王斐，朱鎮(zhèn)華

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007

鼻咽癌是一種頭頸部惡性腫瘤，具有病情隱匿的特點，70%的患者確診時已為晚期[1-2]。目前針對鼻咽癌的治療方案主要為放療與化療聯(lián)合應用[3]，但多存在遠處轉移及復發(fā)問題[4-6]。放化療常見唾液腺損傷、放射性皮膚損傷、耳鼻損傷等不良反應[7]。尋找優(yōu)于現(xiàn)階段治療的方案，提高鼻咽癌治療的安全性及有效性是臨床亟待解決的問題。

中醫(yī)耳鼻咽喉科臨床常見慢性疾病皆可追溯到脾虛的病機基礎。其病機大體為肺脾氣虛，無力托邪，外邪入里而為病。參苓白術散是中醫(yī)耳鼻咽喉科常用方劑，為健脾祛濕的代表方之一，藥理學研究表明其具有良好的免疫調節(jié)效應及抗炎作用[8-10]。近年來，課題組在臨床中發(fā)現(xiàn)參苓白術散對鼻咽癌防治具有較好效果，但其具體分子機制尚不明確。目前，參苓白術散防治鼻咽癌的相關研究較少。本研究利用GEO基因芯片結合網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術對參苓白術散君藥人參-茯苓-白術配伍防治鼻咽癌的分子機制進行探討，并通過CCK-8法及Western blot實驗進行驗證，以此推測參苓白術散在鼻咽癌防治過程中的作用，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 鼻咽癌靶點獲取

以“Nasopharyngeal carcinoma”為關鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲得正常人群與鼻咽癌患者的高通量測序數(shù)據(jù)集。通過R語言軟件進行分析篩選，以|logFC|>1且Padj<0.05為條件篩選差異表達基因，繪制火山圖和熱圖。

1.2 人參-茯苓-白術配伍化學成分篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索人參、茯苓、白術的化學成分，以毒藥物動力學（ADME）[11]標準口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件，對3種中藥的化學成分進行篩選，得到人參-茯苓-白術配伍有效成分。

1.3 有效成分靶點獲取

使用TCMSP檢索人參-茯苓-白術有效成分相關靶點基因，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）對靶點名稱進行標準化處理。

1.4 化合物-交集靶點網(wǎng)絡及蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

利用Perl語言軟件獲得人參-茯苓-白術有效成分靶點基因與鼻咽癌差異表達基因的交集靶點，導入Cytoscape3.8.2軟件構建化合物-交集靶點網(wǎng)絡。并將其導入STRING11.0（https://string-db.org），得到蛋白相互作用網(wǎng)絡，以大于中位值為標準篩選核心作用靶點。

1.5 GO及KEGG通路富集分析

運用R 語言軟件ggplot2、clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db 包對交集靶點進行GO 和KEGG通路富集分析，得到人參-茯苓-白術配伍作用于鼻咽癌的主要通路，并對結果進行可視化處理。

1.6 交集靶點-KEGG關系網(wǎng)絡構建

將人參-茯苓-白術配伍作用于鼻咽癌的主要通路與對應交集靶點文件導入Cytoscape3.8.2軟件構建交集靶點-KEGG關系網(wǎng)絡并進行分析。

1.7 分子對接驗證

通過UniProt 數(shù)據(jù)庫搜索鼻咽癌靶點蛋白，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白質晶體結構，在PubChem資源庫下載中藥有效成分2D結構，利用Chem3D軟件進行能量最小化處理，使用Sybyl軟件進行分子對接。

1.8 體外實驗驗證

1.8.1 細胞株

人鼻咽癌細胞5-8F（低分化，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院），經(jīng)本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.8.2 試劑與儀器

