高薇，王佳勇

海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院，上海200433

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，5年生存率低于15%，其中80%～85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]。盡管NSCLC早期檢測和系統(tǒng)治療取得一些進展，但患者預后仍較差[2]。NSCLC化療藥物存在耐藥性、療效不理想、價格昂貴等局限性。因此，亟需新的安全有效治療策略[3]。越來越多證據(jù)表明，中藥可降低化療和放療毒性，減輕癌癥癥狀，提高患者生存率[4]。順鉑是常用的化療藥物，但由于耐藥性問題，常使細胞對順鉑的敏感性降低，從而降低化療效果。

柴胡皂苷A是從柴胡中提取的一種三萜皂苷[5]，具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]等多種藥理活性。柴胡皂苷A可通過上調(diào)細胞自噬水平抑制Huh-7細胞增殖，發(fā)揮抗肝癌作用[9]；通過抑制ERK蛋白磷酸化促進鼻咽癌細胞凋亡，發(fā)揮抗鼻咽癌作用[10]；通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路提高人肺腺癌順鉑耐藥性細胞（A549/DDP）對順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞順鉑耐藥性[11]?；诖?，本研究探究柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對人肺腺癌A549細胞的影響及可能的作用機制，為NSCLC的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞

柴胡皂苷A（批號149158，純度≥98%）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（Fer-1，批號119396，純度≥98%）上海陶術生物科技有限公司。A549細胞株，購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（貨號8118031），美國Gibco 公司；胎牛血清（FBS，貨號SV30087.02），美國HyClone 公司；ECL 發(fā)光液（貨號WP20005）、BCA蛋白定量試劑盒（貨號23225）、C11-BODIPY熒光探針（貨號D3861），美國Thermo公司；FeRhonox-1亞鐵離子熒光探針（貨號GC901），日本Goryo Chemical公司；PVDF 膜（貨號IPVH00010），美國Millipore；CCK8（貨號C0038）、DCFH-DA 熒光探針（貨號MB4682），大連美侖生物；溶質(zhì)載體家族7 成員11（SLC7A11）抗體（貨號ab175186）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（貨號ab125066）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）抗體（貨號ab214039）、溶質(zhì)載體家族40成員1（SLC40A1）抗體（貨號ab239538）、核因子E2相關因子2（Nrf2）抗體（貨號ab62352）、血紅素加氧酶（HO-1）抗體（貨號ab52947）、β-actin 抗體（貨號ab8226）、HRP標記二抗（貨號ab150077），英國Abcam公司。SpectraMax iD3多模式酶標儀（澳大利亞SpectraMax），F(xiàn)ACS Calibur 流式細胞儀（美國Becton Dickinson），1300 SERIES A2 CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific），Mini-PROTEAN Tetra System電泳系統(tǒng)、ChemiDoc MP Imaging System凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.3 細胞培養(yǎng)

A549 細胞用DMEM 完全培養(yǎng)基（含10% FBS、1%雙抗），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4 柴胡皂苷A和順鉑濃度篩選

將A549細胞以6×103個/孔接種于96孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將細胞分為對照組和藥物組，每組3個復孔，對照組加入空白培養(yǎng)基，藥物組分別以終濃度為3.25、7.5、15、30、60、120、240、480 μmol/L柴胡皂苷A 或0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L順鉑處理細胞24 h，同時設置只加培養(yǎng)基的空白孔調(diào)零。每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀波長450 nm處測定各孔吸光度（A），計算細胞存活率[（A藥物-A空白）/（A對照-A空白）×100%]，并用GraphPad軟件計算藥物IC50。

將細胞分為對照組、順鉑組、柴胡皂苷A組及聯(lián)用組，按以上方法培養(yǎng)，根據(jù)篩選出的IC50分別處理細胞，測定各孔吸光度，計算細胞存活率及抑制率（100%-存活率）。采用協(xié)同指數(shù)q評價2種藥物聯(lián)用的效果[12]。q=EAB/（EA+EB-EA×EB），式中EAB表示A、B兩藥聯(lián)合使用的抑制率，EA、EB表示A、B單用的抑制率，q≤0.85表示兩藥拮抗，0.85

