王夢珂，王夢偉，陳天朝，2

1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》，其味苦、性微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效[1]，丹參含有水溶性成分（丹酚酸A、丹參莖葉總酚酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素等）、脂溶性成分（丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、甲基丹參酮等），其中以丹參脂溶性成分為代表的主要有隱丹參酮、丹參酮ⅡA等，水溶性成分為原兒茶醛、丹酚酸B等[2]。有研究表明，以脂溶性成分丹參酮ⅡA為代表的丹參酮類成分對舒張血管、抗食道癌、抗炎、抗纖維化等方面有一定的藥理作用[3-5]。隱丹參酮具有良好的抗乳腺癌、抗胃癌作用，毒副作用較小[6]。丹參經炮制后其內在成分與物性指標發(fā)生一定的變化[7]，主要變化為外觀的形、色、氣、味、質[8]。丹參常見的炮制方法有酒炙、醋炙、鹽水炒、炒、米炒、炒炭及豬血制等[9]，最常見的是酒、醋、鹽炙等。經課題組前期研究，選擇具有代表性3種輔料酒、醋、鹽，對其進行炮制研究。目前，中藥飲片及制劑的質量控制大多關注化學成分含量及反映整體化學組成的色譜指紋圖譜，鮮有關注其物理屬性[10-11]?；瘜W成分研究雖多，但評價指標較為單一，未能較全面反映飲片質量。

飲片的化學成分和物理屬性共同影響著中藥質量，中藥飲片的質量控制需要綜合研究物理屬性與化學屬性以及2類指標之間的相關性[12]。本試驗從整體觀念出發(fā)，對丹參的固有屬性即物性指標和化學成分進行綜合考察[13]，在研究多指標成分含量變化時，需確定內在成分指標的權重，采用主觀賦權的層次分析法（AHP）和客觀賦權的CRITIC法相結合對化學成分進行綜合評分，以得到更具穩(wěn)定性、可靠性的權重[14-15]。以物性指標（相對密度、pH值、吸水膨脹度、氧化值）與總黃酮、脂溶性成分丹參酮ⅡA和隱丹參酮的客觀指標綜合性評價酒醋鹽炙丹參物性指標與脂溶性成分的相關性，以及不同炮制方法對丹參飲片的影響，為丹參炮制品飲片質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

UliMate3000 高效液相色譜儀（賽默飛公司），Thermo Evolution 201紫外可見光分光光度計（美國賽默飛），HK250科導臺式超聲波清洗儀器（上海漢克科學儀器有限公司），膨脹度測定管（鄭州市金水區(qū)潤華化玻儀器供應站），pFS-200p手壓封口機（溫州華珍機械有限公司），pHS-3C數字酸度計（上海雷磁儀器廠）。

丹參及酒、醋、鹽丹參飲片，安徽普仁中藥飲片有限公司，批號1804211，經河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院施鈞瀚主任藥師鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥塊根及炮制加工品；對照品丹參酮ⅡA（批號Y20J8C40264，純度≥98%）、隱丹參酮（批號H1208X45502，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；蘆丁對照品（批號WDM3-201811，純度≥98%），中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 供試品溶液制備

精確稱取丹參及酒、醋、鹽丹參細粉（過4號篩）2.0 g，置150 mL錐形瓶中，加70%甲醇60 mL，超聲（頻率50 kHz，功率250 W）處理50 min，提取45 min，重復2次。提取合并濾液，過濾，濃縮，加70%甲醇定容至25 mL容量瓶。吸取1 mL稀釋后樣液，置25 mL容量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取130 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加70%甲醇適量，水浴上微熱溶解，放冷，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 檢測波長確定

取2 mL蘆丁對照品溶液，進行顯色處理，靜置15 min，于400～800 nm可見光波長范圍內進行掃描。結果在波長508 nm處有特征吸收峰，故確定508 nm為檢測波長。

2.1.4 線性關系考察

精密吸取對照品溶液，進行顯色處理。于波長508 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=16.554X-0.024 9（r=0.999 1），表明蘆丁在0.012～0.036 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗

精密吸取蘆丁對照品溶液2.0 mL，按“2.1.3”項下方法，于波長508 nm處連續(xù)測定6次，計算RSD值，得RSD=0.28%，表明該儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液2.0 mL，按“2.1.3”項下方法，分別在10、20、30、40、50、60 min于波長508 nm處測定吸光度，計算RSD，得RSD=0.32%，表明該供試品在60 min內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗

精密稱取丹參細粉6份，按“2.1.1”項下方法平行處理，按“2.1.3”項下方法，于508 nm波長處測定，計算RSD，得RSD=0.46%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 樣品測定

丹參及酒、醋、鹽丹參的總黃酮含量依次為3.93、4.02、4.40、3.37 mg/g。

2.2 丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量測定

2.2.1 色譜條件

采用Agilent 反向色譜柱HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸水（85∶15，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長270 nm，進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 酒醋鹽炙丹參的丹參酮ⅡA和隱丹參酮HPLC圖

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取丹參酮ⅡA 0.35 mg、隱丹參酮0.5 mg，置25 mL容量瓶中，以流動相定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱取丹參及酒、醋、鹽丹參細粉1.00 g，加入流動相20 mL，超聲（頻率50 kHz，功率250 W）處理30 min，冷卻至室溫。稱定質量，用純水補足減失的質量，過0.45 μm針式微孔濾膜，即得。

2.2.4 線性關系考察

吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用甲醇配成丹參酮ⅡA 濃度為0.35、0.7、1.4、2.8、4.2、7.0、8.4 μg/mL，隱丹參酮濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、12.0 μg/mL的對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件下分別進樣測定，以峰面積為縱坐標，對照品濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。丹參酮ⅡA為：Y=1.406 4X+0.076 9（r=1），表明丹參酮ⅡA在0.35～8.40 μg/mL范圍內線性關系良好；隱丹參酮為：Y=1.111 6X+3.503（r=0.999 9），表明隱丹參酮在0.50～12.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取隱丹參酮、丹參酮ⅡA的混合對照品溶液，重復進樣6次，分別記錄隱丹參酮和丹參酮ⅡA峰面積，計算RSD。計算得隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為0.079%、0.12%，表明儀器精度性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項下方法連續(xù)測定，記錄峰面積，計算RSD。結果隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD分別為0.046%、0.09%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗

精密稱取丹參粉末（過4號篩）6份，按“2.2.3”項下方法制備得供試品溶液，并按“2.2.1”項下方法連續(xù)測定，分別記錄隱丹參酮和丹參酮ⅡA峰面積，計算隱丹參酮、丹參酮ⅡA 質量分數的RSD 分別為1.57%、3.42%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密稱取0.5 g丹參粉末6份，分別置于具塞錐形瓶中，加入40 μg/mL隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品溶液1 mL，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，隱丹參酮、丹參酮ⅡA的平均回收率為96.66%、97.06%，RSD 分別為0.55%、0.92%。

2.2.9 樣品含量測定

取丹參及酒、醋、鹽丹參粉末1 g，按“2.2.3”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定，每批樣品平行測定3次，取平均值。丹參及酒、醋、鹽丹參的丹參酮ⅡA 含量依次為384.76、389.48、395.19、382.66 μg/g；丹參及酒、醋、鹽丹參的隱丹參酮含量依次為241.5、245.84、249.24、230.77 μg/g。

2.3 物性指標測定

2.3.1 吸水膨脹度

分別稱取丹參及酒、醋、鹽丹參5.0 g，用量筒量取100 mL蒸餾水，各飲片分別與蒸餾水共置于50 mL錐形瓶中，分別于0、5、10、20、40 min及1、2、4、8、16、24 h，過濾出飲片，將錐形瓶中液體倒進量筒中讀取體積，記錄數據。選擇上述飲片吸水飽和時對應時間，浸泡中藥飲片，記錄排開水體積差值，根據公式膨脹度（S）=膨脹后體積（V）÷飲片質量（W）計算各飲片膨脹度，平行測定3份，取平均值。