PLAU，武漢三鷹公司，批號17968-1-AP；環(huán)加氧酶2（COX2），美國CST公司，批號12282T；c-JUN，CST公司，批號9165T；β-谷甾醇、蘇齊內酯、豆甾醇、花生四烯酸，上海源葉生物科技有限公司，批號分別為B21972-20mg、B51017-5mg、B20314-20mg、B20540-20mg。NU-5810E型CO2培養(yǎng)箱，美國Forma公司；JY-600HE電泳儀、JY-ZY5電泳槽、JY-SCZ2+轉印槽，北京君意東方電泳設備有限公司；Microfuge 20R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；MS105 DU電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；BWS-27恒溫水浴箱，美國Pharmacia公司；AE2000倒置顯微鏡，日本Olympus公司；ELX800酶標儀，美國Bio-Tek公司；DW-HL388超低溫冰箱，美國Fisher公司；SJ-CJ-2FD單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；select渦旋振蕩器，美國SBP公司。

1.8.3 CCK-8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的5-8F人鼻咽癌細胞，種入96孔板（每100 μL培養(yǎng)液中5×103個細胞），待細胞貼壁，每孔分別加入不同濃度的200 μL含藥培養(yǎng)液，實驗組分別使用5、10、20、40、80 μmol/L花生四烯酸、蘇齊內酯、豆甾醇及β-谷甾醇。設定空白孔（只加細胞培養(yǎng)液、不加5-8F細胞）用于吸光度（A值）校正。待藥物作用24、36、48 h后，將現(xiàn)配的CCK-8溶液100 μL分別加入包括空白孔的所有孔內，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。實驗重復3次。于酶標儀波長450 nm處檢測A值，計算細胞相對增殖率[（實驗組A值-空白組A值）÷（對照組A值-空白組A值）×100%]。

1.8.4 Western blot檢測蛋白表達

取對數(shù)生長期5-8F人鼻咽癌細胞，接種至培養(yǎng)皿，待細胞貼壁，設置溶劑對照組，并加入不同濃度含藥培養(yǎng)基（20、40 μmol/L花生四烯酸、蘇齊內酯、豆甾醇及β-谷甾醇）藥物干預36 h后，提取總蛋白，參考胡晶等[12]方法進行蛋白定量、電泳、轉膜、掃膜，并分析信號值，分別監(jiān)測分子對接所對應的靶點蛋白（PTGS2、PLAU、JUN）。實驗重復3次。

1.8.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，以表示，多組間比較和單因素設計采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌差異表達基因

通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫，確定GPL6480數(shù)據(jù)集，該芯片數(shù)據(jù)集收集了18個正常人群鼻咽組織和18個原發(fā)鼻咽癌原發(fā)組織的基因表達譜。使用R語言軟件下載并分析原始數(shù)據(jù)，以Padj<0.05且|logFC|>1為條件進行差異分析后獲得2 078個鼻咽癌差異表達基因，其中包含1 214個下調基因和864個上調基因，利用R語言繪制火山圖，見圖1。選取20個上調基因及20個下調基因繪制熱圖，見圖2。

圖1 鼻咽癌GPL6480數(shù)據(jù)集差異表達基因火山圖

圖2 鼻咽癌GPL6480數(shù)據(jù)集差異表達基因FC分析熱圖

2.2 人參-茯苓-白術有效成分

利用TCMSP平臺檢索人參、茯苓、白術的主要化學成分，以OB≥30%和DL≥0.18為條件篩選出有效化學成分共44種，其中人參22種、白術7種、茯苓15種，見表1。

表1 人參-茯苓-白術有效成分信息

2.3 化合物-交集靶點網(wǎng)絡

應用Perl語言分析獲得鼻咽癌差異表達基因與人參-茯苓-白術對應靶點基因的交集靶點共21個，與交集靶點相互作用的有效化合物共23個。以交集靶點與有效化合物數(shù)據(jù)構建化合物-交集靶點網(wǎng)絡，見圖3。該網(wǎng)絡共有44個節(jié)點和50條邊。人參、茯苓、白術中多個有效化合物可對應相同的靶點，而不同靶點也可對應同一有效化合物，表明人參-茯苓-白術配伍多成分、多靶點作用于鼻咽癌的特點。