1.5 細胞克隆形成分析

將A549細胞消化成單細胞懸液，以1 000個/孔接種于12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。將細胞分為對照組、順鉑組（5 μmol/L）、柴胡皂苷A組（40 μmol/L）及聯(lián)用組（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L順鉑），分別加入相應藥物，對照組加入空白培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)11 d。PBS洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 洗1 次，1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，PBS洗3次，室溫晾干，顯微鏡下觀察3個視野中的細胞克隆數(shù)量。

1.6 脂質(zhì)過氧化檢測

將A549細胞以1×105個/孔接種于12孔板，待細胞過夜貼壁后，將細胞分為對照組、順鉑組（5 μmol/L）、柴胡皂苷A組（40 μmol/L）及聯(lián)用組（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L順鉑），分別加入相應培養(yǎng)基處理24 h。加入2 μmol/L C11-BODIPY熒光探針，37 ℃避光孵育30 min，共聚焦顯微鏡觀察并拍照，Image J 1.6軟件計算相對熒光強度（實驗組熒光強度/對照組熒光強度）。

1.7 Fe2+含量檢測

將A549細胞以1×105個/孔接種于12孔板，待細胞過夜貼壁后，將細胞分為對照組、順鉑組（5 μmol/L）、柴胡皂苷A組（40 μmol/L）及聯(lián)用組（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L順鉑），分別加入相應培養(yǎng)基處理24 h。加入5 μmol/L FeRhonox-1熒光探針，避光孵育1 h，共聚焦顯微鏡觀察并拍照，Image J1.6軟件計算相對熒光強度。

1.8 谷胱甘肽和乳酸脫氫酶含量檢測

將A549細胞以2.5×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組、順鉑組（5 μmol/L）、柴胡皂苷A組（40 μmol/L）及聯(lián)用組（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L順鉑），分別加入相應培養(yǎng)基處理24 h。收集細胞上清液，按試劑盒說明書檢測乳酸脫氫酶（LDH）含量。加入RIPA裂解液裂解細胞，收集細胞裂解液，按試劑盒說明書檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量。

1.9 RT-PCR檢測

將A549細胞以2.5×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組、順鉑組（5 μmol/L）、柴胡皂苷A組（40 μmol/L）及聯(lián)用組（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L順鉑），分別加入相應培養(yǎng)基處理24 h。收集細胞，根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA，使用Prime ScriptTMRT Master 和TB Green?Premix Ex TaqTM進行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.10 Western blot檢測

將A549細胞以2.5×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組、順鉑組（5 μmol/L）、柴胡皂苷A組（40 μmol/L）及聯(lián)用組（40 μmol/L柴胡皂苷A+5 μmol/L順鉑），分別加入相應培養(yǎng)基處理24 h。加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解15～30 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分離上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入5×loading buffer，100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性，20 μg蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳（80 V、30 min，120 V、1.5 h）后轉(zhuǎn)至PVDF膜（冰浴，200 mA，2 h），加入5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌3次，每次8 min，滴加SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1、Nrf2、HO-1 一抗（均為1∶1 000）及GAPDH 一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次8 min，加入HRP標記二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次8 min。采用ECL顯影液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J 1.6軟件分析蛋白灰度值。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對A549細胞存活率的影響

隨著柴胡皂苷A和順鉑濃度增加，A549細胞存活率呈逐漸降低趨勢，其IC50分別為43.5、5.4 μmol/L，見圖1。故選擇柴胡皂苷A 40 μmol/L、順鉑5 μmol/L進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度柴胡皂苷A和順鉑處理的A549細胞存活率（xˉ±s，n=3）

與對照組比較，順鉑組、柴胡皂苷A組及聯(lián)用組A549細胞存活率顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549 細胞存活率顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見表2。q值計算結(jié)果顯示，柴胡皂苷A（40 μmol/L）與順鉑（5 μmol/L）聯(lián)用具有協(xié)同作用（q=1.21）。

表2 各組A549細胞存活率比較（，%）

表2 各組A549細胞存活率比較（，%）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，##P<0.01

2.2 柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對A549細胞克隆數(shù)目的影響

與對照組比較，順鉑組、柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞克隆數(shù)目顯著減少（P<0.05，P<0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549 細胞克隆數(shù)目顯著減少（P<0.01）。見表3、圖2。