2.3.2 pH值

準確稱取丹參及酒、醋、鹽丹參約5.0 g，置于100 mL純化水中，室溫浸泡2 h，過濾并取濾液，用酸度計測定，記錄相同溫度的飲片pH值。

2.3.3 相對密度

稱量丹參及酒、醋、鹽丹參5.0 g，緩慢放入盛有50 mL液體石蠟的100 mL精密量筒中，待液體石蠟氣泡排出完畢凹液面穩(wěn)定時記錄體積。相對密度（g/mL）=飲片質量（g）÷飲片體積（mL）。

2.3.4 氧化值

準確稱取丹參及酒、醋、鹽丹參約5.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加水200 mL，混勻后蒸餾，精確收集前50 mL餾分。精密稱取0.158 g的KMnO4，加純水溶解并定容于500 mL 容量瓶內，配制成濃度為0.002 mol/L的KMnO4溶液，轉移至棕色試劑瓶內保存?zhèn)溆?。精密稱取3.16 g的Na2S2O3，純水溶解并定容于1 000 mL 容量瓶中，配制成濃度為0.02 mol/L 的Na2S2O3溶液，轉移至棕色試劑瓶內，緩緩煮沸10 min，冷卻，放置兩周后濾過備用。取丹參不同炮制品飲片，用移液管準確量取5 mL餾分于滴定瓶內，加入H2SO4水溶液（硫酸∶水=1∶4）和KMnO4溶液，振蕩均勻，室溫下靜置30 min，然后加入KI溶液，用Na2S2O3溶液進行滴定，當溶液由深黃色變成淺黃色時，加入淀粉指示劑1 mL，繼續(xù)滴定，當顏色變?yōu)闊o色時，記錄消耗的Na2S2O3溶液體積（A），空白試驗用等量水重復以上操作，記錄消耗Na2S2O3溶液體積（B），計算氧化值（Ox）。Ox=（B-A）×C×200/（5×0.002×V×M）。式中，OX即餾分消耗的KMnO4體積（mL/g），C 為Na2S2O3溶液濃度（mol/L），V 為餾分取樣量（mL），Na2S2O3與KMnO4反應摩爾當量比為5，KMnO4溶液濃度0.002 mol/L，樣品體積為200 mL，M為取樣量。

2.3.5 樣品測定

取丹參及酒、醋、鹽丹參樣品，測定吸水膨脹度、pH值、相對密度及氧化值，結果見表1。

表1 丹參及酒、醋、鹽丹參物性指標測定結果

2.4 主客觀方法相結合確定各指標權重

2.4.1 層次分析法

AHP是一種定性和定量相結合、系統(tǒng)化和層次化的分析方法，根據丹參中各指標成分的含量及藥理活性，將指標成分含量作為權重予以量化，確定各指標的優(yōu)先順序為丹參酮ⅡA>隱丹參酮>總黃酮，構建各指標成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，判斷矩陣評分情況見表2。

表2 各評價指標成對比較的優(yōu)先判斷矩陣及權重系數

①計算判斷矩陣的最大特征根（λmax）：λmax=。式中，λmax為判斷矩陣的最大特征根，X為經過歸一化后的判斷矩陣，ωi為第i項指標的權重系數，n為樣本量。②對判斷矩陣進行一致性檢驗：CI=，CR=CI/RI。CI為一致性指標，RI為隨機一致性0.52，CR表示對判斷矩陣進行一致性檢驗。③通過對矩陣進行歸一化處理計算出權重系數，分別為0.500 0、0.333 3、0.166 7，一致性比率因子CR為0，一致性檢驗通過，即指標優(yōu)化比較矩陣通過一致性檢驗，表明各評價指標權重系數有效。

2.4.2 CRITIC法

丹參中總黃酮、丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量為指標含量越高越好。對于第i個個體，第j個指標越高越好，適用于公式：dij=。式中，dij表示數據的標準化，fij表示第i個個體的第j項指標。