圖3 人參-茯苓-白術治療鼻咽癌化合物-交集靶點網(wǎng)絡

2.4 交集靶點蛋白相互作用分析

將21個交集靶點導入STRING平臺，設置置信度>0.150，剔除沒有相互關系的靶點，得到圖4A。設置置信度>0.400，提取圖4A 中關聯(lián)更緊密的網(wǎng)絡，得到圖4B。將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.8.2，利用cytoNCA插件及R語言，以大于中位值為條件篩選核心基因，得到圖4C，提取核心基因，生成網(wǎng)絡，見圖4D。分析得到JUN、IL1B、PLAU、STAT1、PTGS2 共5 個核心靶點，可認為這些靶點在網(wǎng)絡中起重要作用。

圖4 人參-茯苓-白術治療鼻咽癌交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

2.5 GO及KEGG通路富集分析

對交集靶點進行GO和KEGG通路富集分析。以Padj<0.05為標準分別確定前15個生物過程（BP）、分子功能（CC）、細胞成分（MF）的GO條目，見圖5。可以看出，相關性最大的生物過程有活性氧生物合成過程、一氧化氮生物合成過程、一氧化氮代謝過程、活性氮類代謝過程等，分子功能有類固醇結合、絲氨酸型內肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性等，細胞成分有細胞器外膜等。交集靶點KEGG通路富集分析見圖6，主要涉及腫瘤、代謝、免疫、炎癥等方面信號轉導。

圖5 人參-茯苓-白術治療鼻咽癌交集靶點GO功能富集分析

圖6 人參-茯苓-白術治療鼻咽癌交集靶點KEGG通路富集分析

2.6 交集靶點-KEGG關系網(wǎng)絡

將人參-茯苓-白術配伍治療鼻咽癌涉及的主要通路與對應交集靶點導入Cytoscape3.8.2軟件構建交集靶點-KEGG關系網(wǎng)絡（見圖7）。該網(wǎng)絡有41個節(jié)點（21個交集靶點節(jié)點和20個通路節(jié)點）和77條邊?？梢钥闯觯琁L1B、JUN 基因及Leishmaniasis 信號通路（hsa05140）、Rheumatoid arthritis 信號通路（hsa05323）、IL-17信號通路（hsa04657）、Fluid shear stress and atherosclerosis信號通路（hsa05418）在該網(wǎng)絡中起到核心調控作用。

圖7 人參-茯苓-白術治療鼻咽癌交集靶點-KEGG關系網(wǎng)絡

2.7 分子對接

將鼻咽癌靶點蛋白導入Sybyl軟件，加氫并修復側鏈后基于Ligand（配體）模式（未發(fā)現(xiàn)配體的使用automatic 模式）產生活性口袋，以SFXC 格式保存，其他參數(shù)均設為默認值。將已進行能量優(yōu)化的人參-茯苓-白術有效化合物導入軟件，依次與相應的靶點蛋白進行對接，對接結果根據(jù)Total-Score 進行評價，以Total-Score>5為閾值，該值越大，表明配合作用越好。對接結果見表2，對接模式見圖8。

表2 人參-茯苓-白術有效成分與靶點蛋白分子對接結果

圖8 人參-茯苓-白術有效成分與靶點蛋白分子對接模式

2.8 體外實驗結果

2.8.1 CCK-8法檢測細胞增殖

藥物干預24、36、48 h，與對照組比較，不同濃度花生四烯酸、蘇齊內酯、豆甾醇、β-谷甾醇均可抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖（P<0.05，P<0.01），見圖9。