表3 各組A549細胞克隆數(shù)目比較（，個）

表3 各組A549細胞克隆數(shù)目比較（，個）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，##P<0.01

圖2 各組A549細胞克隆形成

2.3 柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對A549細胞脂質(zhì)過氧化水平的影響

與對照組比較，柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞脂質(zhì)過氧化水平顯著升高（P<0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549細胞脂質(zhì)過氧化水平顯著升高（P<0.01）。見表4、圖3。

表4 各組A549細胞脂質(zhì)過氧化水平比較（）

表4 各組A549細胞脂質(zhì)過氧化水平比較（）

注：與對照組比較，**P<0.01；與順鉑組比較，##P<0.01

圖3 各組A549細胞脂質(zhì)過氧化陽性表達（C11-BODIPY探針，×63）

2.4 柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對A549細胞Fe2+含量的影響

與對照組比較，柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞Fe2+含量顯著升高（P<0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549細胞Fe2+含量顯著升高（P<0.05）。見表5、圖4。

表5 各組A549細胞Fe2+含量比較（）

表5 各組A549細胞Fe2+含量比較（）

注：與對照組比較，**P<0.01；與順鉑組比較，#P<0.05

圖4 各組A549細胞Fe2+陽性表達（FeRhonox-1探針，×63）

2.5 柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對A549細胞谷胱甘肽和乳酸脫氫酶含量的影響

與對照組比較，柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞GSH含量顯著減少（P<0.05），細胞上清液LDH含量顯著增加（P<0.05）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549細胞GSH含量顯著減少（P<0.01），細胞上清液LDH含量顯著增加（P<0.01）。結(jié)果見表6。

表6 各組A549細胞GSH和上清液LDH含量比較（）

表6 各組A549細胞GSH和上清液LDH含量比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，##P<0.01

2.6 柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用對A549細胞鐵死亡相關指標表達的影響

PCR 結(jié)果顯示，與對照組比較，柴胡皂苷A 組A549 細胞SLC7A11 和GPX4 mRNA 表達顯著降低（P<0.05），SLC40A1表達顯著升高（P<0.01），聯(lián)用組A549細胞SLC7A11和GPX4 mRNA表達顯著降低（P<0.05）、SLC40A1 和Transferrin mRNA 表達顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549細胞SLC7A11、GPX4、SLC40A1 mRNA 表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），Transferrin mRNA 表達顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表7。

表7 各組A549細胞SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1 mRNA表達比較（）

表7 各組A549細胞SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1 mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，#P<0.05，##P<0.01

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞SLC7A11和GPX4蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），Transferrin和SLC40A1蛋白表達顯著升高（P<0.05，P<0.01），順鉑組A549細胞SLC40A1蛋白表達顯著升高（P<0.01）；與順鉑組比較，柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞SLC7A11和GPX4 蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），Transferrin蛋白表達顯著升高（P<0.01），SLC40A1蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見圖5。

圖5 各組A549細胞SLC7A11、GPX4、Transferrin、SLC40A1蛋白表達比較（，n=3）

2.7 抑制鐵死亡對A549細胞順鉑敏感性的影響

為考察鐵死亡對A549細胞順鉑敏感性的影響，在原有分組基礎上使用鐵死亡抑制劑Fer-1（10 μmol/L）處理細胞2 h，再加入相應藥物培養(yǎng)24 h，分別檢測細胞存活率、脂質(zhì)過氧化水平、Fe2+含量及SLC7A11和GPX4蛋白表達。結(jié)果顯示，F(xiàn)er-1處理后細胞存活率顯著升高（P<0.05），細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平和Fe2+含量降低（P<0.05），鐵死亡相關蛋白SLC7A11和GPX4表達升高。見圖6。

圖6 各組A549細胞存活率、脂質(zhì)過氧化水平、Fe2+含量及鐵死亡相關蛋白表達比較（，n=3）

2.8 柴胡皂苷A 與順鉑聯(lián)用對A549 細胞Nrf2/HO-1通路的影響

與對照組比較，柴胡皂苷A組和聯(lián)用組A549細胞Nrf2 和HO-1 mRNA 及蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）；與順鉑組比較，聯(lián)用組A549 細胞Nrf2 和HO-1 mRNA及蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表8、圖7。這些結(jié)果表明，柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用能夠抑制Nrf2/HO-1通路，破壞細胞抗氧化系統(tǒng)，加強細胞鐵死亡。

