīng)成功應(yīng)用于龍眼[12]、芥菜[13]、葡萄[14]、葛根[15]、鐵皮石斛[16]等植物的遺傳多樣性研究。

筆者以24 份不同來(lái)源地的野生赤蒼藤種質(zhì)為材料，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法建立并優(yōu)化赤蒼藤SCoT-PCR 反應(yīng)體系，從SCoT 引物中篩選出穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、條帶清晰的引物，為赤蒼藤SCoT分子標(biāo)記的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后赤蒼藤種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳多樣性分析以及種質(zhì)資源鑒定等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2022 年4 月在廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行，試驗(yàn)材料為隨機(jī)抽取的24份不同來(lái)源地的野生赤蒼藤種質(zhì)（表1），進(jìn)行PCR體系優(yōu)化與引物篩選，引物采用Collard 和Mackill公布的SCoT 分子標(biāo)記引物SCoT-1～SCoT-36[11]，由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 24 份赤蒼藤種質(zhì)編號(hào)及來(lái)源地

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取與檢測(cè) 采用Biospin

全能型植物基因組DNA 提取試劑盒（BSC13S1B，杭州博日科技股份有限公司）提取不同來(lái)源地的赤蒼藤葉片的DNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度和純度，通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，提取的赤蒼藤DNA 在-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 SCoT-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化 使用預(yù)擴(kuò)增效果較好的SCoT-1 引物、Es 24 赤蒼藤DNA 模板，對(duì)SCoT-PCR 反應(yīng)體系中DNA 模板量、引物、2×EsTaqMaster Mix（CW0690M，康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）3 個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，采用L9（33）正交試驗(yàn)（表2），每個(gè)處理2 次重復(fù)。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃2 min 預(yù)變性；94 ℃30 s 變性，57 ℃30 s 復(fù)性，72 ℃30 s 延伸，35次循環(huán)；72 ℃5 min 總延伸；反應(yīng)體系為20 μL，DNA 模板、引物、2×EsTaqMaster Mix 用量按正交試驗(yàn)表添加，剩余用ddH2O 補(bǔ)足，PCR 反應(yīng)結(jié)束后使用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，拍照分析各反應(yīng)條件的擴(kuò)增效果。正交試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)直觀分析法[17]進(jìn)行分析，根據(jù)擴(kuò)增條帶數(shù)量、清晰程度等進(jìn)行評(píng)分，滿分為9 分，分值越高代表擴(kuò)增效果越好。計(jì)算每個(gè)因素不同水平下的評(píng)分平均值Ki，并求出同一因素不同水平間的評(píng)分平均值的極差R，R值越大表示影響程度越大，最終篩選出最適合的反應(yīng)條件。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平

1.2.3 引物初篩和退火溫度篩選 以Es24 赤蒼藤DNA 為模板，SCoT-1～SCoT-36 為引物，使用優(yōu)化后的SCoT-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行初步篩選，并對(duì)初篩結(jié)果中擴(kuò)增條帶不清晰的引物設(shè)置退火溫度梯度（48、51、53、57、60、63 ℃）進(jìn)行復(fù)篩。挑選2 輪篩選中條帶清晰，多態(tài)性高的引物用于SCoT-PCR 反應(yīng)體系驗(yàn)證。

1.2.4 SCoT-PCR 反應(yīng)體系驗(yàn)證 從篩選到的條帶清晰、多態(tài)性高的引物中隨機(jī)挑選3 個(gè)引物對(duì)24份赤蒼藤DNA 模板驗(yàn)證篩選出的最佳反應(yīng)體系，用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 生成三因素三水平正交試驗(yàn)表，通過(guò)Excel 2016 計(jì)算平均值Ki和極差R。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)PCR 擴(kuò)增結(jié)果（圖1）看出不同的正交組合擴(kuò)增的條帶有較大差異，條帶數(shù)量，清晰程度均有不同，其中處理8 的擴(kuò)增效果最好，評(píng)分結(jié)果如表3 所示，通過(guò)R值判斷3 個(gè)因素對(duì)赤蒼藤SCoT-PCR 反應(yīng)體系的影響程度排序?yàn)椋篋NA 模板量＞引物用量＞Mix 混合液用量，通過(guò)Ki值確定最優(yōu)反應(yīng)體系（20.0 μL）為1.0 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL 引物（10 μmoL·μL-1）、10.0 μL Mix 混合液和7.8 μL ddH2O。

圖1 SCoT-PCR 正交試驗(yàn)電泳檢測(cè)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)組合及評(píng)分

2.2 引物初篩與退火溫度篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)SCoT-1～SCoT-36 引物的初步篩選以及部分引物退火溫度的復(fù)篩，由圖2 可知，不同退火溫度對(duì)PCR 擴(kuò)增的結(jié)果影響較大，退火溫度越高，擴(kuò)增的條帶越少，不同引物的最適退火溫度也不相同。以背景清晰、條帶明亮、數(shù)量多的擴(kuò)增結(jié)果確定最佳退火溫度，淘汰各個(gè)退火溫度下擴(kuò)增效果均不太好的引物，最終確定表4 引物和退火溫度適用于赤蒼藤材料的SCoT-PCR 反應(yīng)。