圖9 人參-茯苓-白術有效成分對5-8F細胞增殖的抑制作用

2.8.2 Western blot檢測蛋白表達

根據(jù)分子對接結果，花生四烯酸與PTGS2、蘇齊內酯與PTGS2、豆甾醇與PLAU、β-谷甾醇與JUN配合效果好。Western blot結果顯示，與對照組比較，花生四烯酸組和蘇齊內酯組PTGS2表達降低（P<0.05，P<0.01），豆甾醇組PLAU表達降低（P<0.01），β-谷甾醇組c-JUN表達降低（P<0.01）。見圖10。

圖10 人參-茯苓-白術治療鼻咽癌有效化合物對靶點蛋白表達的影響

3 討論

鼻咽癌屬中醫(yī)學“上石疽”“失榮”“真頭痛”等范疇，現(xiàn)代亦稱為“頏顙巖”，多為正氣虧虛，氣虛染毒所致。脾為氣血生化之源，脾氣健則氣血生化有源，正氣足則外毒無以入侵。參苓白術散以人參、茯苓、白術為君藥，方中人參大補脾胃之氣，并鼓動全身正氣，白術、茯苓健脾滲濕，脾氣健而氣血生化有源。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫得到2 078個鼻咽癌差異表達基因。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得人參-茯苓-白術44種有效化學成分，二者交集靶點21個，包括PTGS2等5 個核心靶點。對核心靶點進行蛋白相互作用分析、GO和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)主要通過活性氧及一氧化氮生物合成過程、類固醇結合等生物過程，及代謝、炎癥等通路發(fā)揮作用。

研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸可通過抑制代謝產物的生成途徑抑制促炎癥因子的表達，起到保護血管內皮和抗炎的作用[13]；另外，花生四烯酸及其代謝產物在腫瘤細胞增殖和轉移、凋亡、血管新生和炎癥反應及其治療和預后方面具有重要作用[14]。體外實驗表明，豆甾醇能抑制肝癌、胃癌、皮膚癌等多種腫瘤細胞生長，其機制主要涉及上調凋亡基因表達，誘導細胞周期阻滯、破壞腫瘤血管的生成等[15]。β-谷甾醇能通過多種細胞信號途徑抑制多種癌癥如乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、肺癌、胃癌等的發(fā)生與發(fā)展[16]。

PTGS2是合成前列腺素的關鍵酶，即COX-2，可將花生四烯酸轉化為PGH2進而導致炎癥[17]。COX-2高表達可見于許多腫瘤，能誘導致癌物的活化，促進腫瘤血管生成、腫瘤浸潤和轉移，影響細胞周期變化，促進細胞增殖，抑制凋亡，并可能降低腫瘤細胞對放療及化療的敏感性[18-23]。朱德為等[24]對79例鼻咽癌患者的鼻咽組織進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)COX-2總陽性率達63.3%。朱洪海等[25]研究104例鼻咽癌患者，發(fā)現(xiàn)COX-2在有淋巴結轉移的患者比例更高，提示COX-2可能與鼻咽癌的復發(fā)及遠處轉移相關。

綜上所述，人參-茯苓-白術治療鼻咽癌可從多成分、多靶點、多通路對疾病發(fā)展進行調控。本研究以參苓白術散的臨床功效為基礎，選取其君藥進行分析?；谏鲜鼋Y果，后續(xù)可從以下幾方面進行探索：圍繞參苓白術散復方開展“病-證-方”關聯(lián)網(wǎng)絡研究，在臨床實踐基礎上構建“鼻咽癌-脾虛濕盛證-參苓白術散”模型，開展更廣泛的臨床及基礎研究，為鼻咽癌的臨床治療提供新思路；對參苓白術散的核心成分如花生四烯酸、豆甾醇和β-谷甾醇等展開更多基礎研究，如拆方驗證、血清藥理學和動物細胞模型驗證等；進一步探索PTGS2與鼻咽癌的相關性。本研究尚存在一定局限性：研究局限于參苓白術散君藥，未納入其他藥物；中藥復方成分復雜，活性成分之間的相互作用、各靶點的調控強度等因素未能納入計算。