方佳鈺，黃紅葉，王曉華，陳水金，江煜，陳樂(lè)春，張幻真，陳進(jìn)城，林志剛

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350100；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；3.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350003

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，是引起腹痛、腹瀉的臨床常見(jiàn)病之一，屬現(xiàn)代難治性疾病[1-2]。腹部推拿治療UC效果顯著，能改善腹瀉、便血、腹痛等癥狀，具有安全、無(wú)不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)[3-5]，但其作用機(jī)制尚不明確。研究表明，脊髓背角蛋白激酶B（AKT）能通過(guò)磷酸化調(diào)控UC發(fā)生發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察腹部推拿對(duì)UC 模型大鼠腸道炎癥及脊髓背角AKT、p-AKT表達(dá)的影響，探討腹部推拿治療UC的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量150～160 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度45%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理原則，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（FJTCM IACUC 2021046）。

1.2 主要試劑與儀器

AKT抗體、p-AKT抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（南京Bioworld公司，貨號(hào)分別為BS1810、BS4007、BS13278），美沙拉嗪片（佳木斯鹿靈制藥有限公司，批號(hào)210907），HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)G1120）。自制大鼠腹部推拿固定器（專(zhuān)利號(hào)ZL201821139321.X），AVANTI J-15R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Tetra型垂直電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司），Gene Pulser Xcell型電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），Gel Doc EZ型成像及分析軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 分組及造模

大鼠單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、推拿組和美沙拉嗪組，正常組11只，其余每組13只。參照Poulsen[7]方法，采用5%葡聚糖硫酸鈉溶液（避光配制）自由飲用7 d誘導(dǎo)UC大鼠模型，正常組飲用蒸餾水。

1.4 干預(yù)

推拿組造模第2日開(kāi)始進(jìn)行腹部推拿干預(yù)，干預(yù)前將大鼠置于自制腹部推拿固定器10 min適應(yīng)環(huán)境。操作者左手置于腹部推拿固定器尾端，防止大鼠向后退離，右手食指進(jìn)行摩腹手法操作（見(jiàn)圖1），將食指指腹置于“關(guān)元”，按“關(guān)元-帶脈（右）-鳩尾-帶脈（左）”順序[8-9]做逆時(shí)針節(jié)律性推拿，頻率120次/min，每次10 min，每日1次，共15次。推拿結(jié)束后大鼠單獨(dú)靜置1 min。美沙拉嗪組造模第2日起予0.035 g/mL美沙拉嗪藥液灌胃，給藥體積2 mL/100 g，連續(xù)15 d。正常組和模型組大鼠俯臥位束縛于固定器中10 min，不予腹部推拿治療。

圖1 大鼠腹部推拿演示

1.5 一般狀況觀察

每日觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、糞便改變情況等。

1.6 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

第1、3、6、9、11、14、16日，參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分，包括體質(zhì)量減輕程度、糞便性狀、糞便隱血情況。DAI評(píng)分=（體質(zhì)量下降評(píng)分+糞便性狀評(píng)分+糞便隱血評(píng)分）÷3。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.7 HE染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹腔注射1.25 g/kg烏拉坦麻醉后，頸椎脫臼處死，取距肛門(mén)5～8 cm處結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗，置于10%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）后，常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

1.8 Western blot檢測(cè)

取脊髓背角，加入裂解液（組織∶裂解液=1∶12.5），冰上裂解30 min，超聲勻漿，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，分別加入AKT一抗（1∶500）、p-AKT 一抗（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜，加入HRP標(biāo)記二抗，常溫孵育1 h，采用ECL發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，用Image Lab軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腹部推拿對(duì)模型大鼠一般情況的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組大鼠因服用葡聚糖硫酸鈉溶液造模致長(zhǎng)期嚴(yán)重腹瀉死亡2只，美沙拉嗪組大鼠死亡2只，可能是美沙拉嗪的不良反應(yīng)導(dǎo)致，空白組和推拿組均無(wú)死亡。

正常組大鼠活潑喜動(dòng)，皮毛順滑光亮，形體勻稱(chēng)豐盈，大便為深褐色顆粒狀，無(wú)便隱血，肛周清潔，體質(zhì)量穩(wěn)步增加，狀態(tài)良好；模型組大鼠倦怠少動(dòng)，皮毛黯淡干枯，形體瘦削，縮背扎堆，糞便稀溏，可見(jiàn)膿血，肛周污穢黏膩，體質(zhì)量緩慢增長(zhǎng)甚至下降，狀態(tài)萎靡；推拿組大鼠整體狀態(tài)逐漸向好，皮毛光澤恢復(fù)，無(wú)膿血便，肛周較清潔，活躍多動(dòng)；美沙拉嗪組大鼠狀態(tài)逐漸恢復(fù)，皮毛光澤度有所改善，但毛發(fā)顏色整體發(fā)黃。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠一般情況示例

2.2 腹部推拿對(duì)模型大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分的影響

與正常組比較，模型組大鼠第3日起DAI評(píng)分明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，推拿組和美沙拉嗪組大鼠第9日起DAI評(píng)分明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠DAI評(píng)分比較（，分）

