劉檢，藺曉源，趙洪慶，楊蕙，周梓洋，劉平安，3，王宇紅，4

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)國內(nèi)一流建設(shè)學(xué)科，湖南 長沙 410208；4.抑郁類疾病中醫(yī)藥防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙410208

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的慢性自身免疫性疾病，臨床主要表現(xiàn)為晨僵、滑膜炎、對稱性關(guān)節(jié)腫痛[1]。RA所致軀體損傷、生理功能受限等反應(yīng)會導(dǎo)致患者產(chǎn)生精神癥狀，其中以抑郁最為常見。中國大陸RA發(fā)病率為0.42%，患者人數(shù)約500 萬[2]，其中40%～60%伴有不同程度的抑郁癥狀[3-4]。RA 伴抑郁癥（rheumatoid arthritis accompanied by depression，RAD）發(fā)病隱匿，病情反復(fù)，嚴重影響患者生活質(zhì)量和身心健康，故研究RAD的發(fā)病機制及防治藥物具有重要意義。

目前RAD發(fā)病機制尚未明確。研究顯示，RA狀態(tài)下，外周炎性因子水平升高，血腦屏障被破壞，炎性因子進入中樞后，通過FKN/CX3CR1信號通路導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞異?；罨?，損傷海馬神經(jīng)元，進而誘發(fā)抑郁[5-7]。RAD屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“郁證”范疇，為虛實夾雜之證，具有“虛、瘀、郁”的病機特點。課題組立補腎祛寒、活血通絡(luò)、疏肝解郁治法，擬壯骨止痛解郁方。前期研究發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛解郁方能明顯改善RAD 模型大鼠抑郁癥狀，其機制可能與調(diào)節(jié)FKN/CX3CR1信號通路有關(guān)[8]，但具體機制仍有待闡明。因此，本研究建立細胞共培養(yǎng)體系并模擬RAD環(huán)境的體外細胞模型，基于FKN/CX3CR1信號通路進一步探討壯骨止痛解郁方防治RAD的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠3只，受孕16～18 d；SPF級SD大鼠4只，雌雄各半，新生3～4 d；SD大鼠8只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批（HN-ZYFY-2021-12-10）。

1.2 細胞

大鼠滑膜細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CP-R083。大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞，武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號RAT-CELL-0039。

1.3 藥物

壯骨止痛解郁方（補骨脂15 g，淫羊藿10 g，枸杞子15 g，女貞子15 g，狗脊10 g，骨碎補10 g，姜黃10 g，川牛膝10 g，貫葉連翹15 g，人參10 g、柴胡10 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。按前期方法[9-10]制備壯骨止痛解郁方含藥血清，分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、B27、GlutaMAX，美國Gibco 公司，批號分別為2176377、2186948、2283823、3 140584；趨化因子C-X3-C-基元受體1（CX3CR1）阻斷劑AZD8797，美國MCE公司，貨號HY-13848；閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）、腺苷A2A受體（A2AR）、CX3CR1抗體，美國Affinity 公司，貨號分別為AF5145、DF7504、DF6482、DF2325；谷氨酸受體2A（NR2A）、谷氨酸受體2B（NR2B）抗體，美國Proteintech公司，貨號分別為28525-1-AP、21920-1-AP；腫瘤壞死因子（TNF）-α、類風(fēng)濕因子（RF）、趨化因子Fractalkine（FKN）ELISA 試劑盒，江蘇菲亞公司，貨號分別為FY3056-A、FY3768-A、FY10176-A。二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，型號HERAce112401），細胞成像分析系統(tǒng)（廣州明美科技有限公司，型號MSX），細胞電阻儀（美國Millipore公司，型號ERS-2），超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司，型號LSM800）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取受孕16～18 d的SD大鼠，戊巴比妥鈉麻醉，取胎鼠，參照文獻[11]方法分離胎鼠海馬組織，經(jīng)消化、離心后，用無血清培養(yǎng)基（含96%神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、2%B27、1%GlutaMAX和1%雙抗）重懸，將細胞接種至24孔培養(yǎng)板中，每隔3 d半量換液，備用。同時參照課題組前期方法[12]培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細胞，備用。

2.2 造模、分組及給藥

大鼠滑膜細胞用含10%FBS、1%雙抗的滑膜細胞培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，按1×105個/mL接種至6孔板，每孔1.5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將細胞分為正常組、模型組、CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組。除正常組外，其余3組予1 μg/mL脂多糖（LPS）誘導(dǎo)炎癥模型，CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組造模同時分別加入1 μmol/L AZD8797和10%壯骨止痛解郁方含藥血清，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集模型組細胞培養(yǎng)液，1 500 r/min離心10 min，上清液置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