圖2 部分引物的退火溫度篩選電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 SCoT-PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證結(jié)果

在篩選出的SCoT 引物中隨機(jī)挑選了SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22 引物進(jìn)行SCoT-PCR 反應(yīng)體系驗(yàn)證（表4），以24 份不同來(lái)源地的赤蒼藤材料DNA為模板，隨機(jī)挑選的3 條引物均能擴(kuò)增出背景清晰、多態(tài)性豐富的條帶（圖3），不同來(lái)源地的赤蒼藤的擴(kuò)增條帶能夠體現(xiàn)出差異，其中SCoT-2 共擴(kuò)增11個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)11 個(gè)；SCoT-11 共擴(kuò)增10 個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)6 個(gè)；SCoT-22 共擴(kuò)增11 個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)9 個(gè)。結(jié)果表明，該SCoT-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可用于赤蒼藤的SCoT 分子標(biāo)記。

表4 適用于赤蒼藤SCoT 分子標(biāo)記的引物最適退火溫度

圖3 SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22 引物對(duì)24 份赤蒼藤材料的SCoT-PCR 電泳檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

SCoT 分子標(biāo)記是一種與目的基因緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記方法，它利用基因組中ATG 翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼的序列具有較高的保守性和一致性的原理，能夠擴(kuò)增相關(guān)功能基因，獲得與性狀緊密聯(lián)系的分子標(biāo)記[10-11]。準(zhǔn)確、有效地應(yīng)用SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)需要建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的SCoT-PCR 反應(yīng)體系，而SCoT-PCR 反應(yīng)受多個(gè)因素的影響，且不同材料的SCoT-PCR 反應(yīng)體系的各因素對(duì)體系的影響是不同的[16，18-19]，因此需要通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化研究材料的PCR 反應(yīng)體系。通常SCoT 標(biāo)記的反應(yīng)體系中影響的因素為Mg2+、模板DNA、引物、DNA 聚合酶、dNTPs 等。尚小紅等[20]、孫成成等[21]的研究通過(guò)對(duì)這5 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)來(lái)完成SCoT-PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化，隨著PCR Mix 混合液的應(yīng)用，在PCR反應(yīng)體系中5 個(gè)因素變?yōu)? 個(gè)因素，減少了試劑的添加步驟，使PCR 結(jié)果更為穩(wěn)定可靠，重復(fù)性更好[22]。筆者試驗(yàn)使用的2×EsTaqMaster Mix 中含有Mg2+、dNTPs、DNA 聚合酶，這些因素會(huì)影響PCR擴(kuò)增結(jié)果，也需要通過(guò)設(shè)置梯度探索適用于赤蒼藤的反應(yīng)條件。邵征績(jī)等[16]、婁永峰等[23]通過(guò)Mix 混合液、模板DNA、引物3 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)獲得了鐵皮石斛和陳山紅心杉SCoT-PCR 的最優(yōu)反應(yīng)體系。筆者通過(guò)三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化SCoT-PCR 反應(yīng)體系，結(jié)果表明，3 個(gè)因素對(duì)赤蒼藤SCoT-PCR 反應(yīng)體系的影響程度排序?yàn)椋篋NA 模板量＞引物用量＞Mix 混合液用量，與黃曉慧等[24]的中國(guó)蘭的體系優(yōu)化研究結(jié)果一致，但與鐵皮石斛[16]、沙棘[18]、陳山紅心杉[23]的研究結(jié)果有所差異，說(shuō)明反應(yīng)體系的影響因素因植物材料的不同，結(jié)果表現(xiàn)也不相同。

在PCR 反應(yīng)條件中，退火溫度也是重要的影響因素，溫度過(guò)高會(huì)致使引物與DNA 模板結(jié)合差、多態(tài)性低、條帶少，而溫度過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致引物與DNA模板的非特異性結(jié)合，影響試驗(yàn)結(jié)果[25]。因此，筆者通過(guò)對(duì)SCoT 引物設(shè)置退火溫度梯度篩選，進(jìn)一步優(yōu)化SCoT-PCR 反應(yīng)條件，確定了該反應(yīng)體系下引物的最適退火溫度，使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，有利于后續(xù)相關(guān)研究工作的開(kāi)展。

筆者采用正交試驗(yàn)篩選出SCoT-PCR 反應(yīng)影響因素的最佳條件，并利用該反應(yīng)體系篩選出適用于赤蒼藤的SCoT 標(biāo)記引物，再通過(guò)不同地理位置分布的赤蒼藤種質(zhì)材料對(duì)該反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證，最終確立赤蒼藤SCoT-PCR 最優(yōu)反應(yīng)體系為1.0 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL 引物（10 μmol·μL-1）、10.0 μL Mix 混合液和7.8 μL ddH2O。筆者共篩選了SCoT-1、SCoT-2 等14 條引物，確定了該反應(yīng)體系下14 條引物的最適退火溫度，為后續(xù)開(kāi)展赤蒼藤種質(zhì)資源收集與保護(hù)、遺傳多樣性研究和分子育種提供參考依據(jù)。