表2 各組大鼠DAI評(píng)分比較（，分）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3 腹部推拿對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞完整、排列整齊，杯狀細(xì)胞豐富，無(wú)充血、水腫，腺體結(jié)構(gòu)完整，無(wú)潰瘍形成，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞破損、排列紊亂，黏膜充血、水腫，腺體破壞，杯狀細(xì)胞明顯減少，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域有潰瘍形成，部分出現(xiàn)增厚黏連，腸管變形；推拿組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織病變有不同程度改善，黏膜上皮損傷有所修復(fù)，充血、水腫明顯減輕，腺體、杯狀細(xì)胞增多，排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色，×100）

2.4 腹部推拿對(duì)模型大鼠脊髓背角蛋白激酶B 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，推拿組和美沙拉嗪組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。各組大鼠AKT蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白免疫印跡

圖5 各組大鼠脊髓背角AKT、p-AKT蛋白表達(dá)比較（，每組6只）

3 討論

UC 屬中醫(yī)學(xué)“腸澼”“泄瀉”“痢疾”等范疇。《素問(wèn)·太陰陽(yáng)明論篇》有“食飲不節(jié)，起居不時(shí)者，陰受之……陰受之則入五藏……入五藏則?滿(mǎn)閉塞，下為飧泄，久為腸澼”，指出UC的主要病因是飲食沒(méi)有節(jié)制，作息不規(guī)律。中醫(yī)認(rèn)為，中焦為人體氣機(jī)樞紐，是后天之本。中焦氣機(jī)通暢，升清降濁，則上下臟腑得以溝通，人體得以康健，正氣存內(nèi)，邪不可干[11]。本實(shí)驗(yàn)采用腹部推拿手法主要為水平方向的腹部摩法，《摩腹運(yùn)氣圖考》記載：“摩腹之法，能通和上下，分理陰陽(yáng)，去舊生新，補(bǔ)不足，瀉有余?！笨梢?jiàn)摩腹具有清腸溫中補(bǔ)虛的作用，通過(guò)該手法的調(diào)理，能達(dá)到通腑瀉濁的目的。目前，推拿已應(yīng)用于UC的治療，能有效改善患者腹瀉、腹痛癥狀[3]。

本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，以腹部推拿為干預(yù)手法。臨床腹部推拿多以掌面為干預(yù)接觸面，但因大鼠身體和肢爪較小，故本實(shí)驗(yàn)在干預(yù)時(shí)以食指指腹模擬臨床，便于進(jìn)行推拿手法的操作。

DAI評(píng)分結(jié)果顯示，腹部推拿能有效改善UC模型大鼠腹瀉、便血等癥狀，表明腹部推拿手法對(duì)模型大鼠已受損的腸道功能有一定恢復(fù)作用。且推拿組DAI評(píng)分與美沙拉嗪組無(wú)顯著差異。在大鼠飼養(yǎng)和糞便采集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，美沙拉嗪組大鼠毛發(fā)發(fā)黃，進(jìn)行便隱血試紙檢測(cè)時(shí)試紙出現(xiàn)棕褐色黃染情況，可能是美沙拉嗪藥物的不良反應(yīng)所致。且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中推拿組大鼠無(wú)死亡情況，美沙拉嗪組大鼠有2只死亡，可見(jiàn)腹部推拿具有安全、無(wú)不良反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)。HE染色結(jié)果也顯示，模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞破損，黏膜充血、水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及潰瘍形成。推拿組大鼠結(jié)腸黏膜損傷明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少，說(shuō)明腹部推拿治療能改善大鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷。

當(dāng)結(jié)腸受到炎癥刺激時(shí)，脊髓內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、P物質(zhì)等從初級(jí)傳入神經(jīng)元集中釋放到脊髓背角，并與各自受體結(jié)合，促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感[12]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，可通過(guò)催化自身絲氨酸473（Ser473）和蘇氨酸（Thr308）位點(diǎn)的磷酸化而被激活，只有在這2個(gè)位點(diǎn)磷酸化后，AKT才能被充分激活[13]。研究發(fā)現(xiàn)，AKT活化與UC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，電針能通過(guò)抑制AKT磷酸化緩解UC大鼠腸道癥狀[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎癥發(fā)生后，脊髓背角AKT被激活，從而介導(dǎo)后續(xù)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展[6]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高，與上述研究結(jié)果[6]一致。經(jīng)腹部推拿干預(yù)后，脊髓背角p-AKT蛋白表達(dá)明顯降低，表明腹部推拿能抑制模型大鼠脊髓背角AKT磷酸化，從而減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

綜上，腹部推拿能改善UC模型大鼠腹瀉、便血等腸道炎癥癥狀，并可能通過(guò)抑制脊髓背角AKT磷酸化發(fā)揮抑制腸道炎癥作用，其通過(guò)哪些途徑調(diào)控AKT及具體作用靶點(diǎn)有待后續(xù)進(jìn)一步研究。