用無量綱化處理的標準數據進行標準差分析計算對比強度：Si=。式中，zij為無量綱處理后的樣本指標值，為第i個指標的樣本均值，m為指標個數，n為樣本個數。經計算S總黃酮=0.425，S丹參酮IIA=5.565，S隱丹參酮=8.030。

用處理后的標準化數據計算沖突性：Cj=，Wj=。式中δi為標準化之后各列指標的標準差，Cj表示第j評價指標所包含的信息量，Wj表示第j個指標的客觀權重。

經計算得出總黃酮、丹參酮IIA、隱丹參酮的權重系數（ωi）為0.020 5、0.497 8、0.481 7。

2.4.3 AHP-CRITIC法綜合權重的確定

AHP側重于決策者的主觀愛好，而CRITIC法側重于挖掘數據本身所蘊含的客觀信息，因此，將主觀權重與客觀權重綜合考慮，將2種方法相結合能更加合理地計算出綜合權重（ω綜合ij），經計算AHP-CRITIC法結合的綜合權重為0.040 0、0.646 9、0.313 1。

2.4.4 3種權重分析方法計算的綜合評分結果比較

選用上述3種權重系數分別對試驗數據進行綜合評分。采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件對3種評分結果進行相關系數分析，AHP 與AHP-CRITIC 法評分相關系數為0.990，CRITIC 法與AHP-CRITIC 法評分相關系數為0.998，AHP與CRITIC法評分相關系數為0.991，三者相關性極顯著（P<0.01）。AHP與CRITIC法權重系數的相關系數為0.851，相關性不顯著（P=0.352），表明這2種方法所反映的信息疊加性不強，AHP-CRITIC法平衡了主觀因素和客觀因素的影響，所體現的信息更為合理，故選擇AHP-CRITIC 法進行綜合權重評分（Y）。

2.4.5 用原始數據計算綜合評分

采取以下公式計算綜合評分Y，公式中Y和“2.4.2”項下f值相同，均為未標準化處理前原始測量數據。當指標數值越大越好時：Y=（yi/ymax）×100ω；當指標數值越小越好時：Y=（ymin/yi）×100ω。經計算，丹參及酒、醋、鹽丹參綜合評分值依次為96.893 4、98.293 0、100.000 0、94.693 0。

2.5 物性指標與化學成分相關性分析

采用SPSS軟件對丹參不同炮制品物性指標與化學成分進行Pearson相關性分析，結果見表3。通過分析相關性可知，丹參炮制品物性指標pH值與化學成分丹參酮ⅡA呈負相關（P<0.05）。

表3 丹參物性指標與化學成分的相關性分析（r）

2.5.1 pH值與丹參酮ⅡA含量回歸分析

以pH值為因變量、丹參酮ⅡA含量為自變量，得線性回歸方程Y=56.381-0.129X，R2=0.939，P<0.05。以丹參酮ⅡA含量為因變量、pH值為自變量，得線性回歸方程Y=432.511-7.249X，R2=0.939，P<0.05。表明2個模型均有統(tǒng)計學意義，方差分析見表4、表5。

表4 pH值對丹參酮ⅡA含量回歸模型方差分析

表5 丹參酮ⅡA含量對pH值回歸模型方差分析

2.5.2 綜合評分與pH值相關性分析

建立綜合評分與pH值的多元線性回歸方程：Y=113.531-2.617X，R2=0.751，P<0.05，表明該模型有統(tǒng)計學意義。綜合評分與物性指標pH值呈顯著負相關。