表8 各組A549細胞Nrf2、HO-1 mRNA表達比較（）

表8 各組A549細胞Nrf2、HO-1 mRNA表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖7 各組A549細胞Nrf2、HO-1蛋白表達比較（，n=3）

3 討論

本研究使用柴胡皂苷A和與低濃度順鉑同時處理A549細胞，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷A能夠增強A549細胞對順鉑的敏感性，抑制細胞增殖，聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。提示二者聯(lián)合應用能增強順鉑NSCLC抗腫瘤作用，是一種有潛力的治療策略。

鐵死亡是細胞程序性死亡的方式，其特征是鐵代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和活性氧（ROS）積累，細胞破裂引起LDH釋放增多[13]。研究表明，鐵死亡是腫瘤生長的重要調(diào)控因子，主要由SLC7A11和GPX4被抑制引起。GPX4是一種依賴GSH的硒酶，抑制GPX4導致GSH介導的抗氧化活性下降及脂質(zhì)過氧化水平升高，從而引起鐵死亡[14]。SLC7A11是一種胱氨酸-谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體，能將細胞外胱氨酸轉(zhuǎn)運到細胞中，然后將其加工成半胱氨酸，半胱氨酸能參與體內(nèi)多種氧化還原反應，對細胞具有一定保護作用。SLC7A11失活導致細胞內(nèi)半胱氨酸含量降低，進一步導致GSH含量降低，促進細胞鐵死亡。Transferrin主要作用是將Fe2+導入細胞內(nèi)，而SLC40A1負責將Fe2+從細胞內(nèi)運輸?shù)郊毎?，二者對維持細胞內(nèi)Fe2+平衡至關重要。Transferrin表達升高及SLC40A1表達降低導致細胞內(nèi)Fe2+積累，從而促進細胞鐵死亡[15]。誘導鐵死亡可以抑制腫瘤生長，為抗腫瘤治療提供新思路。本研究結(jié)果顯示，與順鉑組比較，柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用能促進A549細胞LDH釋放，進一步表明柴胡皂苷A能增強A549細胞對順鉑的敏感性，此外，還能降低鐵死亡相關SLC7A11、GPX4蛋白和mRNA表達，提高細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，減少細胞內(nèi)GSH 含量，下調(diào)SLC40A1蛋白表達，上調(diào)Transferrin蛋白表達，維持細胞內(nèi)Fe2+含量，促進細胞鐵死亡。

Nrf2/HO-1抗氧化通路在鐵死亡中起重要作用，為避免處于持續(xù)的氧化應激微環(huán)境中，腫瘤細胞可通過中和氧化應激減輕細胞中過氧化脂質(zhì)生成，從而抵抗鐵死亡。Nrf2是抗氧化和解毒的主要調(diào)控因子，被認為是一種細胞保護因子，通過與下游抗氧化反應元件結(jié)合減輕脂質(zhì)過氧化水平，抑制鐵死亡。HO-1受Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2啟動內(nèi)源性抗氧化反應元件，并激活若干下游抗氧化酶（如HO-1）表達，且鐵死亡關鍵因子SLC7A11、GPX4、SLC40A1都受Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑能促進A549細胞HO-1表達，激活Nrf2/HO-1抗氧化通路，而柴胡皂苷A單用及與順鉑聯(lián)用均能降低Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達，提示柴胡皂苷A 能抑制Nrf2 核易位，抑制Nrf2/HO-1通路。這些結(jié)果表明，柴胡皂苷A抑制了順鉑誘導的Nrf2/HO-1通路激活，進而促進過氧化脂質(zhì)生成，進一步促進鐵死亡。

綜上所述，柴胡皂苷A與順鉑聯(lián)用能誘導A549細胞鐵死亡，其機制可能與破壞細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，提高細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平及Fe2+含量，降低GSH含量及 SLC7A11、GPX4、SLC40A1 表達，上調(diào)Transferrin表達，抑制Nrf2/HO-1通路有關。本研究可為NSCLC的輔助治療提供實驗依據(jù)。