為探索RAD環(huán)境對小膠質(zhì)細胞和海馬神經(jīng)元的影響，參照文獻[13]，采用Transwell共培養(yǎng)法，將腦微血管內(nèi)皮細胞接種至小室內(nèi)側(cè)，原代小膠質(zhì)細胞接種至小室外側(cè)，海馬神經(jīng)元接種至6孔板底部，將小室置于接種神經(jīng)元的6孔板中構(gòu)建共培養(yǎng)體系（見圖1），設(shè)正常組、模型組、CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組，除正常組外，其余3組采用模型組滑膜細胞上清液聯(lián)合100 μmol/L 皮質(zhì)酮加入小室內(nèi)側(cè)干預(yù)24 h，CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組造模同時分別加入1 μmol/LAZD8797和10%壯骨止痛解郁方含藥血清，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

圖1 RAD環(huán)境下體外共培養(yǎng)體系模擬

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察

各組細胞經(jīng)造模及藥物處理后，采用細胞成像分析系統(tǒng)分別觀察滑膜細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞及海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

2.3.2 細胞因子檢測

收集各組滑膜細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心5 min，取上清液，參照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、RF和FKN含量。

2.3.3 跨內(nèi)皮細胞電阻檢測

共培養(yǎng)體系經(jīng)造模及藥物處理24 h后，采用電阻儀測量電阻，計算跨內(nèi)皮細胞電阻（TEER）。嚴格按儀器說明書操作，每個小室測量3次，并計算平均值。TEER=（測量電阻值-空白電阻值）÷有效膜面積。

2.3.4 免疫熒光染色

共培養(yǎng)體系經(jīng)造模及藥物處理24 h后，采用4%細胞固定液固定30 min，0.25%TritonX-100通透15 min，5%BSA封閉30 min，腦微血管內(nèi)皮細胞加入兔抗大鼠Occludin、ZO-1一抗（均為1∶100），小膠質(zhì)細胞加入兔抗大鼠CX3CR1、A2AR一抗（均為1∶100），海馬神經(jīng)元加入兔抗大鼠NR2A、NR2B一抗（均為1∶100），4 ℃避光孵育過夜，預(yù)冷PBS洗滌5次，加入FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶200），37 ℃避光孵育30 min，預(yù)冷PBS洗滌4次，加入DAPI工作液，室溫避光孵育20 min，預(yù)冷PBS洗滌3次，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，計算熒光強度。

2.3.5 尼氏染色

共培養(yǎng)體系經(jīng)造模及藥物處理24 h后，棄去孔內(nèi)液體，預(yù)冷PBS潤洗2次，海馬神經(jīng)元用4%細胞固定液固定30 min，0.25%TritonX-100 通透15 min，加入FITC-FJB 工作液100 μL，4 ℃避光孵育1 h，棄去液體，預(yù)冷PBS潤洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察突觸可塑性變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 壯骨止痛解郁方對滑膜細胞、腦微血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞及海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響

模型組滑膜細胞明顯受損，細胞折光率降低，胞體裂解；壯骨止痛解郁方組滑膜細胞損傷減輕，細胞形態(tài)正常。模型組腦微血管內(nèi)皮細胞邊界模糊，典型“鋪路石樣”特征消失；壯骨止痛解郁方組腦微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)有所恢復(fù)，細胞結(jié)構(gòu)完整。模型組小膠質(zhì)細胞明顯激活，胞體增大，突起變短，細胞分支減少，呈阿米巴樣；壯骨止痛解郁方組小膠質(zhì)細胞激活減少，細胞分支明顯增多。模型組海馬神經(jīng)元樹突及樹突棘數(shù)量減少，突觸可塑性明顯損傷；壯骨止痛解郁方組海馬神經(jīng)元形態(tài)及突觸可塑性損傷均有不同程度減輕。見圖2～圖5。

圖2 各組滑膜細胞形態(tài)（×100）

圖3 各組腦微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)（×100）

圖4 各組小膠質(zhì)細胞形態(tài)（×100）

圖5 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)（×100）

3.2 壯骨止痛解郁方對滑膜細胞上清液腫瘤壞死因子α、類風(fēng)濕因子、趨化因子Fractalkine含量的影響

與正常組比較，模型組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN含量明顯增加（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，CX3CR1阻斷劑組和壯骨止痛解郁方組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN 含量明顯減少（P<0.01，P<0.05）。見表1。