3 討論

中藥成分復雜，具有多成分、多靶點、多層次的作用特點，檢測其中1種指標無法代表中藥的整體療效，因此，采用多指標綜合評價有利于控制中藥飲片的質量，對于丹參的內在質量評價指標選取應多元化與綜合化，化學成分研究也應注重整體性[15]。丹參具有廣闊的市場前景和發(fā)展?jié)摿?，但目前對丹參的臨床應用主要集中在治療心腦血管疾病方面，以活血功效為主[16]。有研究表明，總黃酮具有抑菌、抗炎、活血化瘀作用，能夠促進傷口的愈合；丹參酮ⅡA具有治療心血管疾病、改善冠狀動脈血循環(huán)、抗動脈粥樣硬化等作用[2]；隱丹參酮具有抗氧化、抗衰老作用，對治療冠心病、心絞痛、心肌損害有一定的療效[5]。本試驗選取2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的其中2個化學成分及具有顯著活性的總黃酮，探討其與物性指標之間的相關性，為完善丹參多層次的質量標準提供依據。

中藥的化學組成和物性指標共同影響著中藥質量，為提升中藥飲片的質量控制，需要綜合研究物理屬性與化學屬性，以及2類指標之間的相關性[16]。目前，我國中藥飲片的質量評價標準主要由外觀性狀和內在質量等因素綜合確定。即從形、色、氣、味、質等方面來鑒別分析藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，雖簡便易行，但易受到人的感官因素及檢測環(huán)境等影響，客觀性和一致性難以保證[12]。中藥質地可由淀粉、多糖類物料經加熱炮制后，影響其比例，進而表現為飲片質地變化，即相對密度發(fā)生改變；pH 值的變化以指示飲片酸堿變化[12]；飲片形狀大小和粒徑的變化會導致吸水率發(fā)生改變[17]；氧化值的變化能表征中藥酸敗度及氣味變化[12]，對于中藥炮制學科而言意義重大。炮制過程是物理性質和化學性質發(fā)生變化的過程，經炮制后，炙法炮制過程對中藥成分影響較大的Maillard反應能引起連鎖性氧化還原反應并使其具有焦香氣味[18]，伴隨著pH值及氧化值等物性指標的變化，以相對密度、吸水膨脹度、氧化值、pH值對飲片及炮制前后的傳統(tǒng)經驗術語評價量化，探索物性指標與化學成分性質之間的相關性，可為中藥質量控制提供更全面指導[7，19-21]。

在多指標綜合評價中，確定各評價指標的權重系數是首先需要考慮的問題。實驗采用主觀賦權的AHP與客觀賦權的CRITIC法相結合，對各評價指標進行綜合權重分析，既能避免AHP 的主觀意識，也能避免CRITIC法對指標間關系的忽視[21]，將主客觀2種方法結合，能夠體現數據信息的科學性，可保證數據點均勻分散、結果客觀、穩(wěn)定，并全面、客觀地反映實驗結果的真實性和準確性，為中藥質量評價標準提供參考[22]。

近年來課題組提出中藥物性指標概念，將中藥本身固有屬性作為基點，把物性指標-化學成分作為一個評價中藥質量的整體，其中物性指標可用相對密度、pH值、氧化值及吸水率等參數表征，適用于中藥質量控制與評價[23]。經前期文獻研究，本試驗從化學成分和物性指標進行綜合考察，以丹參酒醋鹽炙法炮制品為研究對象，采用化學成分總黃酮、丹參酮ⅡA和隱丹參酮與物性指標吸水膨脹度、相對密度、pH值、氧化值的客觀指標綜合性評價酒醋鹽炙法炮制對丹參飲片影響，對中藥物性指標及成分進行含量測定，運用AHP-CRITIC 法結合SPSS 軟件對數據進行統(tǒng)計分析，經相關性分析，丹參pH 值與丹參酮ⅡA呈顯著負相關關系，在一定程度上可建立pH值與丹參酮ⅡA的數學模型，用以指征丹參酮ⅡA的含量高低。建立丹參物性指標-化學成分之間的相關性聯(lián)系，詮釋飲片炙法炮制的動態(tài)變化過程，探究酒醋鹽炙法炮制對丹參飲片影響，為實現飲片的臨床開發(fā)應用及炙法炮制工藝的智能化、標準化、數字化研究提供參考。本研究模型的準確性尚需后期擴大樣品量進一步研究。