表1 各組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN含量比較（）

表1 各組滑膜細胞上清液TNF-α、RF、FKN含量比較（）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.3 壯骨止痛解郁方對腦微血管內(nèi)皮細胞跨內(nèi)皮細胞電阻的影響

與正常組比較，模型組腦微血管內(nèi)皮細胞TEER明顯減小（P<0.01）；與模型組比較，壯骨止痛解郁方組腦微血管內(nèi)皮細胞TEER 明顯增大（P<0.01）。見表2。

表2 各組腦微血管內(nèi)皮細胞TEER比較（，Ω/cm2）

表2 各組腦微血管內(nèi)皮細胞TEER比較（，Ω/cm2）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3.4 壯骨止痛解郁方對腦微血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞及海馬神經(jīng)元蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組腦微血管內(nèi)皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，壯骨止痛解郁方組腦微血管內(nèi)皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見圖6、表3。

圖6 各組腦微血管內(nèi)皮細胞Occludin、ZO-1蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

表3 各組腦微血管內(nèi)皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達比較（，熒光強度）

表3 各組腦微血管內(nèi)皮細胞Occludin、ZO-1蛋白表達比較（，熒光強度）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

與正常組比較，模型組小膠質(zhì)細胞CX3CR1、A2AR 蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，CX3CR1 阻斷劑和壯骨止痛解郁方組小膠質(zhì)細胞CX3CR1、A2AR 蛋白表達明顯降低（P<0.01，P<0.05）。見圖7、表4。

圖7 各組小膠質(zhì)細胞CX3CR1、A2AR蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

表4 各組小膠質(zhì)細胞CX3CR1、A2AR蛋白表達比較（，熒光強度）

表4 各組小膠質(zhì)細胞CX3CR1、A2AR蛋白表達比較（，熒光強度）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

與正常組比較，模型組海馬神經(jīng)元NR2A、NR2B蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，CX3CR1阻斷劑和壯骨止痛解郁方組海馬神經(jīng)元NR2A、NR2B 表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖8、表5。

表5 各組海馬神經(jīng)元細胞NR2A、NR2B蛋白表達比較（，熒光強度）

表5 各組海馬神經(jīng)元細胞NR2A、NR2B蛋白表達比較（，熒光強度）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖8 各組海馬神經(jīng)元NR2A、NR2B蛋白陽性表達（免疫熒光染色，×200）

3.5 壯骨止痛解郁方對海馬神經(jīng)元突觸可塑性的影響

與正常組比較，模型組海馬神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量明顯減少，樹突和樹突棘分支斷裂，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)完整性降低；與模型組比較，CX3CR1阻斷劑和壯骨止痛解郁方組海馬神經(jīng)元尼氏小體數(shù)量明顯增多，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)豐富度提高，同時樹突和樹突棘分支斷裂情況明顯改善。見圖9。

圖9 各組海馬神經(jīng)元突觸可塑性比較（尼氏染色，×100）

4 討論

痹證有行痹、痛痹、著痹等分型，其關(guān)節(jié)腫大、僵硬、變形等癥狀與中醫(yī)學(xué)“尪痹”相符，為虛實夾雜之證?！蹲C治準(zhǔn)繩》有“痹病有風(fēng)、有濕、有寒、有熱……皆標(biāo)也；腎虛，其本也”。在腎虛基礎(chǔ)上，氣血不運、瘀血留滯為痹證的病理關(guān)鍵[14]。RA病機可用“虛、瘀”概括，多為腎虛血瘀。郁證病始在肝，與腦相關(guān)，若情志不遂，肝郁失疏，氣血運行不暢，則瘀結(jié)于內(nèi)，不得宣泄，上犯清竅，神明失用，發(fā)為抑郁，故郁證病機可用“瘀、郁”概括[15]。又肝腎同源，腎通于腦，尪痹之腎虛血瘀可致元神失養(yǎng)，產(chǎn)生郁證；郁證之肝郁氣滯又可加重尪痹之腎虛血瘀。故尪痹與郁證互為因果，相兼為病。本課題組基于RAD病機特點，立補腎祛寒、活血通絡(luò)、疏肝解郁治法，創(chuàng)壯骨止痛解郁方，該方以壯骨止痛方合百事樂方化裁而成[16-17]。方中補骨脂溫腎助陽為君；臣以淫羊藿助君藥溫補腎陽，又有強筋健骨之功，柴胡疏肝理氣，姜黃活血行氣，主治血瘀氣滯諸癥，狗脊補肝腎、強腰膝；佐以枸杞子、女貞子滋補肝腎陰精，助肝腎之陽化生，貫葉連翹活血解郁，骨碎補續(xù)傷止痛、通經(jīng)活絡(luò)，補中寓通，補而不滯；人參功善補氣、安神，用為佐藥；伍以川牛膝逐瘀通經(jīng)，且引藥下行增強藥效，為使藥。全方共奏補腎祛寒、活血通絡(luò)、疏肝解郁之效。

抑郁癥與免疫系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，抑郁癥能激活炎癥因子，加重RA患者疼痛，并進一步加重抑郁癥狀，形成惡性循環(huán)，從而影響疾病預(yù)后。在RA過程中，激活的T細胞可刺激巨噬細胞產(chǎn)生大量TNF-α等致炎因子，促使滑膜細胞過度增殖，進而損傷骨關(guān)節(jié)，還可促進RF、FKN產(chǎn)生[18]。臨床研究顯示，RA患者外周血和滑膜組織TNF-α、FKN含量明顯增加，腦微血管內(nèi)皮細胞RhoA表達上調(diào)，Claudin-5和Occludin表達下調(diào)，血腦屏障結(jié)構(gòu)受損、通透性增加，提示RA誘發(fā)的全身性慢性炎癥可破壞血腦屏障完整性，致使外周炎癥因子進入腦內(nèi)并對大腦進行免疫刺激，誘發(fā)中樞神經(jīng)炎癥[19]。FKN是一種趨化因子，其唯一受體CX3CR1是一種跨膜高親和力受體，可介導(dǎo)FKN黏附和遷移，主要位于單核巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞膜上。RA狀態(tài)下，高水平TNF-α破壞腦微血管內(nèi)皮細胞完整性，使血腦屏障通透性增加，同時外周FKN表達和釋放增加，大量外源性FKN進入腦內(nèi)。一方面，與小膠質(zhì)細胞膜上的CX3CR1結(jié)合后分泌腺苷，再與其受體A2AR結(jié)合，促進D-絲氨酸釋放，激活N-甲基-D-天冬氨酸并促進Ca2+流入神經(jīng)元細胞內(nèi)，抑制長時程增強，影響突觸可塑性[20-21]；另一方面，F(xiàn)KN可直接促進小膠質(zhì)細胞活化，放大炎癥反應(yīng)，造成海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能及突觸可塑性損傷，最終引發(fā)抑郁癥[22]。因此我們推測，F(xiàn)KN/CX3CR1信號通路在RAD過程中起“橋接”作用，通過外周和中樞免疫透過血腦屏障，將RAD疾病進展相關(guān)的滑膜細胞-腦微血管內(nèi)皮細胞-小膠質(zhì)細胞-海馬神經(jīng)元4種細胞串聯(lián)起來。

本研究結(jié)果顯示，壯骨止痛解郁方能有效改善大鼠滑膜細胞形態(tài)損傷，抑制細胞因子TNF-α、RF、FKN釋放，保護腦微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)，增加TEER，并上調(diào)腦微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)蛋白Occludin、ZO-1表達，提示壯骨止痛解郁方可能通過調(diào)節(jié)滑膜細胞FKN釋放，進而改善腦微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和屏障功能損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛解郁方和CX3CR1阻斷劑AZD8797均能顯著抑制小膠質(zhì)細胞過度激活，下調(diào)CX3CR1和A2AR蛋白表達，說明壯骨止痛解郁方可能通過調(diào)控CX3CR1這一關(guān)鍵靶點，進而抑制FKN 介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞異?；罨?。通過檢測CX3CR1下游信號發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛解郁方和CX3CR1阻斷劑AZD8797均能有效緩解海馬神經(jīng)元形態(tài)及突觸可塑性損傷，同時顯著下調(diào)突觸可塑性相關(guān)蛋白NR2A、NR2B表達，提示壯骨止痛解郁方可能通過調(diào)控FKN/CX3CR1信號通路改善海馬突觸可塑性損傷，進而發(fā)揮抗RAD作用。本實驗結(jié)果與前期動物實驗結(jié)果[8]一致，亦再次佐證壯骨止痛解郁方抗RAD作用可能與調(diào)節(jié)FKN/CX3CR1信號通路有關(guān)。

綜上所述，壯骨止痛解郁方能減少RA狀態(tài)下的滑膜細胞TNF-α、RF、FKN釋放，保護腦微血管屏障，抑制小膠質(zhì)細胞激活，通過抑制FKN/CX3CR1信號通路發(fā)揮對突觸可塑性損傷的保護作用，從而防治RAD。